楊立娜，黃靖航，李燕紅，佟 彤，王勝男，何余堂，劉 賀，朱丹實*

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧錦州121013 2 遼寧省糧谷類食品生物高效轉(zhuǎn)化工程研究中心 遼寧錦州121013）

人體消化道內(nèi)的細(xì)菌多達(dá)500～1 000 種，人體的生理、免疫、消化和抗衰老等都離不開腸道微生物群[1]。維護腸道微生態(tài)平衡，益生菌功不可沒。而裸露的益生菌對外界不利環(huán)境非常敏感，大部分難以抵抗胃液的酸性環(huán)境到達(dá)腸道發(fā)揮作用。通過微膠囊技術(shù)可以將益生菌包裹在微小且封閉的膠囊中，這不僅提高益生菌在胃液中的存活率，還能促進(jìn)其在腸道中的釋放[2-3]。熊濤等[4]發(fā)現(xiàn)脫脂乳和海藻酸鈉為壁材具有良好的耐酸性，用其包埋的植物乳桿菌NCU116 在人工胃液中處理3 h后，微膠囊中的活菌數(shù)仍可達(dá)8.79×109CFU/g。趙偉麗等[5]以海藻酸鈉、大豆分離蛋白和低聚果糖為壁材包埋植物乳桿菌，經(jīng)胃、腸液處理后微膠囊活菌數(shù)顯著高于未包埋的活菌數(shù)。天然菊糖具有降血脂，改善腸道環(huán)境，促進(jìn)有益菌增殖，預(yù)防肥胖，改善糖尿病等功效[6-8]。然而，天然菊糖的分子質(zhì)量跨度大，嚴(yán)重影響其凝膠特性、流變學(xué)特性和營養(yǎng)學(xué)特性等功能，因此不同分子質(zhì)量的菊糖作為壁材，對益生菌微膠囊的穩(wěn)定性也會產(chǎn)生影響。

本研究采用乙醇分級天然菊糖，通過體外模擬消化環(huán)境考察不同分子質(zhì)量菊糖的消化特性，測定在益生菌作用下消化液pH 值、OD 值、流變特性和短鏈脂肪酸（Short-chain fatty acid，SCFA）的變化。選取益生效果最佳的菊糖為壁材，益生菌為芯材，通過擠壓法制備1 款菊糖益生菌微膠囊，同時檢測微膠囊的包埋率、消化穩(wěn)定性、溶解性和貯藏穩(wěn)定性等指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與材料

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），北京川秀科技有限公司；MRS 肉湯培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；褐藻糖膠，北京天和益生健康科技有限公司；菊糖，荷蘭Sensus B.V 公司；胰酶，北京博奧拓達(dá)有限公司；2-乙基丁酸，上海源葉生物科技有限公司；其它試劑（分析純級）均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

OA21002 型精密電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C 型精密pH 計，上海雷磁儀器廠；TDL-5-A 低速離心機、LRH-150 恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Allegra 64R高速冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；LDZF-50KB 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；UV-2550 紫外-可見分光光度計，日本島津公司；DHR-1 流變儀，美國TA 公司；7890A-5975 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；Tis 顯微鏡，日本Nikon 公司。

1.3 菊芋菊糖體外模擬消化特性研究

1.3.1 模擬消化液配制與菌種活化 參考并改進(jìn)胃液和腸液的配制方法[9]，將2.0 g NaCl 溶解于200 mL 蒸餾水中，用0.1 mol/L 的HCl 溶液調(diào)節(jié)pH 值至1.2，加入5.0 g 胃蛋白酶后，攪拌均勻定容至1 L；取3.4 g KH2PO4，溶解于200 mL 蒸餾水中，用0.1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值至6.8，加入5.0 g 胰酶后，攪拌均勻定容至500 mL。將模擬消化液過濾除菌后，放在4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

益生菌活化：取植物乳桿菌菌粉1.0 g 分別接種到已經(jīng)滅菌過的MRS 肉湯培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)條件下培養(yǎng)48 h 備用。

1.3.2 菊糖分級與體外模擬消化 采用分步分級法[10]，稱取天然菊糖配制菊糖飽和溶液，加入無水乙醇調(diào)配成體積分?jǐn)?shù)80%和10%的乙醇溶液，4℃靜置24 h 后，4 000 r/min 離心30 min，65 ℃烘干，得到2 種分子質(zhì)量的菊糖。

將不同分子質(zhì)量菊糖以1%添加量加到體外模擬消化液中，并接種體積分?jǐn)?shù)1%的菌懸液，37℃恒溫培養(yǎng)。試驗分為4 組：空白組、天然菊糖組、10%乙醇沉淀的菊糖組（以下簡稱10%菊糖組）和80%乙醇沉淀的菊糖組（以下簡稱80%菊糖組）。

1.3.3 益生菌增殖與腸液酸化檢測 取0，24，48，72 h 的體外模擬消化液，在波長650 nm 處測定OD 值，繪制益生菌生長曲線；同時，測定各時間點消化液的pH 值，繪制pH 值變化曲線。

1.3.4 腸液流變特性檢測 分別吸取0，24，48，72 h 的不同體外模擬消化液，參考楊希娟等[11]的方法并改進(jìn)，采用40 mm 平行板夾具，25 ℃下線性剪切，剪切速率為0.1～100 s-1，測定時間為180 s，連續(xù)測定180 個數(shù)據(jù)點，檢測消化液表觀黏度隨剪切速率的變化情況。

1.3.5 短鏈脂肪酸（SCFA）檢測 使用GC-MS 檢測消化液在24 h 和48 h 兩個階段的SCFA 組成，采用外標(biāo)法測定。取出1 mL 消化液放入2 mL 的離心管中，加入40 μL 10%H2SO4，渦旋混勻。向離心管中加入500 μL 乙醚，將酸化后的樣品萃取到乙醚中。4 ℃，14 000 r/min 離心15 min，小心吸取上層乙醚相用于分析。GC 設(shè)置參數(shù)：色譜柱Rtx-WAX 色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。程序升溫參數(shù)：初始溫度60 ℃，以15 ℃/min 的速度上升至230 ℃后保持3 min，載氣為氦氣，流速1.5 mL/min，汽化室溫度250 ℃，以10∶1 進(jìn)樣比分流進(jìn)樣。MS 的參數(shù)：離子源溫度200 ℃；接口溫度250℃；掃描的質(zhì)荷比范圍：2～100[12]。

1.4 益生菌微膠囊性能研究

1.4.1 益生菌微膠囊的制備 將活化后的菌懸液于2 000 r/min 離心10 min，收集沉淀，用生理鹽水將沉淀懸浮。將懸浮液與2%菊糖混合，渦旋振蕩10 s。微量注射器將混勻的溶液滴入無菌的3%CaCl2溶液中，靜置5 min。將濕膠囊過濾，生理鹽水沖洗3 次，備用。

1.4.2 微膠囊包埋率測定 取0.5 g 益生菌微膠囊，去離子水沖洗3 次后研磨、溶解。平板計數(shù)法測其內(nèi)部活菌數(shù)為A（CFU/mL）；再測定制備微膠囊時濃縮菌液中的活菌總數(shù)為B（CFU/mL），用此方法計算微膠囊的包埋率I（%），如公式（1）所示[13]：

1.4.3 微膠囊胃腸液消化穩(wěn)定性測定 取1 g 微膠囊放入9 mL 人工模擬胃液或腸液中，將其置于搖 床（37 ℃，210 r/min），在0，20，40，60，80，100，120 min 時取樣液于650 nm 處測定OD 值。將消化液以4 000 r/min 離心10 min，倒去上清液。用一定量的水將沉淀洗入已知質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，移入105 ℃干燥箱中烘至恒定質(zhì)量。計算微膠囊在模擬胃腸消化液中的溶解率，如公式（2）所示[14]：

式中，M——樣品質(zhì)量（g）；M1——蒸發(fā)皿質(zhì)量（g）；M2——蒸發(fā)皿和不溶物質(zhì)量（g）；A——樣品含水量（%）。

1.4.4 微膠囊貯藏溫度測試 將制備好的微膠囊加入到無菌生理鹽水中，分別貯藏于4，25，37 ℃條件下，在0，1，3，7，14，21 d 時取樣平板計數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個試驗重復(fù)3 次，采用Origin 9.1 軟件作圖，應(yīng)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行方差分析，以P＜0.05為顯著性檢驗標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分子質(zhì)量菊糖干預(yù)后益生菌的增殖情況

通過觀察0～72 h 內(nèi)發(fā)酵液的OD 值和pH 值變化，分析植物乳桿菌在不同分子質(zhì)量菊糖干預(yù)下的增殖情況。OD 值的大小反映發(fā)酵液中菌群數(shù)量的多少，變化速率的大小反映菌群增長的快慢[15]。由圖1可知，0～24 h，10%菊糖組的OD 值快速上升，變化速率高于其它組；24～48 h，除空白組以外，所有樣品的OD 值變化速率均增大，10%菊糖組仍然最高；48～72 h，隨發(fā)酵時間的延長，所有組的變化速率降低，OD 值逐漸趨于一致。與空白組相比，添加不同分子質(zhì)量菊糖干預(yù)后的植物乳桿菌數(shù)量和增殖速度較高，表現(xiàn)出較好的增殖效果。雖然所有菊糖組都能促進(jìn)植物乳桿菌的增殖，但是10%菊糖促進(jìn)植物乳桿菌增殖效果最佳。因此，不同分子質(zhì)量的菊糖對益生菌的增殖效果方面存在一定差異。劉麗莎等[16]研究表明白術(shù)中多糖成分對雙歧桿菌和乳桿菌具有良好的促生長效果，且這種促生長作用與其添加濃度有關(guān)；Wang等[17]研究表明油菜籽多糖可以顯著刺激雙歧桿菌和乳酸菌的增殖、生長以及酸化活性；Chen 等[18]研究表明以竹筍多糖作為葡萄糖的替代碳源，對體外發(fā)酵雙歧桿菌和乳酸菌的生長具有顯著促進(jìn)作用，以上結(jié)果與本研究一致。益生菌可利用的主要營養(yǎng)來自于碳水化合物，因此益生菌可以通過降解復(fù)雜的植物多糖獲取能量和營養(yǎng)供自身生長繁殖[19]。

pH 值下降是菊糖體外模擬消化過程中的一個顯著變化，主要由于植物乳桿菌有效利用菊糖，使其分解為乳酸、醋酸或其它有機酸，從而導(dǎo)致pH 值降低。pH 值的降低可以有效抑制雜菌生長。由圖1可知，0～48 h，與空白組相比，天然菊糖、10%菊糖和80%菊糖組的pH 值下降更快，趨勢基本一致；48～72 h，發(fā)酵液的酸化程度緩慢下降，而10%菊糖組pH 值最低。pH 值的變化趨勢與OD值的變化趨勢相互對應(yīng)，說明植物乳桿菌對菊糖的利用程度越高，菌株數(shù)量越多，消化液的酸化程度越高。有研究表明，天然菊糖的分子質(zhì)量在6 000 u 左右，10%菊糖的分子質(zhì)量在1 900 u 左右，80%菊糖的分子質(zhì)量在2 200 u 左右[20]。這說明植物乳桿菌對低分子質(zhì)量菊糖的利用程度較高，產(chǎn)酸較多。李琬聰[21]研究菊芋中不同聚合度的菊糖對雙歧桿菌的益生活性的影響，也得到了相似曲線趨勢，雙歧桿菌的生長狀況基本與菊糖聚合度呈反比，即聚合度小的菊糖做碳源的培養(yǎng)基更有利于益生菌的生長，與本研究結(jié)果保持一致。

圖1 植物乳桿菌生長曲線（a）和pH 值變化曲線（b）Fig.1 Compound probiotic growth curve （a）and pH value curve （b） of Lactobacillus plantarum

2.2 不同分子質(zhì)量菊糖干預(yù)后發(fā)酵液的流變特性

圖2 剪切速率對消化液表觀黏度的影響Fig.2 Effect of shear rate on apparent viscosity of digestive juice

腸液流變性的變化通常會影響腸道菌群的定殖、分布與生長，進(jìn)而影響益生菌對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收效果[22]。在0～100 s-1的剪切速率下，測定不同分子質(zhì)量菊糖的益生菌模擬消化液的表觀黏度。結(jié)果如圖2所示，在0～20 s-1的剪切速率下，0，24，48，72 h 各組的表觀黏度均隨剪切速率的增加而迅速降低，呈剪切稀化的流動特征，因為在應(yīng)力的剪切下，發(fā)酵液的結(jié)構(gòu)被破壞，表觀黏度呈不斷下降的趨勢[23]。在20 s-1之后，發(fā)酵液的表觀黏度不再隨剪切速率的增大而下降，而是趨近一個常數(shù)，表現(xiàn)為恒定的理想牛頓流體行為，這種剪切稀化和凝固特性的規(guī)律更類似于人體腸道黏液實際的流變學(xué)特性[24]。Wang 等[25]、Marie 等[22]研究也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。而且通過比較發(fā)現(xiàn)，0～48 h 時10%菊糖組的表觀黏度較高，然而隨著發(fā)酵時間的延長，在48 h 時，10%菊糖組的表觀黏度略有降低。由于0～24 h 內(nèi)腸道菌群快速利用菊糖，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物改變了發(fā)酵液的表觀黏度；在72 h 后，含有菊糖的消化液的表觀黏度趨于一致，主要因為益生菌發(fā)酵接近終點，發(fā)酵終產(chǎn)物差異較小。

2.3 短鏈脂肪酸的GC-MS 分析

短鏈脂肪酸（SCFA）主要由雙歧桿菌、乳酸菌等代謝碳水化合物產(chǎn)生，參與機體重要的生理代謝過程，為結(jié)腸黏膜細(xì)胞提供主要能量，維持腸道的正常功能[26]。如表1所示，植物乳桿菌發(fā)酵24 h時，10%菊糖組產(chǎn)生甲酸、乙酸和丁酸3 種SCFA，其中乙酸含量最高；天然菊糖組和80%菊糖組只產(chǎn)生乙酸和丁酸2 種SCFA，且含量較低；空白組未產(chǎn)生SCFA。植物乳桿菌發(fā)酵48 h 時各組產(chǎn)生SCFA 繼續(xù)累積，且變化規(guī)律與發(fā)酵24 h 時保持一致。不同分子質(zhì)量菊糖均能被益生菌降解代謝產(chǎn)生SCFA，并且對10%菊糖的利用度更高。10%菊糖的分子質(zhì)量較80%菊糖和天然菊糖的分子質(zhì)量更低，更容易被植物乳桿菌所利用。謝潔玲等[27]研究也發(fā)現(xiàn)，腸道菌群體外降解巖藻聚糖硫酸酯寡糖和低分子質(zhì)量組分更徹底，而對高分子質(zhì)量巖藻聚糖硫酸酯的降解和利用度很低。

表1 不同時間消化液中短鏈脂肪酸含量（μg/mL）Table 1 Short-chain fatty acid content in digestive juices at different times （μg/mL）

綜上，根據(jù)不同分子質(zhì)量菊糖對植物乳桿菌增殖能力、發(fā)酵液流變特性以及代謝產(chǎn)物SCFA含量的影響，選取益生效果最佳的10%菊糖作為微膠囊主要壁材，做下一步研究。

2.4 微膠囊的包埋率及模擬胃、腸液中的穩(wěn)定性

包埋率是微膠囊進(jìn)行工藝優(yōu)化的主要指標(biāo)，也是評價微膠囊質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)，因此包埋率是制造微膠囊產(chǎn)品首要考慮的因素[28]。本研究結(jié)果顯示微膠囊內(nèi)部活菌數(shù)和包埋率分別為97.6 CFU/mL 和71.98%。常柳依等[29]采用藻酸鹽寡糖包裹長雙歧桿菌的包埋率為71.98%；Krasaekoopt等[30]采用低聚半乳糖和菊粉包裹嗜酸乳桿菌的包埋率為79.4%；吳軍林等[31]采用菊粉和海藻酸鈉包埋副干酪乳桿菌R8 的包埋率為77.6%。糖類物質(zhì)包埋益生菌的包埋率大部分在70%～80%之間，本研究的微膠囊包埋率也符合這個規(guī)律。

由圖3可知，微膠囊在人工模擬胃液中隨著時間的延長逐漸溶解，至40 min 時達(dá)到最大值，40 min 后微膠囊?guī)缀醪辉偃芙?，趨于穩(wěn)定。經(jīng)過計算，微膠囊溶解率為12.41%，該結(jié)果表明經(jīng)過包埋的植物乳桿菌在經(jīng)過胃液消化時，少量微膠囊出現(xiàn)溶解釋放益生菌的現(xiàn)象。李偉等[32]研究表明海藻酸鈉/殼聚糖雙層合生元微膠囊在體外模擬胃液中的溶解率可達(dá)10%，甚至更低；陳虎等[33]研究表明以兩親性青稞β-葡聚糖酯為壁材，花青素微膠囊在模擬胃液中的溶解率為19.6%。單層菊糖包埋的微膠囊雖不如雙層微膠囊在胃液中穩(wěn)定，但相較于大部分單層包埋微膠囊而言，菊糖微膠囊在模擬胃液中的溶解性更低，穩(wěn)定性更好。

由圖3可知，微膠囊在人工模擬腸液中0～60 min 溶解速度較快，60 min 后溶解速度變慢，微膠囊溶解釋放逐漸穩(wěn)定。消化液中無明顯顆粒存在，微膠囊溶解率接近100%，這說明植物乳桿菌微膠囊進(jìn)入腸道后，在60 min 內(nèi)幾乎全部崩解，釋放出包埋在內(nèi)的植物乳桿菌，使其在腸道發(fā)揮作用。Gebara 等[34]研究表明嗜酸乳桿菌La5 微膠囊在腸道中完全釋放為300 min；劉歡[35]研究表明乳酸菌微膠囊在模擬腸液中完全釋放需要120 min，在豬腸消化物中益生菌需要60 min 完全釋放；李軍等[36]研究表明動物雙歧桿菌RH 微膠囊在模擬腸液中120 min 完全崩解。大部分以其它原料作為壁材的微膠囊，在人工模擬腸液中完全溶解通常是在服用100 min 后[37]，菊糖益生菌微膠囊在人工模擬腸液中的溶解速度相較于其它微膠囊更為迅速，作用時間更長。而與胃中的溶解釋放相比，腸液中的溶解釋放速率更快，可能因為腸液中含有胰淀粉酶，所以加速了微膠囊的破壁，加速了益生菌的釋放。

圖3 人工模擬胃腸液中微膠囊的穩(wěn)定性Fig.3 Artificial simulation of the stability of microcapsules in gastric and intestinal juice

2.5 微膠囊的貯藏穩(wěn)定性

由圖4可知，4 ℃和25 ℃貯藏條件下，微膠囊穩(wěn)定性較好，而37 ℃條件下微膠囊的貯藏穩(wěn)定性降低。同時，4 ℃條件下貯藏21 d，微膠囊溶解速度相對最緩慢，穩(wěn)定性更好（P＜0.05），損失較少。因此4 ℃為微膠囊的最佳貯藏溫度，微膠囊對包埋在內(nèi)的益生菌保護效果最好。廖霞等[38]研究也發(fā)現(xiàn)較低溫度下有利于槲皮素微膠囊的貯存和使用，與本研究結(jié)果一致。

圖4 不同溫度對微膠囊貯藏穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of different temperatures on the storage stability of microcapsules

3 結(jié)論

不同分子質(zhì)量的菊糖在體外模擬消化中都能促進(jìn)植物乳桿菌增殖，改變發(fā)酵液的流變學(xué)特性，產(chǎn)生SCFA，其中10%乙醇醇沉的小分子質(zhì)量菊糖的益生效果最佳。以10%菊糖作為壁材的益生菌微膠囊包埋率達(dá)到71.98%；在模擬胃液中較穩(wěn)定，溶解率為12.41%；在模擬腸液中溶解率接近100%。低溫4 ℃和常溫25 ℃條件下微膠囊貯藏穩(wěn)定性較37 ℃好，且4 ℃條件下效果最佳。未來，小分子質(zhì)量的菊糖在營養(yǎng)保健等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。