千年桐嫁接愈合過程解剖結(jié)構(gòu)與內(nèi)源激素的變化

藍(lán)金宣，梁文匯，黃曉露，楊卓穎，李寶財(cái)，馬錦林

（廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院 廣西特色經(jīng)濟(jì)林培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530002）

千年桐（Vernicia montana）又稱木油桐、皺果桐，為大戟科（Euphorbiaceae）油桐屬多年生落葉喬木，是我國(guó)特有的工業(yè)油料樹種，與油茶（Camellia oleif?era）、核桃（Juglans regia）和烏桕（Triadica sebifera）并稱為我國(guó)4 大木本油料植物［1-3］，主要分布于四川、湖南、廣西、廣東、云南、貴州、浙江、江西、福建和臺(tái)灣等地［4］。桐油含有60% ～80% 的桐酸，化學(xué)性質(zhì)活潑，能發(fā)生多種化學(xué)反應(yīng)，具有干燥快、附著力強(qiáng)、耐酸、耐堿及耐高溫等特點(diǎn)，是最適用于制造環(huán)保型油漆的生物基質(zhì)；桐油還具有優(yōu)質(zhì)的絕緣性能，廣泛用于各種電子芯片的浸漬處理，利用前景廣泛［5-8］。千年桐壽命長(zhǎng)、抗枯萎病能力強(qiáng)，適合在強(qiáng)酸性土壤環(huán)境中種植，但因其雌雄異株，結(jié)果較晚，常有一半左右的雄株終生不結(jié)果，導(dǎo)致單位面積產(chǎn)量不高［9］。如采用千年桐高產(chǎn)無性系嫁接苗造林，則可大大提高單位面積產(chǎn)量。

千年桐嫁接體愈合是嫁接苗培育的關(guān)鍵問題。大量研究表明，嫁接體愈合與砧穗內(nèi)部生化物質(zhì)含量有關(guān)，且內(nèi)源激素是影響嫁接口愈合的主要因素之一［10-13］。本研究通過對(duì)千年桐嫁接口愈合進(jìn)程進(jìn)行解剖觀察，全面了解嫁接愈合過程中的組織機(jī)理，判斷嫁接口愈合的關(guān)鍵時(shí)期，同時(shí)通過測(cè)定分析嫁接口結(jié)合部形成層及韌皮部?jī)?nèi)源激素的變化，探討激素含量對(duì)愈合的影響，為嫁接苗培育技術(shù)在生產(chǎn)上的推廣應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地設(shè)在廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院油桐山試驗(yàn)苗圃（108°56'E，22°56'N），海拔約80 m，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，年均氣溫21.7 ℃，≥10 ℃積溫為7 200 ℃，最低氣溫-1.5 ℃，最高氣溫40.4 ℃，全年無霜期達(dá)360 天，年均降水量1 300 mm，年均日照時(shí)長(zhǎng)1 550 h，年均相對(duì)濕度80%左右，干濕季節(jié)明顯，降雨主要集中在4—9月[14]。

1.2 試驗(yàn)材料

2019年10月16日，以1年生千年桐地苗作為砧木，選取成年優(yōu)樹上健壯的當(dāng)年生枝條作為穗條。取6 ～7 cm、含1 ～2個(gè)腋芽的莖段作為接穗，用切接法進(jìn)行嫁接，共嫁接1 000 株。采用完全隨機(jī)方法對(duì)成活的植株進(jìn)行取樣，嫁接后第5 天開始，每2 天取1 次樣，共8 次；第20 ～55 天，每3 天取1 次樣，共12 次，每次各取15 株，其中3 株截取1.0 ～1.5 cm 的嫁接口莖段放入FAA 固定液中固定，取樣完成后統(tǒng)一切片，剩余12 株將嫁接口莖段皮部（包括愈傷組織）一起剝出，將剝出的部分經(jīng)液氮冷凍后，放入-80 ℃冰箱保存，取樣完成后統(tǒng)一測(cè)定內(nèi)源激素含量。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 嫁接口切片

將樣品從固定液中取出，在通風(fēng)櫥內(nèi)用手術(shù)刀修剪嫁接口莖段的組織，將修切好的樣品和對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽放入脫水盒，將脫水盒放入脫水機(jī)，用不同濃度乙醇對(duì)樣品進(jìn)行脫水，乙醇的濃度為60%、70%、80%、90%、95%、100%和100%。用甲基丙烯酸甲酯浸塑，經(jīng)過3 次浸塑后，入包埋液抽真空，再用MMA 包埋、聚合。采用萊卡Histo Cut 全自動(dòng)切片機(jī)切片，50%乙醇貼片，過夜烤片。依次將切片放入乙二醇乙醚乙酸酯Ⅰ中，在37 ℃條件下浸泡6 h，后放入乙二醇乙醚乙酸酯Ⅱ中，在37 ℃條件下浸泡過夜，再放入乙二醇乙醚乙酸酯Ⅲ中，在室溫下浸泡10 ～15 min，接著放入乙二醇乙醚乙酸酯Ⅳ中，在室溫下浸泡10 ～15 min，隨后依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇和80%乙醇中各浸泡10 min，最后用自來水清洗。切片入番紅染液中染色3 ～5 s，自來水稍洗，洗去多余染料即可。依次放入50%、70%和80%梯度酒精中各3 ～8 s 進(jìn)行脫色。放入固綠染液中染色4 ～6 s，無水乙醇三缸脫水。放入干凈的二甲苯透明5 min，中性樹膠封片。

1.3.2 內(nèi)源激素測(cè)定

稱取樣品各1 g，冰浴下研磨成粉，裝入10 mL離心管中，放入-80 ℃冰箱中保存。待全部采集完成后，干冰冷凍條件下寄往中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定吲哚乙酸（IAA）、脫落酸（ABA）、赤酶素（GA3）和玉米核苷（ZR）的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 和SPSS 17.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 嫁接口愈合過程中的結(jié)構(gòu)變化

嫁接口愈合過程經(jīng)歷了5 個(gè)階段，分別是隔離層形成期、愈傷組織分化形成期、愈傷組織連接期、形成層分化連接期和維管組織分化形成期。

嫁接后第5天，傷口發(fā)生愈傷反應(yīng)，可觀察到一些褐色的壞死組織，即隔離層（圖1）。這些壞死組織在嫁接早期可防止水分過度蒸發(fā)并保護(hù)傷口不受外物侵染。

圖1 隔離層形成期橫切圖Fig.1 Transverse section on formation stage of isolation layer

嫁接后第7 天，砧木和接穗傷口附近形成不規(guī)則多邊形的薄壁細(xì)胞，即愈傷組織（圖2a）。嫁接后第9天，這些不規(guī)則多邊形的薄壁細(xì)胞逐漸增加，砧木和接穗產(chǎn)生的愈傷組織共同填充接縫（圖2b）。

圖2 愈傷組織分化形成期橫切圖Fig.2 Transverse section on formation stage of callus differentiation

嫁接后第11 ～15天，由于愈傷組織不斷分化積累，基本填滿了砧木和接穗間的連接處，使兩者的愈傷組織連為一體，形成砧穗連接的愈傷組織橋（圖3a ～c）。愈傷組織橋在維管束形成前的嫁接初期，是砧木向穗條提供水分和營(yíng)養(yǎng)的主要通道。

圖3 愈傷組織連接期橫切圖Fig.3 Transverse section on callus connection stage

嫁接后第17 ～22天，砧木形成層向內(nèi)分化出4 ～5 層木質(zhì)部細(xì)胞，砧木形成層附近的薄壁細(xì)胞不斷分化出新的形成層，穿過愈傷組織，連接砧穗形成層，形成完整的形成層帶（圖4a ～c）。連接完整形成層帶的結(jié)構(gòu)為扭曲帶狀。

圖4 形成層分化形成期橫切圖Fig.4 Transverse section on the cambium differentiation and formation stage

嫁接后第25 天，連接完成的形成層帶繼續(xù)分化，向內(nèi)分生出木質(zhì)部，且在連接處可觀察到新生導(dǎo)管形成（圖5a）。嫁接后第31天，砧穗形成層和兩者連接處形成層分化出較多的木質(zhì)部，導(dǎo)管清晰可見（圖5b）。嫁接后第34天，明顯看到形成層向內(nèi)分化形成更多的木質(zhì)部且內(nèi)含導(dǎo)管，向外分化出韌皮部，形成篩管（圖5c），砧穗完整地連為一體。砧木和穗條可通過新形成的維管組織恢復(fù)對(duì)穗條水分和營(yíng)養(yǎng)的供應(yīng)，這是嫁接成活至關(guān)重要的時(shí)期。嫁接后第37天、第52天及第55天，木質(zhì)部已形成（圖5d ～f）。

圖5 維管組織分化形成期橫切圖Fig.5 Transverse section on vascular tissue differentiation and formation stage

2.2 嫁接口愈合進(jìn)程中內(nèi)源激素的變化

2.2.1 嫁接口愈合過程中IAA和ABA含量的變化

IAA 含量在嫁接后第7、15、19、28、37、49 天處于谷值，在第28 天最低（12.64 ng/g）；在嫁接后第13、17、25、34、43 天處于峰值，在第17天最高（78.95 ng/g）（圖6）。

圖6 千年桐嫁接愈合過程中IAA和ABA含量的變化Fig.6 Changes of contents of IAA and ABA in V.montana in graft healing

ABA 含量在嫁接后第7、15、19、28、37、49 天處于谷值，在第28 天最低（22.55 ng/g），這與IAA 含量的最低值出現(xiàn)的日期一致；在嫁接后第11、17、25、34、43 天處于峰值。

2.2.2 嫁接口愈合進(jìn)程中GA3和ZR含量的變化

GA3含量在嫁接后第7、15、19、28、37 天處于谷值，在第28 天最低（2.33 ng/g）；在嫁接后第11、17、22、34、46 天處于峰值（圖7）。第40 ～55 天，GA3含量為12.15 ～16.10 ng/g，處于相對(duì)較高值。

圖7 千年桐嫁接愈合過程中GA3和ZR含量的變化Fig.7 Changes of contents of GA3 and ZR in V.montana in graft healing

ZR 含量在嫁接后第7、11、19、28、37、46 天處于谷值，在第19 天最低（6.10 ng/g），其次是第28 天（6.45 ng/g）；在嫁接后第9、13、25、43 天處于峰值。第28 ～37天，ZR含量持續(xù)較低（6.45 ～8.19 ng/g）。

3 結(jié)論與討論

不同研究者對(duì)嫁接愈合階段的劃分不同，但愈合過程都會(huì)經(jīng)歷隔離層形成、愈傷組織形成、形成層分化及維管輸導(dǎo)組織形成等階段，兗攀等［15］將美國(guó)山核桃（Carya illinoinensis）嫁接愈合過程分為4個(gè)階段，蘇文川［11］將薄殼山核桃嫁接愈合過程分為5 個(gè)階段。嫁接愈合所需的時(shí)間會(huì)因植物種類、年齡、嫁接時(shí)期和嫁接部位的不同而不同，美國(guó)山核桃嫁接后第30 天砧穗結(jié)合成一體［15］，油茶（Camel?lia oleifera）芽苗砧嫁接后第35 天可形成維管束橋［10］，黃瓜（Cucumis sativus）苗嫁接后第12 天愈合部位形成新的維管束［16］。本研究中千年桐嫁接愈合過程分為5 個(gè)階段，即隔離層期（第1 ～5 天）、愈傷組織分化形成期（第5 ～9 天）、愈傷組織連接期（第9 ～17 天）、形成層分化連接期（第17 ～25 天）和維管組織分化連接期（第25 ～34 天）。嫁接后前9天是決定嫁接體能否形成的關(guān)鍵期，這與凌麓山等［9］的研究結(jié)果一致；前34 天是千年桐嫁接苗成活的重要時(shí)期。

植物內(nèi)源激素是其嫁接體發(fā)育的控制因子之一[12-13,17]。IAA 含量在嫁接后第13、17、25、34 和43 天處于峰值，在第17 天最高；ABA 含量在嫁接后第11、25、34 和43 天處于峰值；GA3含量在嫁接后第11、17、22、34 和46 天處于峰值；ZR 含量在嫁接后第9、13、25 和43 天處于峰值。IAA、ABA、GA3和ZR 的含量在嫁接后第7、19、28 和37 天均處于谷值，IAA、ABA 和GA3的含量在嫁接后第28天均最低。

千年桐嫁接愈合過程中內(nèi)源激素IAA、ABA、GA3和ZR 隨著嫁接進(jìn)程呈起伏變化，大體呈“W”型。嫁接后第25 天，IAA 及ZR 含量處于峰值，有利于誘導(dǎo)韌皮部和木質(zhì)部的分化，形成維管組織。這與馮金玲等［10］、盧善發(fā)等［17］、Yin等［18］及孟慶偉等［19］的研究結(jié)果相似。嫁接后第5 ～7天，ABA含量呈下降趨勢(shì)，有可能是傷口多酚抑制的結(jié)果，這與馮金玲［20］的研究結(jié)果相似；之后，ABA 含量的變化趨勢(shì)與IAA大體一致，均是在嫁接的關(guān)鍵階段含量較高，說明ABA 對(duì)嫁接口的發(fā)育可能有促進(jìn)作用，因?yàn)锳BA 含量上升是纖維次生壁發(fā)育的起始信號(hào)［21］。因此，在嫁接的特定階段，適當(dāng)使用相應(yīng)的激素有利于提高嫁接成活率。

本試驗(yàn)只針對(duì)千年桐嫁接苗結(jié)合部位的4種內(nèi)源激素的變化進(jìn)行分析，各類激素的互作關(guān)系尚未清晰，同時(shí)生理指標(biāo)對(duì)千年桐嫁接成活的影響也尚未明了，有待進(jìn)一步的研究。