靈芝孢子多糖的提取工藝優(yōu)化及單糖組成、抗氧化活性分析

江和棟，牛 仙，萬仁口，鄧澤元，李紅艷

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌330047）

靈芝（Ganoderma lucidum）屬擔(dān)子菌綱多孔菌科，常作為一種珍貴的藥用真菌[1]，中醫(yī)學(xué)中一直視之為強(qiáng)身滋補(bǔ)的珍貴藥材[2]。靈芝孢子（Ganoderma lucidum spores，GLS）是在靈芝生長成熟期從靈芝菌蓋中彈射出來的極其微小的橢圓形生殖細(xì)胞，具有雙層孢壁，為靈芝的精華部分。有效成分包括靈芝三萜、核苷酸、靈芝多糖、多肽，富含鋅、鉀、鈣等微量元素[3]。靈芝孢子粉具有抑制腫瘤[4]，免疫調(diào)節(jié)[5]，清除自由基，抗衰老，降血糖，保肝護(hù)肝，提高機(jī)體耐缺氧能力[6]，保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)及心肌細(xì)胞等[7]，因而備受消費(fèi)者的青睞。

多糖是動植物細(xì)胞壁的重要組成成分，由多個單糖分子脫水縮合形成的高分子碳水化合物，具有復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)及豐富的生物活性[8]?，F(xiàn)代藥理研究表明靈芝孢子多糖 （Ganoderma lucidum spore polysaccharide，GLSP）在增強(qiáng)免疫，抗腫瘤，降血脂，降血糖，抗氧化，抗病毒，抗炎癥等方面有非常好的療效[9-12]。靈芝孢子多糖由多種單糖組成，不同單糖的比例和含量必然會導(dǎo)致多糖的結(jié)構(gòu)差異，進(jìn)而產(chǎn)生不同的藥理活性，探索不同產(chǎn)地的靈芝孢子多糖的單糖組成及含量對于評價和開發(fā)利用靈芝孢子具有重要意義。通常多糖需要通過酸的水解斷裂其糖苷鍵，再通過色譜檢測分析水解后的單糖，常用檢測方法主要有HPLC[13-14]、TLC[15]、GC[16]、HPAEC-AED[17]等方法。目前，尚未發(fā)現(xiàn)GC-MS 法檢測靈芝孢子多糖單糖組成的相關(guān)報道，與HPLC 相比，GC 分析的準(zhǔn)確度、精密度、靈敏度和效率相對較高。

本研究擬采用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)篩選出水浴法提取靈芝孢子多糖的最佳工藝參數(shù)，并對單糖組成做定性、定量以及抗氧化活性分析，為靈芝孢子產(chǎn)品的綜合開發(fā)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 原料

7 種靈芝孢子粉，南昌同心紫巢生物科技有限公司，樣品來源信息見表1。

1.2 試劑及儀器

葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖等標(biāo)品，阿拉??；福林酚試劑，上海荔達(dá)生物科技有限公司；甲醇、乙醇、C4H8O2、CF3COOH、濃硫酸、苯酚、乙酸酐，西隴科學(xué)；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼），西亞試劑。

SHZ-A 水浴恒溫振蕩器，上海博訊；BioTek酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司；N-1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；TDL-5-A 離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 靈芝孢子多糖提取工藝[18]預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明S1 靈芝孢子粉的多糖含量較高，故選擇S1 靈芝孢子粉作為優(yōu)化提取工藝的原料。取適量過80目篩的靈芝孢子粉，用95%乙醇浸泡24 h，脫去其中的脂類和低聚糖，離心（4 200 r/min，10 min）后60 ℃干燥。取適量脫脂孢子粉90 ℃熱水浴提取2次，離心（4 200 r/min，10 min）并取上清液濃縮至原體積的1/4。將上清液用95%乙醇醇沉（4 ℃，12 h），離心（4 200 r/min，10 min），多糖以沉淀形式從水溶性糖溶液中分離出來，沉淀即為粗多糖。

1.3.2 多糖含量測定方法 采用苯酚-硫酸法測定[19]。靈芝孢子粉過80 目篩，準(zhǔn)確稱取經(jīng)烘干至恒重的樣品（干燥靈芝孢子粉）1 g，采用1.3.1 節(jié)的方法提取靈芝孢子粗多糖，將沉淀（粗多糖）用50 mL 容量瓶加水定容，此溶液為樣品測定液。然后分別吸f取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 的100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖工作溶液至20 mL 具塞試管中，用蒸餾水補(bǔ)至1 mL，加入苯酚（5%）1 mL，快速補(bǔ)加硫酸5 mL（垂直于液面加入，勿接觸試管壁），靜置10 min 后振蕩均勻，置于30 ℃水浴20 min，取適量反應(yīng)液用酶標(biāo)儀在波長490 nm 處測定吸光度，并計(jì)算提取率。

1.3.3 單因素試驗(yàn) 稱取脫脂后干燥至恒重，過60 目篩的靈芝孢子粉末1 g，固定水浴振蕩速率為100 r/min，溫度為80 ℃的條件下提取，分別在10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1 mL/g 液料比條件下提取1.5 h，考察液料比對靈芝孢子多糖提取率的影響。固定液料比20∶1（mL/g），分別在提取溫度60，70，80，90，100 ℃條件下提取1.5 h，考察提取溫度對靈芝孢子多糖提取率的影響。固定液料比20∶1（mL/g），提取溫度80 ℃，分別提取1，1.5，2，2.5，3 h，考察提取時間對靈芝孢子多糖提取率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn) 利用合Box-Behnken 原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的水平及編碼見表2。采用Design-expert V 8.0 6 軟件分析所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)，優(yōu)化水浴法提取靈芝孢子粉多糖的工藝條件。

1.3.5 單糖組成的GC-MS 分析

表1 7 種靈芝孢子粉樣品來源信息Table 1 7 batches of Ganoderma lucidum spore powder sample source information

表2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)因素及水平表Table 2 Box-Behnken design factors and level table

1.3.5.1 多糖水解[20-21]準(zhǔn)確稱取10 mg 靈芝孢子粉粗多糖，置于10 mL 比色管中，加入2 mL 2 mol/L 的三氟乙酸（TFA）溶液，氮封后于110 ℃水解5 h，冷卻后氮?dú)獯蹈傻玫剿猱a(chǎn)物。而后稱取單糖標(biāo)準(zhǔn)品以及多糖水解物各10 mg，分別加入10 mg 鹽酸羥胺和0.5 mL 吡啶，放入90 ℃水浴中振蕩30 min。冷卻至室溫后加入0.5 mL 乙酸酐，在90 ℃下繼續(xù)反應(yīng)30 min，所得反應(yīng)液經(jīng)0.45 μm 有機(jī)濾膜過濾后做氣相色譜分析。

1.3.5.2 色譜檢測條件 色譜柱：Agilent HP-5毛細(xì)管柱；檢測器：FID 檢測器；載氣：高純氮，流速1 mL/min，分流比20：1。氣化室溫度250 ℃；檢測器溫度250 ℃；程序升溫：160 ℃保持2 min，然后以2 ℃/min 升至240 ℃，240 ℃保持5 min；進(jìn)樣量1 μL。

1.3.6 靈芝孢子多糖抗氧化特性分析[10，22-23]

1.3.6.1 DPPH 法測定自由基清除能力 取100 μL 多糖溶液 （1 mg/mL） 或空白溶液與100 μL DPPH 甲醇溶液（0.065 mmol/L）混合，加入96 孔板中，緩慢搖勻，將溶液在室溫條件下避光反應(yīng)30 min，在波長517 nm 處測定其吸光值。將Trolox作為參照標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表示為mmol/L Trolox/g DW。平行測定3 次，取平均值。

1.3.6.2 ABTS 法測定自由基清除能力 ABTS 工作液的配制：取88 μL 140 mmol/L K2S2O8與5 mL 7.0 mmol/L ABTS 儲備液混勻，靜置12～16 h。

用ABTS 工作液加80%甲醇混合稀釋使之在波長734 nm 處吸光值為0.7±0.02，取200 μL ABTS 溶液和20 μL 多糖溶液（1 mg/mL）樣品或標(biāo)品溶液分別加入96 孔板中，將溶液在室溫下避光反應(yīng)6 min，于波長734 nm 處用酶標(biāo)儀測定吸光值。將Trolox 作為參照標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表示為mmol/L Trolox/g DW。平行測定3 次，取平均值。

1.3.6.3 Fe3+還原力（FRAP）測定 按照FRAP 試劑盒說明書配制FRAP 工作液，依次將180 μL 預(yù)熱 至37 ℃的FRAP 工作液、10 μL 多糖溶液（1 mg/mL）或抗壞血酸標(biāo)品溶液加入96 孔板，在振蕩器上避光搖勻，37 ℃下反應(yīng)5 min，于595 nm 波長處用酶標(biāo)儀測定其吸光度值。以FeSO4系列標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將FeSO4作為參照標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表示為mmol/L FeSO4/g DW。平行測定3 次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比對靈芝孢子多糖提取得率的影響由圖1可知，隨著液料比的升高，提取率呈上升趨勢，并于20∶1（mL/g）時達(dá)到峰值，之后液料比繼續(xù)增加，提取率趨于平穩(wěn)。隨著液料比增大，得率也相應(yīng)增加，然而液料比過大，不僅延長了濃縮時間，而且會加大多糖的損失，反而導(dǎo)致得率下降[24-25]。因此最佳液料比為20∶1（mL/g）。

2.1.2 提取溫度對靈芝孢子多糖提取得率的影響由圖2可知，隨著提取溫度升高，提取率迅速提高，在80 ℃時達(dá)到峰值，之后隨著提取溫度升高，提取率趨于穩(wěn)定并略有下降。提取溫度升高伴隨著多糖分子的劇烈運(yùn)動，并加快多糖的溶出，因此升高提取溫度有利于增加提取率。然而隨著提取溫度升高到80 ℃后，不僅會加快提取液的損耗，而且高溫可能會破壞多糖結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致生物活性被損傷[26-27]。綜上所述，選擇80 ℃為最佳提取溫度。

2.1.3 提取時間對靈芝孢子多糖提取得率的影響由圖3可知，提取率隨著提取時間的延長而增加，當(dāng)提取時間為1～2 h 時，提取率顯著增加，并在2 h 達(dá)到峰值，之后提取率趨于平緩。因此，最佳提取時間被確定為2 h。

圖1 液料比對靈芝孢子多糖提取率的影響Fig.1 Effect of liquid-material ratio on the extraction yield of GLSP

圖2 提取溫度對靈芝孢子多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction yield of GLSP

圖3 提取時間對靈芝孢子多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction yield of GLSP

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用Box-Behnken 進(jìn)行3 因素3 水平的響應(yīng)面試驗(yàn)[28]，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Response surface test design and results

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果分析，3 因素經(jīng)過擬合得到的回歸方程：

Y=1.54+0.090A+0.045B+0.075C-0.035AB+0.045AC-0.030BC-0.19A2-0.13B2-0.12C2

方差分析結(jié)果見表4，可以根據(jù)顯著性水平（P 值）判斷回歸方程中各種因素及其組合對響應(yīng)值影響的顯著性，小于0.01 可認(rèn)為其極顯著，小于0.05 時認(rèn)為其顯著。結(jié)果顯示模型P 值=0.0001＜0.01，表明該回歸模型極顯著，因變量和自變量的線性關(guān)系顯著（R2=0.9737）。失擬誤差=0.525＞0.05 則失擬不顯著。模型的調(diào)整確定系數(shù)（R2Adj）=0.9400，說明模型和實(shí)際試驗(yàn)的擬合程度較好，試驗(yàn)誤差較小，說明上述回歸方程可代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)，對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。證明利用提取溫度、液料比、提取時間作為單因素建立水浴法提取靈芝孢子多糖的工藝優(yōu)化模型，可以提高靈芝孢子多糖的提取率。

表4 擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of the fitted quadratic polynomial model

2.2.2 響應(yīng)面分析 根據(jù)上述模型，通過二次回歸方程得到的響應(yīng)面如圖4所示。響應(yīng)面圖的曲面形狀可以看出影響因素的顯著水平，曲面較陡說明影響顯著，曲面較圓說明影響不顯著[29]。

圖4 液料比和提取溫度（a）、提取時間和液料比（b）、提取時間和提取溫度（c）3 因素交互作用響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots for the interactive effects on the yield of GLSP

由圖4a 可知，當(dāng)提取時間不變時，提取溫度和液料比兩者交互曲面較陡和等高線偏圓形，表現(xiàn)為不顯著，靈芝孢子多糖得率的變化隨著液料比的變化大于提取溫度的變化，因此受液料比的影響較大；由圖4b 可知，液料比和提取時間曲面較平緩，交互作用表現(xiàn)為不顯著，因此受料液比的影響較大；由圖4c 可知，提取時間和液料比之間曲面較平緩，交互作用表現(xiàn)為不顯著，因此受提取時間的影響較大。試驗(yàn)因素中對靈芝孢子多糖提取得率的影響，依次為液料比、提取時間和提取溫度，與表4結(jié)果一致。經(jīng)軟件處理，靈芝孢子多糖最佳提取工藝為提取溫度80.5 ℃，液料比18.92∶1，提取時間2.18 h，在此提取條件下多糖的最大提取得率為1.564%。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 工藝參數(shù)修正為：液料比19∶1，提取溫度81 ℃，提取時間2 h，做3 組平行試驗(yàn)，所得多糖提取率的平均值為（1.507±0.028）%，與回歸方程所得的多糖提取率1.564%，相對誤差僅為3.64%。說明回歸方程能較真實(shí)地反應(yīng)各因素對靈芝孢子多糖提取率的影響，證明用響應(yīng)面法優(yōu)化靈芝孢子多糖提取率回歸模型可靠。

2.3 靈芝孢子多糖的單糖組成分析

2.3.1 靈芝孢子多糖色譜分析結(jié)果 采用鹽酸羥胺肟化和乙酸酐乙?；苌色@得單一的色譜峰，提高了氣相色譜定性和定量分析的精確度[16]。通過GC-MS 對靈芝孢子多糖水解衍生物進(jìn)行檢測，得到圖5，可知7 種靈芝孢子多糖主要由半乳糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、阿拉伯糖和木糖組成，結(jié)果與黃曉蘭等[30]研究結(jié)果一致，然而7 個樣品峰高低不完全相同，表明由于品種不同，各單糖含量有所差異。

2.3.2 線性關(guān)系考察 以單糖濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y），對半乳糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、阿拉伯糖和木糖6 種單糖進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果見表5，相關(guān)系數(shù)均在0.9993 以上，線性關(guān)系較好。

圖5 樣品多糖組總離子流圖Fig.5 Total ion chromatogram of sample polysaccharide group

表5 各種單糖的線性回歸方程及線性范圍Table 5 Linear regression equations and linear ranges of various monosaccharides

表6 不同來源靈芝多糖的單糖組成及含量（mg/100 mg）Table 6 Monosaccharide composition and content of Ganoderma lucidum spore powder from different sources （mg/100 mg）

表7 不同來源靈芝孢子粉的單糖摩爾比Table 7 Monosaccharide molar ratio of Ganoderma lucidum spore powder from different sources

2.3.3 單糖組成分析結(jié)果 不同來源靈芝孢子樣品多糖的單糖組成及含量如表6所示，結(jié)果顯示，不同來源的樣品間各單糖的絕對含量差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05），葡萄糖是靈芝孢子多糖的主要組成單糖，不同來源樣品葡萄糖絕對含量為8.854～13.243 mg/100 mg，其中來自吉林S7 樣品中葡萄糖絕對峰面積最低，為8.854 mg/100 mg，來自江西的S3 樣品中葡萄糖絕對峰面積最高，為13.243 mg/100 mg，后者是前者的1.495 倍。鼠李糖是靈芝孢子多糖中含量最少的單糖，不同來源樣品間鼠李糖絕對含量為0.953～1.025 mg/100 mg，其中來自江西的S3 樣品中鼠李糖絕對含量最低，為0.953 mg/100 mg，來自江西的S1 最高，為1.025 mg/100 mg，兩者相差很小。張芝華[31]發(fā)現(xiàn)不同品牌靈芝孢子粉多糖的單糖組成較為接近，主要由半乳糖、葡萄糖、甘露糖組成，然而3 種單糖的比例相差較大，與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致，其單糖含量差別較大的原因可能是由于試驗(yàn)所用原料的品種、區(qū)域、提取方法及測定方法存在差異導(dǎo)致。除此之外相同產(chǎn)地不同批次的靈芝孢子樣品多糖的單糖組成也具有顯著差異，如來自江西的S1、S3、S6，安徽的S4、S5 和吉林的S2、S7。此結(jié)果與陳體強(qiáng)等[32]的研究結(jié)果一致：不同采收期（早季、晚季和次年生）硬孔靈芝在多糖組成（單糖組成種類及其摩爾比）上存在一定的差異。這可能是由于不同收獲期的氣候差異對靈芝生長起到了一定的影響，進(jìn)而影響其質(zhì)量。因此靈芝的選種不僅要針對靈芝生長產(chǎn)地，同樣也要對靈芝收獲批次進(jìn)行嚴(yán)格控制，才能獲得優(yōu)質(zhì)菌種。

靈芝孢子單糖摩爾比如表7所示，鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖6 種單糖在7 個靈芝孢子樣品中的摩爾比（相對含量）有略微的差別，其平均摩爾比為3.860，9.829，11.044，22.078，40.338，14.273。其中，甘露糖、葡萄糖、半乳糖為主要單糖，鼠李糖、阿拉伯糖、木糖為微量單糖。

2.4 靈芝孢子多糖抗氧化活性比較

圖6 靈芝孢子多糖的抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activity of GLSP

將靈芝孢子粗多糖配制成1 mg/mL 的溶液，分別測定FRAP 還原能力、DPPH 清除能力、ABTS清除能力，靈芝孢子多糖呈現(xiàn)出一定的抗氧化活性，且不同來源多糖之間有顯著性差異（P＜0.05），見圖6。從圖中可以看出，靈芝孢子粗多糖具有一定的ABTS 清除能力和FRAP 還原能力，其中S2具有最高的ABTS 清除能力和FRAP 還原能力，S1 表現(xiàn)的抗氧化活性最低。結(jié)果表明靈芝孢子多糖的ABTS 清除能力要弱于DPPH 清除能力?？梢姡? 種靈芝孢子多糖的抗氧化性能不完全相同，總體表現(xiàn)為S2＞S3＞S5＞S4＞S6＞S7＞S1。

3 結(jié)論

以靈芝孢子粉為原料，以多糖提取得率為評價指標(biāo)，通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了水浴法提取靈芝孢子多糖工藝，利用Design-Expert 8.0 軟件分析試驗(yàn)結(jié)果得到最佳工藝：提取溫度81 ℃，液料比19∶1，提取時間2 h，在此條件下所得多糖提取率的平均值為（1.507±0.028）%。通過上述最佳工藝提取7 種靈芝孢子粉多糖，采用GC-MS 技術(shù)對其單糖組成做進(jìn)一步分析，結(jié)果表明，鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖為靈芝孢子多糖的主要組成單糖，其平均摩爾比為3.860，9.829，11.044，22.078，40.338，14.273。來自江西、安徽、吉林的7 種靈芝孢子多糖的單糖組成具有較大差異，抗氧化活性也有顯著差異。本研究可為進(jìn)一步開發(fā)和利用靈芝孢子多糖提供參考依據(jù)。