王 陳，石 童，陳學(xué)軍，張瑞華，李麗琴

（國民核生化災(zāi)害防護(hù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102205）

納曲酮主要作為阿片類毒品依賴者脫毒后預(yù)防復(fù)吸的輔助藥物［1-2］，最近也被用于治療酒精成癮［3-4］。目前上市產(chǎn)品僅有片劑，由于首過效應(yīng)嚴(yán)重，口服生物利用度低（5%～40%），需要多次服藥，患者依從性差，造成在抗復(fù)吸治療中的脫失率較高。因此，為提高患者的使用依從性，減少服藥次數(shù)，國內(nèi)外研究者致力于開發(fā)多種長效制劑。一方面開發(fā)多種納曲酮給藥系統(tǒng)，包括透皮制劑、微針給藥系統(tǒng)、微球植入制劑、口服緩釋制劑等［5-6］；另一方面，利用納曲酮存在活性羥基的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，開展酯化前體藥物研究［7-13］，以提高生物利用度。國內(nèi)外已有文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chro?matography-tandem mass spectroscopy，LC-MS/MS）開展納曲酮的藥動(dòng)學(xué)研究［14-17］。本研究建立了血漿用量少、靈敏度更高的方法，對(duì)納曲酮-3-O-辛酸酯在兔體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行研究，并與納曲酮原型藥物的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行差異性比較，為該化合物的實(shí)際應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

鹽酸納洛酮（批號(hào)：112K0747）和色譜純甲醇（批號(hào)：WXBB0253V），美國Sigma公司；納曲酮和納曲酮-3-O-辛酸酯（純度＞99%），防化研究院合成，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。色譜純甲酸（批號(hào)：4022536003719），德國Merck公司；分析純甲基叔丁基醚（批號(hào)：20130518），天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；分析純氫氧化鈉（批號(hào)：20130822），北京化工廠。Agilent 1200/6410 LC/QQQ系統(tǒng)，美國安捷倫公司；Genie Vortex-2型渦旋振蕩器，美國Scientific Industries公司；Sigma 1-14高速離心機(jī)，德國Sigma公司；N-EVAP型氮吹儀，美國Organonation Asso?ciates公司；DT5-4B型低速臺(tái)式離心機(jī)，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司。

Fig.1 Chemical structures of naltrexone（NTX），naloxone and naltrexone-3-O-caprylate.

1.2 動(dòng)物

12只新西蘭大耳白兔，體重2.0～2.5 kg，成年，雌雄各半，由北京金牧陽實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司提供，合格證號(hào)為SCXK（京）2015-0005。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（軍）2012-0017。飼養(yǎng)條件：溫度保持在21～23℃，濕度保持在45%～75%，自由攝食飲水。本研究的動(dòng)物使用方案獲防化研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 給藥方案和樣品采集

選用新西蘭大耳白兔，雌雄各半，隨機(jī)分成2組，每組6只，分別im給予納曲酮1 mg·kg-1或納曲酮-3-O-辛酸酯1.2 mg·kg-（1與納曲酮1 mg·kg-1等摩爾劑量）。各組動(dòng)物給藥前及給藥后（納曲酮組：2.5，5，10，20，30，40，60，90，120，150 和240 min；納曲酮3-O-辛酸酯組：5，15，30，60，120，240，360，480，600，720和1440 min）分別耳緣靜脈取血0.3 mL，置于加有抗凝劑的塑料離心管中，30 min后166×g離心10 min取血漿，-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 LC-MS/MS檢測條件

LC條件：色譜柱：Aglient Zorbax SB-C18（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：甲醇/0.1%甲酸水（50∶50）；流速：0.2 m L·min-1；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：5 μL。

MS/MS條件：ESI源，正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式：納曲酮（342.1→324.1），內(nèi)標(biāo)納洛酮（328.1→310.0），F(xiàn)ragmentor電壓135 V，干燥氣溫度300℃，干燥氣流速12 L·min-1，毛細(xì)管電壓5 kV，Delta EMV為200 V。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密稱取鹽酸納曲酮溶于甲醇，配成1 g·L-1（游離堿計(jì)）儲(chǔ)備液。該儲(chǔ)備液用甲醇/水（50∶50）分別稀釋成10，20，40，100，200，400，1000和2000 μg·L-1濃度系列的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品鹽酸納洛酮適量，用甲醇溶解后得到1 g·L-1（游離堿計(jì)）內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液，用甲醇/水（50∶50）稀釋成200 μg·L-1，作為內(nèi)標(biāo)溶液。取100 μL空白兔血漿，加入5 μL標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，得到濃度分別為0.5，1，2，5，10，20，50和100 μg·L-1的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。質(zhì)控工作液（quality control，QC）同樣稀釋配制，納曲酮濃度分別為0.8，10和80 μg·L-1，定量限溶液配置為0.5 μg·L-1。

1.6 血漿樣品預(yù)處理

取兔血漿0.1 mL置于10 mL具塞玻璃試管中，加入5 μL甲醇/水（50∶50）（標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和質(zhì)控樣品不加）、內(nèi)標(biāo)納洛酮（200 μg·L-1）5 μL、0.1 mol·L-1NaOH溶液10 μL，渦旋振蕩20 s后，加甲基叔丁基醚2 mL，渦旋振蕩2 min，于400×g離心10 min，分取有機(jī)層1.6 mL，在50℃條件下氮吹儀吹干。殘留物用流動(dòng)相100 μL溶解，10 625×g離心10 min，分取上清75 μL，取 5 μL進(jìn)樣。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

血漿樣品預(yù)處理后經(jīng)LC-MS/MS檢測，所得的血藥濃度數(shù)據(jù)經(jīng)PKS V1.0軟件（上海宏能軟件有限公司）處理，采用非房室模型計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。數(shù)據(jù)以±s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜條件的確定和優(yōu)化

納曲酮和內(nèi)標(biāo)納洛酮在ESI正離子電離方式下，主要生成準(zhǔn)分子離子峰［M+H］+峰，分別為m/z 342和m/z 328，選擇性對(duì)［M+H］+峰進(jìn)行產(chǎn)物離子全掃描分析，納曲酮和內(nèi)標(biāo)納洛酮生成的主要碎片離子分別為m/z 324和m/z 310（圖2），將其作為定量分析監(jiān)測的產(chǎn)物離子，并進(jìn)一步采用儀器自帶的二級(jí)優(yōu)化程序進(jìn)行優(yōu)化，最終優(yōu)化碰撞能量分別為18 eV和20 eV。

Fig.2 Product ion spectra of［M+H］+of naltrexone（A）and naloxone（B）.

2.2 分析方法驗(yàn)證

2.2.1 專屬性

在優(yōu)化后的LC-MS/MS條件下，空白血漿樣品、定量下限樣品（lower limit of quantification，LLOQ）和兔im給藥后的血漿樣品色譜圖見圖3。研究結(jié)果表明，納曲酮和內(nèi)標(biāo)納洛酮的保留時(shí)間分別為1.45和1.35 min，空白血漿中的內(nèi)源性成分在目標(biāo)成分的出峰位置無干擾。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限

以每個(gè)待測物濃度為橫坐標(biāo)，待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，采用1/x加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，5 d內(nèi)完成5條標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定。平均標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=（0.1987±0.0022）x+（0.0881± 0.0117）（n=5）。5條標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.5～100 μg·L-1范圍內(nèi)均顯示良好的線性（r2＞0.999）。新配LLOQ（0.5 μg·L-1）濃度點(diǎn)樣品進(jìn)行定量下限的考察，每天測定5份樣品，連續(xù)3 d，計(jì)算批間和批內(nèi)的準(zhǔn)確度和精密度。在LLOQ濃度下，批間和批內(nèi)準(zhǔn)確度為109.5%和108.1%，RSD分別為3.2%和5.2%。

2.2.3 稀釋效應(yīng)

對(duì)于超出線性范圍的血漿樣品，用空白血漿樣品稀釋10倍后進(jìn)行重新測定，通過稀釋效應(yīng)進(jìn)行考察。配制800 μg·L-1的血漿樣品（n=3），用空白血漿稀釋10倍后，按1.6方法進(jìn)行操作。根據(jù)隨行標(biāo)曲計(jì)算樣品的實(shí)測濃度平均值為81.4 μg·L-1，準(zhǔn)確度為101.8%，RSD為2.4%。表明采用空白血漿對(duì)高濃度樣品進(jìn)行稀釋，對(duì)測定結(jié)果基本無影響。

2.2.4 基質(zhì)效應(yīng)和回收率

取0.8，10和80μg·L-13個(gè)濃度的質(zhì)控樣品（n=6），按1.6方法進(jìn)行操作，進(jìn)行LC-MS/MS分析后所得的峰面積為A。取來源于不同兔的空白血漿0.1 mL，按1.6方法進(jìn)行操作，殘留物分別用100 μL濃度分別為0.8，10和80 μg·L-1的納曲酮溶液（均含內(nèi)標(biāo)納洛酮10 μg·L-1）復(fù)溶，進(jìn)行LC-MS/MS分析后所得的峰面積為B；取0.1×10-3L的水代替空白血漿，按1.6方法處理，所得的峰面積為C?；厥章剩?）=A/B×100%，基質(zhì)效應(yīng)（%）=B/C×100%。

Fig.3 Representative multiple reaction monitoring（MRM）chromatograms of naltrexone（A）and naloxone（B）in rabbit plasma.A1，B1 and C1：blank plasma sample；A2，B2 and C2：blank plasma spiked with 0.5 μg·L-1naltrexone and 10 μg·L-1 naloxone.Plasma sample collected after an im administration of naltrexone-3-O-caprylate.HPLC separation was accomplished on an Agilent Zorbax SB-C18 column（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）with a mobile phase composed of methanol-0.1 FA water（50∶50）at a flow rate of 0.2 mL·min-1.The ion transitions monitored in multiple reaction-monitoring modes were m/z 342.2→324.1 and m/z 328.1→310.2 for naltrexone and naloxone，respectively.

表1為基質(zhì)效應(yīng)和回收率的考察結(jié)果。在質(zhì)控濃度為0.8，10和80 μg·L-1下，納曲酮的基質(zhì)效應(yīng)分別為87.2%，84.6%和86.8%，基質(zhì)可引起目標(biāo)成分信號(hào)抑制，但3個(gè)濃度的抑制程度基本相當(dāng)，因此不影響目標(biāo)成分的定量測定，內(nèi)標(biāo)納洛酮的基質(zhì)效應(yīng)為75.2%。3個(gè)濃度納曲酮的回收率分別為77.1%，81.0%和76.5%，內(nèi)標(biāo)納洛酮的回收率為77.8%。

Tab.1 Matrix effect and extraction recovery of naltrex?one and naloxone in rabbit plasma

2.2.5 準(zhǔn)確度和精密度

采用3個(gè)分析批次對(duì)測定方法的準(zhǔn)確度和精密度進(jìn)行驗(yàn)證，取濃度為0.8，10和80 μg·L-1的質(zhì)控樣品，按1.6方法進(jìn)行操作，在每個(gè)分析批次內(nèi)進(jìn)行5次分析測定，每分析批次隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以該標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血藥濃度，求算每批的批內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度以及3批共15個(gè)數(shù)據(jù)的批間精密度和準(zhǔn)確度。方法的準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果如表2所示，3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度為94.9%～105.4%，批內(nèi)精密度1.3%～5.0%，批間精密度2.7%～4.2%。分析方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合方法學(xué)要求。

2.2.6 穩(wěn)定性

方法學(xué)驗(yàn)證過程中，利用0.8，10和80 μg·L-13個(gè)濃度的質(zhì)控樣品對(duì)穩(wěn)定性進(jìn)行考察，包括室溫25℃放置4 h、-20℃冷凍條件下保存30 d、樣品置于自動(dòng)進(jìn)樣器中8 h和3次凍融循環(huán)的穩(wěn)定性，并利用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的實(shí)測濃度。樣品的穩(wěn)定性考察結(jié)果如表3所示，血漿樣品在室溫下放置4 h、-20℃保存30 d，處理后樣品在室溫條件下在自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)放置8 h以及血漿樣品3次凍融循環(huán)后樣品保持穩(wěn)定，準(zhǔn)確度為98.3%～103.0%，精密度為1.8%～6.7%。

2.3 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)分析

應(yīng)用所建立的LC-MS/MS方法測定了兔im給予納曲酮和納曲酮-3-O-辛酸酯后血漿中納曲酮的含量，平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖4。采用非房室模型對(duì)所測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到主要的藥動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表4。研究結(jié)果表明，im給予納曲酮1.0 mg·kg-1后吸收迅速；而與之相比，im給予納曲酮-3-O-辛酸酯1.2 mg·kg-1后，血漿中納曲酮濃度上升緩慢，Tmax，T1/2和 MRTtn均顯著延長（P＜0.01），Cmax顯著降低（P＜0.01）。

Tab.2 Accuracy and precision of determination of naltrexone in rabbit plasma

Tab.3 Stability of naltrexone in rabbit plasma

Fig.4 Mean plasma concentration-time curve of naltrex?one after intramuscular administration of naltrexone（1 mg·kg-1）or equal molar dose of naltrexone-3-O-caprylate（1.2 mg·kg-1）in rabbits.

Tab.4 Main pharmacokinetic parameters of naltrexone after intramuscular administration of naltrexone or naltrexone-3-O-caprylate in rabbits.

3 討論

本研究對(duì)LC-MS/MS方法學(xué)進(jìn)行了系統(tǒng)驗(yàn)證。采用ESI源進(jìn)行正負(fù)離子掃描，發(fā)現(xiàn)納曲酮和內(nèi)標(biāo)納洛酮在正離子模式下響應(yīng)值較高，因此采用正離子檢測模式。在色譜條件優(yōu)化中，以分離度、對(duì)稱性及保留時(shí)間為指標(biāo)，對(duì)流動(dòng)相組成及甲酸、乙酸、甲酸銨等添加劑的種類和含量進(jìn)行優(yōu)化，最終確定以甲醇/0.1% FA水溶液（50∶50）作為流動(dòng)相。在樣品預(yù)處理過程中，以回收率和基質(zhì)效應(yīng)為指標(biāo)，考察了正己烷、乙酸乙酯和甲基叔丁基醚等有機(jī)溶劑及其不同比例的混合物作為提取溶劑，最后發(fā)現(xiàn)甲基叔丁基醚提取效率高，基質(zhì)干擾少，最終優(yōu)選其為提取溶劑。本研究所建立的方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，適用于兔血漿樣品中納曲酮含量的測定。

兔是藥物臨床前研究的主要實(shí)驗(yàn)對(duì)象之一。納曲酮及其新劑型常以兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象開展代謝動(dòng)力學(xué)研究［18-19］，同時(shí)也有一些文獻(xiàn)報(bào)道酯化前體藥物在兔體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究［20-21］。本研究發(fā)現(xiàn)，納曲酮辛酸酯作為酯化前體藥物，能夠顯著延長納曲酮在體內(nèi)的駐留時(shí)間，Tmax，T1/2和MRTtn都較納曲酮顯著延長，分別延長至35.8，7.4和9.3倍，Cmax降低至9.0%，起到明顯的緩釋效果。

本研究建立的LC-MS/MS方法可用于檢測兔血漿樣品中納曲酮的含量，并比較了納曲酮原型藥物與酯化前體藥物的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，為設(shè)計(jì)研發(fā)阿片類毒品依賴者脫毒后長效抗復(fù)吸藥物提供數(shù)據(jù)參考。