方若思，陳唐超，梁淑敏，金誠豫，黃溫迪，龔金炎，肖功年

（浙江科技學院 杭州310023）

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC）是一種在動物乃至人體內(nèi)具有潛在致癌性的2A 類致癌物，存在于多種發(fā)酵食品及酒精飲料中，如醬油、奶酪、葡萄酒、黃酒等[1-3]。研究表明，尿素、瓜氨酸、氨甲酰磷酸、氰酸和焦碳酸二乙酸是EC 形成的前體物，其中酵母菌和部分乳酸菌通過精氨酸代謝途徑產(chǎn)生的尿素和瓜氨酸是最重要的2 種前體物[4]。

酒類的瓜氨酸主要自精氨酸脫亞胺酶途徑代謝產(chǎn)生，在這一途徑中包括3 種關鍵酶，分別為精氨酸脫亞胺酶 （Arginine deimidase，ADI，EC3.5.3.6）、鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶 （Ornithine transcarbamoylase，OTC，EC2.1.3.3）和氨基甲酸激酶（Carbamate kinase，CK，EC2.7.2.2）[5-7]。該途徑將精氨酸水解，最終轉(zhuǎn)化為鳥氨酸、氨和二氧化碳。

目前關于鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶的研究較少，主要集中在人體內(nèi)，由于是肝臟尿素循環(huán)的必需酶，因此OTC 酶的缺失常導致嗜睡、嘔吐、精神發(fā)育遲緩等癥狀，同時OTC 的缺失與否也可作為肝細胞癌的早期診斷指標之一[8-9]。根據(jù)之前的研究發(fā)現(xiàn)，OTC 與氨基甲酸乙酯的形成呈負相關性[10-11]，即OTC 的表達對EC 的形成有抑制作用，然而OTC 與EC 的直接關聯(lián)性未見研究報道。

短乳桿菌是一類革蘭氏陽性兼性厭氧菌，在含碳水化合物的動物、植物發(fā)酵產(chǎn)品以及溫血類動物的消化系統(tǒng)中十分常見，作為一般認為安全（Generally recognized as safe，GRAS） 的食品級微生物，在食品、工業(yè)、農(nóng)牧業(yè)及醫(yī)藥等領域中亦擁有重要的應用價值[12]。挖掘益生性乳酸菌源的酶類是目前人們的關注點之一。

本研究以短乳桿菌中的鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶為對象，通過基因克隆表達手段和Ni-NTA 純化方法，獲得大量高純度的OTC 酶，在黃酒發(fā)酵的不同階段直接添加到酒體中，研究其與EC 之間的相互作用，為挖掘其潛在的工業(yè)應用價值奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

短乳桿菌（Lactobacillus brevis）和質(zhì)粒pET-28a 由本實驗室保存，大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3），全試金公司。

細菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒DNA 提取試劑盒、PCR 產(chǎn)物回收試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、Ni-NTA 瓊脂糖樹脂、L-精氨酸、L-瓜氨酸、DL-鳥氨酸、茚三酮、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、硫酸卡那霉素（Kan），生工生物工程（上海）股份有限公司；T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHI、SalI，TaKaRa 公司；麥曲、酒藥，浙江塔牌黃酒公司。

1.2 方法

1.2.1 鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶的克隆 短乳桿菌OTC 酶的正向引物序列為：5’-cgcggatccATGAC TAAGGATTTTCGGGAAAATGTA-3’（下劃線為BamHI 識別序列），反向引物序列為：5’-acgcgtc gacTTAAGCTCGTGGAATGAATAAGTTACCT-3’（下劃線為SalI 識別序列）。以短乳桿菌的基因組DNA 為模板進行基因擴增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗證后進行純化。

1.2.2 重組表達質(zhì)粒的構建 采用限制性內(nèi)切酶BamHI 和SalI 分別對短乳桿菌OTC 基因片段和載體pET-28a 進行雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)試劑盒回收后，連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，涂布在含卡那霉素的LB 平板上，經(jīng)菌落PCR驗證后，篩選得到陽性克隆，并測序鑒定目的基因序列。

1.2.3 重組鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的誘導表達與分離純化 挑取陽性單菌落接種于5 mL 含卡那霉素的LB 培養(yǎng)基中，于37 ℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜。按1%（體積分數(shù)）接種量轉(zhuǎn)接于200 mL 的LB 培養(yǎng)基中，繼續(xù)于37 ℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)，至OD600nm達到0.6～0.8 時，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），于25 ℃，180 r/min 誘導培養(yǎng)過夜。離心收集菌體后，加入30 mL 緩沖液（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L Imidazole，pH 8.0）重懸菌體，隨后冰水浴超聲破碎細胞，于4 ℃，12 000 r/min 離心20 min，獲得上清液。參照Ni-NTA 瓊脂糖樹脂的使用說明方法，采用親和層析純化重組蛋白，隨后利用SDSPAGE 檢測蛋白純度及分子質(zhì)量。

1.2.4 黃酒釀造過程及試驗處理方法 以0.8 kg糯米為原料，30 ℃下浸米2 d，高溫蒸煮后冷卻，加入160 g 麥曲和1.6 g 酒藥及0.96 L 水，攪拌均勻后于28 ℃發(fā)酵。以不作任何處理的自然發(fā)酵黃酒作為對照組（CK），在發(fā)酵第5 天加入純化后的鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶（5D），在發(fā)酵第12 天加入相同濃度的鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶（12D），分析比較發(fā)酵過程中EC 及其相關代謝物的差異。

1.2.5 氨基甲酸乙酯的HPLC-FLD 測定 測定方法參照Fu 等[3]的報道，樣品與0.1 mL，1.5 mol/L鹽酸和0.2 mL，0.01 mol/L 占噸醇正丙醇溶液衍生后，通過高效液相色譜法檢測。以甲醇和水作為流動相，熒光檢測器激發(fā)波長233 nm，發(fā)射波長600 nm，梯度洗脫進樣。

1.2.6 尿素、瓜氨酸和鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶活的測定 尿素和瓜氨酸的檢測方法分別參照陳宜宜等[13]和Boyde 等[14]的文獻所述，通過與顯色劑的顯色反應來檢測發(fā)酵液中的含量。

取發(fā)酵液超聲15 min 破碎細胞，于4 ℃，12 000 r/min 離心20 min，取上清為原蛋白提取物。根據(jù)茚三酮顯色反應來測定OTC 酶活[15]，蛋白含量則采用Bradford 法進行測定。本試驗中OTC酶活定義為每分鐘水解1 mg 蛋白質(zhì)產(chǎn)生1 μmol鳥氨酸所需要的酶量為1 個酶活單位。

1.2.7 黃酒基礎理化品質(zhì)的檢測分析

1.2.7.1 黃酒中游離氨基酸的含量測定 采用日本日立L-8900 氨基酸分析儀進行測定。檢測原理為采用茚三酮作為衍生劑與氨基酸衍生后檢測分析。前處理方法為：取50 mL 黃酒樣品，加0.1 mol/L 鹽酸溶液超聲振蕩5 min，加5%磺酸水楊酸去除蛋白，離心后采用氮吹儀濃縮，加0.02 mol/L鹽酸2 mL，振蕩后過膜，上機檢測。

1.2.7.2 揮發(fā)性風味物質(zhì)的檢測 將8 mL 酒樣和0.2 g NaCl 加入頂空瓶中，50 ℃下磁力攪拌加熱15 min 后，將萃取頭插入頂空瓶中，繼續(xù)于50℃下加熱30 min 后進樣。GC 色譜條件：載氣為氮氣，流速為1 mL/min，無分流進樣；程序升溫：初始柱溫40 ℃，保持5 min，以5 ℃/mL 的速率升溫至230 ℃，保持10 min。進樣口溫度250 ℃，GC 解析時間2.5 min。質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源（EI）電子能量為70 eV，離子源溫度250 ℃，接口溫度250 ℃，檢測口電壓為350 V。掃描方式為全掃描，質(zhì)量范圍為35～350[16]。

1.2.7.3 電子舌味覺分析 相對于感官鑒評方法，電子舌實現(xiàn)了酸、苦、澀、咸、鮮和甜味等基本味及回味的數(shù)字化評價，具有結(jié)果穩(wěn)定且受外界影響小的優(yōu)點。

取適量待測樣品置于電子舌測試杯中，對其酸、甜、苦、澀、咸、鮮等基本味及回味進行測定，不同味覺與傳感器一一對應，所有傳感器分別在參比溶液和黃酒樣品中浸泡、洗滌，測得電勢值Vr和Vs，通過對Vs-Vr 值的計算，即可對黃酒的酸、甜、苦、澀、咸和鮮味等基本味和回味進行分析。每個樣品重復測試4～5 次，為減少系統(tǒng)誤差，選后3次納入數(shù)據(jù)分析[17]。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 每個試驗重復3 次，采用SPSS 軟件對數(shù)值進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒發(fā)酵中不同處理組氨基甲酸乙酯的變化規(guī)律研究

前期研究發(fā)現(xiàn)，OTC 與EC 的形成呈負相關性[10-11]，即OTC 的表達對EC 的形成有抑制作用，而OTC 與EC 的直接關聯(lián)性并未見任何報道。因此，本試驗分別在黃酒發(fā)酵的前期（發(fā)酵第5 天）和中期（發(fā)酵第12 天），添加相同濃度純化后的OTC 酶，以驗證其與EC 形成的直接相關性。如圖1所示，在發(fā)酵開始直至第12 天，試驗組EC 含量均顯著高于對照組，而在12 d 之后，試驗組12D的EC 含量表現(xiàn)出明顯的下降趨勢，直至發(fā)酵結(jié)束。而在發(fā)酵前期添加OTC 酶的試驗組5D 則顯著提高了EC 含量，出現(xiàn)這一變化趨勢的原因還有待進一步研究?？傮w而言，在恰當?shù)陌l(fā)酵階段，如發(fā)酵的中期，OTC 酶的添加對EC 形成確有抑制作用，然而若添加時間不合適，則有可能促進EC 的形成代謝。

圖1 黃酒發(fā)酵中不同處理組氨基甲酸乙酯的變化規(guī)律Fig.1 Changes of EC in different treatment groups during rice wine fermentation

2.2 黃酒發(fā)酵中不同處理組尿素和瓜氨酸的變化規(guī)律研究

有文獻表明，尿素和瓜氨酸是EC 形成最主要的2 種前體物。因此本試驗全程監(jiān)測了尿素和瓜氨酸的變化規(guī)律，如圖2所示。對照組發(fā)酵液中的尿素低于所有試驗組，這意味著胞內(nèi)被利用形成氨基甲酸乙酯的尿素含量較高，從而刺激了EC的產(chǎn)生。這一變化規(guī)律與圖1相符，也與前人報道一致[18]。

圖2 黃酒發(fā)酵中不同處理組尿素和瓜氨酸的變化規(guī)律Fig.2 Changes of urea and citrulline in different treatment groups during rice wine fermentation

OTC 酶的添加顯著影響了瓜氨酸的含量，故瓜氨酸的變化規(guī)律與尿素不同，在乳酸菌精氨酸脫亞胺酶的代謝途徑中，OTC 酶可以降解底物瓜氨酸轉(zhuǎn)化為鳥氨酸，因此試驗組瓜氨酸明顯低于對照組，尤以12D 組效果最佳。綜上，試驗組12D的尿素和瓜氨酸含量均低于對照組，前體物含量低，產(chǎn)生的EC 含量也隨之降低，這與本研究中EC的變化趨勢相符。

2.3 不同處理組OTC 酶活的變化趨勢分析

由于試驗組均人為添加了OTC 酶，雖偶有波動，但從整體趨勢來看，試驗組的OTC 比酶活均高于對照組，從理論上講，OTC 比酶活越高，則瓜氨酸的降解量就更高，這與圖2瓜氨酸的變化規(guī)律一致。

2.4 不同處理組對黃酒基礎理化品質(zhì)的影響

2.4.1 黃酒中游離氨基酸的含量分析 黃酒中富含多種氨基酸，被稱為“液體蛋糕”。除了為人體提供各種必需氨基酸外，還是黃酒風味物質(zhì)的重要組成部分，不同氨基酸口味不同，其含量差異會影響黃酒的口感及其風味[19]。本文共檢測了17 種游離氨基酸含量，如圖4所示?？梢钥闯?，黃酒中游離氨基酸脯氨酸和谷氨酸的含量較高，脯氨酸具有甘甜的口感，略帶一絲苦味，而谷氨酸對黃酒鮮味的貢獻較大。不同處理組樣品的氨基酸含量差異不大，說明黃酒中氨游離基酸的組成及含量主要受發(fā)酵原料和麥曲中微生物的影響，而加入OTC 酶對整體影響并不顯著。此外，相對而言，試驗組12D 的氨基酸含量略高于5D，說明OTC 酶的添加時間中期優(yōu)于早期。

2.4.2 黃酒中主要揮發(fā)性風味物質(zhì)的含量差異分析 黃酒的風味成分非常豐富，包括醇類、酯類、酸類、醛類及羰基化合物等[20]。表1選取了幾種具有代表性的醇酯類物質(zhì)進行定性分析比較，以揮發(fā)性風味物質(zhì)的總含量作為1，各成分含量為該成分與總含量的峰面積比值。當添加OTC 酶后，黃酒發(fā)酵產(chǎn)品中的主要風味物質(zhì)組成如表1所示，其中苯乙醇和異戊醇的含量較高，苯乙醇具有清甜的玫瑰花香，是一種重要的風味物質(zhì)。苯乙醇是由L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化而來，主要通過酵母的氨基酸代謝或者糖類的合成[21]。從表中可以看出，對幾種主要的醇類，試驗組的相對含量均高于對照組，且試驗組12D 具有更良好的風味特征。

圖3 黃酒釀造中不同處理組OTC 酶活的變化規(guī)律Fig.3 Changes of OTC activity in different treatment groups during rice wine fermentation

圖4 黃酒釀造中不同處理組游離氨基酸的變化規(guī)律Fig.4 Changes of amino acids in different treatment groups during rice wine fermentation

乙酯類物質(zhì)具有花香或果香，主要由酵母發(fā)酵產(chǎn)生，在黃酒發(fā)酵的風味物質(zhì)中占據(jù)很大比例。試驗組中酯類含量大體上均高于對照組，總體而言，試驗組的揮發(fā)性風味物質(zhì)無論是種類還是含量，相對于對照組均有所提高。可以推測，OTC 酶的加入對黃酒風味有一定的提升作用。

2.4.3 不同處理組的電子舌味覺分析 圖5為電子舌傳感器對3 個黃酒樣品的原始數(shù)據(jù)雷達圖，描述了酸、甜、苦、咸、鮮味和回味的相對測定值?？梢钥闯觯渲兴?、甜、咸味略有差異，其它味覺差異并不明顯。經(jīng)過OTC 酶添加的試驗組12D 的酸味及5D 的甜味均略高于對照組，且試驗組咸味的口感均略高于對照，由此可見，OTC 酶的添加對黃酒的口感味覺有一定程度的提升，而總體差異并不顯著。

表1 不同處理組黃酒揮發(fā)性風味物質(zhì)的變化規(guī)律Table 1 Changes of flavoring substances in different treatment groups during rice wine fermentation

圖5 不同處理組味覺分析雷達圖Fig.5 Radar taste analysis for different treatments

3 結(jié)論

黃酒作為我國傳統(tǒng)的釀造飲品，因其風味獨特且含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，具有廣闊的市場。根據(jù)之前的研究發(fā)現(xiàn)，OTC 酶與EC 呈現(xiàn)負調(diào)控的相關性[11]，本研究為驗證這一結(jié)論，采用基因工程手段從短乳桿菌中克隆并大量表達OTC 酶，經(jīng)Ni-NTA 純化后添加到黃酒的不同發(fā)酵階段。試驗結(jié)果表明，在發(fā)酵中期添加OTC 酶能顯著降低氨基甲酸乙酯的含量，且對主要前體物尿素和瓜氨酸均有影響，同時對黃酒樣品的理化品質(zhì)進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)氨基酸、揮發(fā)性風味物質(zhì)及味覺差異不明顯，說明鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶的添加不影響產(chǎn)品質(zhì)量，有可能應用于黃酒的實際釀造生產(chǎn)，降低致癌物質(zhì)的含量，具有良好的潛在應用價值。