毛建梅，周孟杰，蔡 燕

1.川北醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)系,四川南充 637007；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心,四川南充 637000

鮑曼不動(dòng)桿菌是導(dǎo)致醫(yī)院內(nèi)感染的常見(jiàn)革蘭陰性桿菌，其感染多發(fā)于重癥監(jiān)護(hù)室和神經(jīng)外科，以下呼吸道分泌物檢出率最高。有研究報(bào)道，多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(MDR-AB)、耐碳青霉烯類(lèi)鮑曼不動(dòng)桿菌(CR-AB)的檢出率超過(guò)60.00%，并且全耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(PDR-AB)檢出率達(dá)16.67%[1]。隨著經(jīng)驗(yàn)性抗菌藥物的使用，MDR-AB對(duì)臨床上常用的抗菌藥物，如青霉素類(lèi)、β-內(nèi)酰胺類(lèi)、碳青霉烯類(lèi)、喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥率為90.00%以上，對(duì)易導(dǎo)致不良反應(yīng)的氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物的耐藥率為54.50%[2]。近年來(lái)，隨著人們?cè)谥兴幙咕矫娴难芯坎粩嗌钊?，具有抗菌活性的中藥逐漸被報(bào)道，比如魚(yú)腥草的活性成分魚(yú)腥草素鈉(SH)已被證實(shí)對(duì)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌及結(jié)核分枝桿菌都有一定的抗菌作用，并且能增強(qiáng)阿奇霉素、氟康唑、紅霉素的抗菌活性[3-7]。本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SH對(duì)MDR-AB有一定的抑制作用，因此，本研究將在體外探討SH與阿米卡星(AMK)是否具有聯(lián)合抗菌作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 本實(shí)驗(yàn)所采用的10株MDR-AB菌株收集于川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院微生物室，其中6株來(lái)源于神經(jīng)外科，4株來(lái)源于重癥監(jiān)護(hù)室，均為痰液標(biāo)本。

1.2儀器與試劑 儀器：VITEK2全自動(dòng)微生物分析儀及AST-GN鑒定卡(法國(guó)生物梅里埃有限公司)，AST-GN16藥敏卡及配套藥敏紙片，臺(tái)式恒溫振蕩器(上海躍進(jìn)醫(yī)療)，DHP420電熱恒溫培養(yǎng)箱(重慶永恒實(shí)驗(yàn)儀器廠)，TECAN全波長(zhǎng)全自動(dòng)酶標(biāo)儀(型號(hào)M200PR0)。試劑及藥品：SH(10克/瓶，購(gòu)自西安開(kāi)來(lái)生物工程有限公司)，AMK注射液(0.2克/支，川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥房提供)，四甲基偶氮唑鹽(MTT，廣州賽國(guó)生物科技有限公司)，二甲基亞砜(DMSO，成都市科龍化工試劑廠)。培養(yǎng)基：水解酪蛋白(MH)肉湯培養(yǎng)基(海博生物技術(shù)有限公司),MH瓊脂培養(yǎng)基(海博生物技術(shù)有限公司)。

1.3方法

1.3.1菌株篩選 采用VITEK2全自動(dòng)微生物分析儀及AST-GN鑒定卡進(jìn)行細(xì)菌鑒定，采用AST-GN16藥敏卡及配套藥敏紙片進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。根據(jù)上述鑒定結(jié)果選擇10株對(duì)3類(lèi)及以上抗菌藥物(包括AMK、環(huán)丙沙星、亞胺培南、青霉素、頭孢他啶等)耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌。以ATCC19606作為質(zhì)控菌株。

1.3.2細(xì)菌復(fù)蘇及菌液稀釋 將收集的10株MDR-AB菌株用30%甘油保存于-80 ℃冰箱中。實(shí)驗(yàn)時(shí)取2 μL保存菌液接種于1 mL滅菌的MH肉湯培養(yǎng)基中，放置于37 ℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)過(guò)夜。次日觀察到MH肉湯培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁后，8 000 r/min離心3 min后倒掉上清液，加入1 mL的生理鹽水重懸細(xì)菌，用生理鹽水將菌液調(diào)成570 nm處吸光度值(A值)為1.0 (相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠞岫龋?×108cfu/mL)后再稀釋1 000倍備用。

1.3.3單用SH、AMK的最低抑菌濃度(MIC)值測(cè)定 (1)微量肉湯稀釋法：稱(chēng)取SH粉末，用MH肉湯配制為不同水平的SH溶液(4 500、4 000、3 500、3 000、2 500、2 000、1 500、1 000、500 μg/mL)，各取80 μL依次加入96孔板中。AMK原液100 mg/mL，用MH肉湯配制為不同水平的AMK溶液(81 920、40 960、20 480、10 240、5 120、2 560、1 280、640 μg/mL)，各取10 μL依次加入96孔板中。各對(duì)應(yīng)孔中加入10 μL菌液，用MH補(bǔ)足至100 μL。每個(gè)水平梯度均做3個(gè)孔，同時(shí)設(shè)置藥物對(duì)照孔(不加細(xì)菌)、陽(yáng)性對(duì)照孔(不加藥物)、陰性對(duì)照孔(只加MH培養(yǎng)基)。接種完后將96孔板置于37 ℃臺(tái)式恒溫振蕩器中培養(yǎng)8 h后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照孔細(xì)菌生長(zhǎng)且藥物對(duì)照孔和陰性對(duì)照孔均無(wú)菌生長(zhǎng)時(shí)，每孔加入10 μL的MTT(用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液配制，水平為5 mg/mL)，再次置于37 ℃臺(tái)式恒溫振蕩器中培養(yǎng)1 h，肉眼觀察培養(yǎng)孔中的顏色，黑色代表孔內(nèi)有菌落，以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度作為該藥物的MIC值。接著每孔加入100 μL的二甲基亞砜(DMSO)，振蕩搖勻10 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的A值并計(jì)算出各水平梯度的平均抑制率。(2)瓊脂稀釋法：SH瓊脂平板的終水平同微量肉湯稀釋法一致，取9支無(wú)菌試管，分別稱(chēng)取SH粉末溶于10 mL滅菌MH瓊脂中，混勻并倒置平板冷卻備用。取9支無(wú)菌試管依次加入AMK原液(100 mg/mL)1 638.4、819.2、409.6、204.8、102.4、51.2、25.6、12.8、6.4 μL，用滅菌MH瓊脂補(bǔ)齊至10 mL，混勻后倒置平板備用。取2 μL稀釋好的菌液依次點(diǎn)種于各瓊脂平板上，每株菌在各平板上接種2個(gè)點(diǎn)，37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，并在菌落中滴加5 μL的MTT以讀取該藥物的MIC值。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.4SH與AMK聯(lián)用的MIC值測(cè)定 (1)微量肉湯稀釋法：根據(jù)單藥測(cè)得的MIC值，SH以2倍MIC、AMK以1倍MIC為最高濃度，分別按倍比稀釋配制6個(gè)系列水平。取無(wú)菌的96孔板，按棋盤(pán)法設(shè)計(jì)將藥物兩兩組合加入各孔中(SH 80 μL、AMK 10 μL)，再加入10 μL菌液，并用MH肉湯補(bǔ)足至100 μL。(2)瓊脂稀釋法：根據(jù)單藥的MIC值，SH水平梯度設(shè)為MIC、1/2MIC、1/4MIC、0,AMK水平梯度設(shè)為MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC、0，分別配制兩種藥物各水平組合共28個(gè)瓊脂平板。其余操作方法同1.3.3，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。分別記錄最佳組合效應(yīng)時(shí)兩種藥物聯(lián)用時(shí)各自的MIC值及兩種藥物單用時(shí)的MIC值。計(jì)算出部分抑菌濃度指數(shù)(FICI)=MICSH聯(lián)合/MICSH單用+MICAMK聯(lián)合/MICAMK單用。判讀標(biāo)準(zhǔn)：FICI≤0.5為協(xié)同作用；0.52.0為拮抗作用[8]。

2 結(jié) 果

2.1單用SH、AMK的MIC值 微量肉湯稀釋法：10株MDR-AB及質(zhì)控菌株單用SH的MIC值為1 200～2 800 μg/mL，單用AMK的MIC值為8 192 μg/mL。瓊脂稀釋法：10株MDR-AB及質(zhì)控菌株單用SH的MIC值為2 400 μg/mL，單用AMK的MIC值為16 384 μg/mL。見(jiàn)表1。

2.2SH與AMK聯(lián)用的MIC值 結(jié)果顯示，SH與AMK聯(lián)用后AMK的MIC值降低至單用時(shí)的1/2，F(xiàn)ICI值均處于>0.5～1.0，表現(xiàn)出“相加”的抗菌作用。見(jiàn)表1。當(dāng)SH(MIC)單用時(shí)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，與AMK聯(lián)用時(shí)可見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)，表明SH與AMK聯(lián)用后可能存在促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)的作用。見(jiàn)圖1、2。此外，根據(jù)酶標(biāo)儀所測(cè)得SH(1/2 MIC)與AMK系列水平聯(lián)用后的A值計(jì)算出10株菌的平均抑制率，結(jié)果顯示，與單用AMK相比，SH與AMK(<1 024 μg/mL)聯(lián)用時(shí)的抑制率降低，SH與AMK(≥1 024 μg/mL)聯(lián)用時(shí)抑制率升高，且兩者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 SH、AMK單用及聯(lián)用時(shí)檢測(cè)MDR-AB的MIC值和FICI值

注：黑色代表有菌落生長(zhǎng)。

注：A、B、C、D、E、F、G均未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)，G為最佳抑菌濃度組合，F(xiàn)ICI=1/2+1/2=1。

表2 不同水平AMK單用及與SH(1/2 MIC)聯(lián)用時(shí)的平均抑制率比較

3 討 論

鮑曼不動(dòng)桿菌是導(dǎo)致醫(yī)院內(nèi)感染的主要革蘭陰性桿菌之一，可能與患者住院時(shí)間長(zhǎng)、接受侵入性操作及使用廣譜抗菌藥物有關(guān)。有關(guān)共識(shí)指出，針對(duì)MDR-AB感染可選用頭孢哌酮/舒巴坦、氨芐西林/舒巴坦、碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物,同時(shí)聯(lián)合氨基糖苷類(lèi)或喹諾酮類(lèi)抗菌藥物進(jìn)行治療[9]。隨著MDR-AB、CR-AB的檢出率逐漸升高，且對(duì)常用抗菌藥物呈高度耐藥性，多種藥物的聯(lián)用為鮑曼不動(dòng)桿菌的治療提供了新方案。AMK作為一種新型半合成氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物，常用于鮑曼不動(dòng)桿菌的治療，當(dāng)與其他抗菌藥物，如替加環(huán)素、頭孢哌酮鈉/舒巴坦聯(lián)用后的治療效果更佳[2,10]。

近年來(lái)，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)SH對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌等都具有一定的抑菌作用[5-7]，但對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌是否具有抑菌作用少有報(bào)道。本研究中10株MDR-AB對(duì)SH的MIC值為1 200～2 800 μg/mL，表明SH能夠在體外抑制MDR-AB，但是其單獨(dú)使用的抗菌活性相對(duì)較低。MDR-AB對(duì)AMK也表現(xiàn)出較高的耐藥性，與KUTI等[11]報(bào)道的結(jié)果一致，可見(jiàn)單用AMK對(duì)MDR-AB的治療效果欠佳。因此，本研究進(jìn)一步探討SH能否增強(qiáng)AMK的抗菌作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)SH與AMK聯(lián)用后表現(xiàn)出“相加”的抗菌作用。值得注意的是，從表2中可見(jiàn)SH與AMK(<1 024 μg/mL)聯(lián)用時(shí)的抑制率低于單用AMK，表明兩種藥物聯(lián)用后可能存在促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)的作用，導(dǎo)致上述現(xiàn)象的原因值得進(jìn)一步探討。

鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)AMK的耐藥機(jī)制包含以下幾點(diǎn)：(1)鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)生氨基糖苷類(lèi)修飾酶(AMEs)，編碼的相關(guān)基因大多位于質(zhì)粒轉(zhuǎn)座子上，導(dǎo)致耐藥基因在細(xì)菌間傳播，并通過(guò)上述酶修飾、改變氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物的活性，此為最主要的耐藥機(jī)制；(2)產(chǎn)生16S rRNA甲基化酶，能夠使細(xì)菌的30S rRNA亞單位上的16S rRNA位點(diǎn)甲基化，從而改變氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物的作用靶點(diǎn)；(3)外排泵作用，通過(guò)促進(jìn)藥物外排來(lái)降低細(xì)胞內(nèi)氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物的濃度；(4)影響細(xì)菌細(xì)胞膜，即通過(guò)減少脂多糖所帶的負(fù)電荷和下調(diào)孔蛋白的表達(dá)來(lái)阻止藥物進(jìn)入細(xì)胞[12]。目前報(bào)道SH主要是通過(guò)抑制細(xì)菌生物被膜的形成來(lái)達(dá)到抗菌作用[3-4]，但是較少見(jiàn)AMK影響細(xì)菌生物被膜的相關(guān)報(bào)道。AMK因使用劑量不同而表現(xiàn)出不同的耐藥機(jī)制的相關(guān)報(bào)道較少。本研究中，與單用AMK比較，SH與AMK聯(lián)用后的抑制率先降低后升高的具體機(jī)制仍不清楚，筆者認(rèn)為SH可能通過(guò)抑制細(xì)菌生物被膜、氨基糖苷類(lèi)修飾酶、16S rRNA甲基化酶、外排泵的表達(dá)來(lái)達(dá)到抗菌作用。因此，后續(xù)研究將進(jìn)一步對(duì)其抗菌機(jī)制深入探討。

綜上所述，SH能夠在體外抑制MDR-AB，與單用AMK相比，聯(lián)用后隨著AMK水平的升高其抗菌作用先降低后升高。因此，建議使用AMK治療的患者應(yīng)合理選擇食用魚(yú)腥草及相關(guān)制劑。