湖羊瘤胃微生物葡聚糖酶基因GH5-47 的原核表達(dá)與酶學(xué)性質(zhì)研究

尉俏女，高德英，王佳堃，田 健，李 平，諸 輝，尹尚軍*，王 謙,*

（1.浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江寧波 315100；2.寧波希諾亞海洋生物科技有限公司，浙江寧波 315700；3.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院奶業(yè)科學(xué)研究所，浙江杭州 310058）

β-葡聚糖、木聚糖等非淀粉多糖是植物性飼料中重要的抗?fàn)I養(yǎng)因子，廣泛存在于植物細(xì)胞壁中。β-葡聚糖是指β-D-葡萄糖殘基通過β-1，3 和β-1，4-糖苷鍵連接形成的線性多聚糖，主鏈上的葡萄糖糖環(huán)數(shù)量通常為數(shù)百個(gè)以上[1]。植物性飼料中的非淀粉多糖（NSPs）在消化道環(huán)境中能與水分子相互作用變得黏稠，且多個(gè)分子間交聯(lián)構(gòu)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)進(jìn)一步增加黏度甚至形成凝膠，導(dǎo)致難以被單胃動(dòng)物或消化道功能發(fā)育不完全的幼齡反芻動(dòng)物消化、利用，造成飼料轉(zhuǎn)化率下降和養(yǎng)殖成本上升[2-4]。

飼用酶制劑因綠色、環(huán)保、高效等優(yōu)點(diǎn)成為飼料添加劑領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases，GHs）是降解NSPs 消除其抗?fàn)I養(yǎng)作用的重要酶類，主要包括β-葡聚糖酶、木聚糖酶等。其中，β-葡聚糖酶能夠水解β-葡聚糖主鏈上的β-1，3 和（或）β-1，4-糖苷鍵生成低聚寡糖或單糖。β-葡聚糖酶作為飼用酶制劑能有效降低植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、降低消化道內(nèi)容物黏度、改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)動(dòng)物個(gè)體生長和改善生產(chǎn)性能，在畜牧生產(chǎn)中具有重要應(yīng)用價(jià)值[5-6]。本課題組前期采用宏基因組文庫篩選[7]和宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序[8]技術(shù)從湖羊瘤胃微生物中獲得了大量碳水化合物活性酶（Carbohydrate-Active Enzymes，CAZymes）基因。本研究進(jìn)一步克隆、表達(dá)β-葡聚糖酶基因GH5-47，分析酶學(xué)性質(zhì)和多底物動(dòng)力學(xué)，為新型酶制劑研發(fā)建立基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 湖羊瘤胃微生物總RNA 由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌表達(dá)宿主E.coliBL21（DE3）感受態(tài)和EasyScript?First-Strand cDNA Synthesis SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；表達(dá)載體pET-28a（+）購自北京安諾倫北京生物科技有限公司；Super Pfx 聚合酶購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；ClonExpress?II One step Cloning Kit 購自南京 諾唯贊生物科技股份有限公司；卡那霉素（kanamycin，Kan）、標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）和Ni-NTA agarose 購自上海生工股份有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒和產(chǎn)物純化試劑盒購自杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；大麥葡聚糖和苔蘚地衣多糖購自Megazyme 公司，魔芋膠底物購自美國Sigma-Aldrich 公司。

1.2 構(gòu) 建GH5-47 重組大腸 桿菌利用EasyScript?First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 將2 μg 湖羊瘤胃內(nèi)容物總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以稀釋5 倍的cDNA 樣品為模板，利用Super Pfx 聚合酶和GH5-47基因引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（表1）。反應(yīng)條件：98℃2 min；98℃ 10 s，58℃ 20 s，72℃ 30 s，32 個(gè)循環(huán)；72℃ 8 min。PCR產(chǎn)品純化后與經(jīng)BamHI 和EcoRI 雙酶切的pET-28a（+）混 合，利用ClonExpress?II One step Cloning Kit 進(jìn) 行重組，之后熱激轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布含100 μg/mL Kan 的LB 平板（0.5% 酵母膏，1%蛋白胨，1% NaCl，2%瓊脂）。37℃培養(yǎng)14～16 h 后，利用載體引物T7-F 和T7-R 進(jìn)行菌落PCR。挑取陽性菌落轉(zhuǎn)接至4 mL 含100 μg/mL Kan 的LB 液體培養(yǎng)基。37℃，200 r/min 培養(yǎng)14～16 h 后，提取質(zhì)粒送至上海生工公司測(cè)序。將測(cè)序正確的重組菌種命名為BL21/pET28a/GH5-47。

1.3 GH5-47 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與純化 從LB 平板上挑取BL21/pET28a/GH5-47單菌落至5 mL 含100 μg/mL Kan 的LB 液體培養(yǎng)基。37℃，200 r/min 培養(yǎng)14～16 h后轉(zhuǎn)接至1 000 mL 含10 μg/mL Kan 的LB 培養(yǎng)基，37℃，200 r/min 震蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～1.0 時(shí)（3～4 h），添加終濃度為0.5 mmol/L 的IPTG，16℃，100 r/min 誘導(dǎo)培養(yǎng)14～16 h。10 000 r/min，4℃離心15 min 收集細(xì)胞，用200 mL PBS 緩沖液（137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4，pH 7.4）清 洗1 次，10 000 r/min 離心15 min。棄上清，沉淀用100 mL PBS 緩沖液重新懸浮，利用FB-2010 均質(zhì)機(jī)（上海勵(lì)途）中破碎10 min（流速6 L/h，壓力810 MPa，6℃）。10 000 r/min，4℃離心15 min，上清液即為重組GH5-47 蛋白粗酶液。之后，按課題組前期建立的方法，利用HisTrapTMFF 柱（GE Health.Bio-Sciences）對(duì)GH5-47蛋白進(jìn)行親和層析[9]。

1.4 SDS-PAGE 與酶譜分析 將40 μL 純化蛋白與20 μL 5×Loading Buffer 混合，煮沸5 min，10 000 r/min，4℃離心5 min。取上清用于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），濃縮膠為4%，分離膠為15%。酶譜分析是在凝膠中加入終濃度為0.5%的多糖底物（葡聚糖、地衣多糖或魔芋膠）。40 μL 純化蛋白與10 μL 5×Native loading Buffer 混合后直接用于電泳。電泳結(jié)束后，取出凝膠置于25% 異丙醇中復(fù)性3 次，每次20 min。之后，將凝膠在4℃的PBS 緩沖液中漂洗過夜。經(jīng)0.1%剛果紅染色30 min 后，利用0.5 mol/L NaCl 脫色至出現(xiàn)透明條帶。

1.5 最適反應(yīng)pH 酶活分析采用3,5 二硝基水楊酸（DNS）法[10]，以0.5% 葡聚糖為反應(yīng)底物測(cè)定GH5-47 對(duì)底物的還原糖釋放量。以葡萄糖-OD540 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算GH5-47 酶活。1 個(gè)酶活性單位（U）是指每分鐘釋放底物生成1 μmoL 還原糖所需的酶量。采用Bradford 法測(cè)定蛋白濃度[11]，以BSA-OD595建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算GH5-47 的蛋白濃度。

將15 μL GH5-47 純酶（約2.5 μg，下同）與60 μL分別用pH 2.2～10.0 緩沖液（檸檬酸/ 磷酸緩沖液pH 2.2～8.0；碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液pH 9.0～10.0 配制的0.5%葡聚糖底物在50℃下反應(yīng)10 min。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，對(duì)照組中加入15 μL 預(yù)先煮沸滅活的酶液，與0.5%葡聚糖反應(yīng)10 min。分別在試驗(yàn)和對(duì)照體系加入75 μL DNS 試劑，99℃保溫10 min。待冷卻至室溫后利 用SpectraMax M3 酶標(biāo)儀（Molecular Devices）于540 nm 下測(cè)定吸光值。以最高活性時(shí)的pH 為100%，計(jì)算各pH 條件下相對(duì)活性，設(shè)置4 組平行試驗(yàn)。

表1 引物序列

1.6 最適反應(yīng)溫度 將15 μL GH5-47 純酶與60 μL 0.5%葡聚糖底物混合，分別置于20～70℃，pH 5.0 下反應(yīng)10 min。按1.5 所述設(shè)置對(duì)照組。以最適反應(yīng)溫度下的酶活性為100%，計(jì)算各溫度條件下相對(duì)活性，設(shè)置4組平行試驗(yàn)。

1.7 pH 穩(wěn)定性 在最適溫度下，將15 μL GH5-47 純酶分別在30 μL 不同pH 緩沖液（pH 2.2～10.0）中，25℃下孵育1 h。加入30 μL 1%葡聚糖底物在最適條件下反應(yīng)10 min，按上述條件測(cè)定酶活。以未處理的酶活性為100%，計(jì)算各pH 條件下的殘余活性，設(shè)置4 組平行試驗(yàn)。

1.8 熱穩(wěn)定性 在pH5.0 緩沖體系中，將15 μL GH5-47純酶分別在50℃或60℃保溫1 h。在0、2、5、10、20、30、60 min 取樣，分別加入60 μL 0.5%葡聚糖底物，于最適條件下反應(yīng)10 min，按1.5 條件測(cè)定酶活。以未處理的酶活性為100%，計(jì)算各溫度條件下的殘余活性，設(shè)置4 組平行試驗(yàn)。

1.9 動(dòng)力學(xué)參數(shù) 分別配制0.1～10 mg/mL 的多糖底物（葡聚糖、地衣多糖、魔芋膠、微晶纖維素、刺槐豆及羧甲基纖維素底物），取純酶（約0.03 μg）在pH 5.0、50℃下反應(yīng)10 min，測(cè)定OD540，設(shè)置4 組平行試驗(yàn)。利用GraphPad Prism 8 軟件（San Diego，CA）計(jì)算米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速率（Vmax）。

1.10 金屬離子及EDTA 耐受能力 將15 μL GH5-47 純酶與30 μL 不同濃度（0.5～10 mmol/L）的金屬離子（K+、Al3+、Pb2+、Cu2+及Zn2+）或EDTA 混合，4℃孵育1 h后，各試驗(yàn)管中加入30 μL 1%葡聚糖底物，于pH 5.0、50℃下反應(yīng)10 min，按上述條件測(cè)定酶活。以未處理的酶活性為100%，計(jì)算各處理?xiàng)l件下的殘余活性，設(shè)置4 組平行試驗(yàn)。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析 利用在線工具Compute pI/Mw（https://web.expasy.org/compute_pi/）計(jì)算蛋白理論分子量和等電點(diǎn)，利用SignalP-5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽，利用Pfam（http://pfam.xfam.org/）分析蛋白功能結(jié)構(gòu)域，利用SWISS-MODEL（https://www.swissmodel.expasy.org/interactive）對(duì)蛋白進(jìn)行同源建模，利用BLASTp（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行序列相似性比對(duì)。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建是在CAZy 數(shù)據(jù)庫找出相應(yīng)家族已有結(jié)構(gòu)的酶（http://www.cazy.org/），并在PDB 數(shù)據(jù)庫（http//www.rcsb.orgl/）中下載目標(biāo)蛋白的序列文件，之后利用MEGA6.0 軟件下的Neighbor-Joining Tree 方法進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建。利用Graphpad Prism 8 繪制圖片，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Student’st-test。** 表示P<0.01；*** 表示P<0.001。

2 結(jié)果

2.1 葡聚糖酶GH5-47 序列分析 本研究從湖羊瘤胃微生物中擴(kuò)增得到一個(gè)開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）長度為1 098 bp 的葡聚糖酶基因GH5-47，共編碼365 個(gè)氨基酸。GH5-47 蛋白理論分子量和等電點(diǎn)分別為40.6 ku 和4.62。Pfam 分析顯示，該蛋白包含1 個(gè)GH5 家族催化域結(jié)構(gòu)，但未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽序列。SWISSMODEL 分析顯示，該蛋白的催化結(jié)構(gòu)域?yàn)椋é?α）8桶狀結(jié)構(gòu)，屬GH5 家族的典型特征。通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析可以發(fā)現(xiàn)，GH5-47 與硬壁菌門細(xì)菌（Firmicutesbacterium ADurb.BinA205）內(nèi)切葡聚糖酶（GenBank No：OPZ19512）或黃色瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）纖維素酶（GenBank No：WP_109726445 和WP_173322629）聚成一簇（圖1），氨基酸序列相似性分別為71.66%、66.57%和59.73%，而這些蛋白的功能與性質(zhì)均未被研究。

2.2 GH5-47 重組表達(dá) 重組工程菌BL21/pET28a/GH5-47，經(jīng)0.5 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)、超聲破碎和Ni-NTA agarose親和層析后，獲得分子量約為43 ku 的GH5-47 重組蛋白（圖2-A），這與其理論分子量和載體序列分子量之和相一致。酶譜試驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，重組GH5-47 對(duì)大麥葡聚糖、苔蘚地衣多糖和魔芋膠底物均具有降解作用（圖2-B）。

2.3 重組GH5-47 的酶學(xué)性質(zhì) 重組GH5-47 的最適反應(yīng)pH 為5.0、溫度為50℃（圖3-A 和B）。該蛋白在pH 4.0～6.0 較為穩(wěn)定，處理1 h 后仍能保持80% 以上活性（圖3-C）；同時(shí)，該蛋白在50℃以下較為穩(wěn)定，處理1 h 后，仍能保持81.81% 的殘余活性。當(dāng)溫度上升至60℃以上，則活性迅速喪失。在60℃下處理2、10、30 min，重組GH5-47 僅能保持80.68%、64.24%、18.17%的殘余活性（圖3-D）。

2.4 重組GH5-47 多底物動(dòng)力學(xué)分析 利用多種多糖底物分析重組GH5-47 的活性底物譜可以發(fā)現(xiàn)，該蛋白能高效催化葡聚糖和地衣多糖，Vmax分別為1111、895.8 μmol/（minmg protein）。此外，重組GH5-47 還對(duì)魔芋膠底物具有一定催化能力，Vmax 為15.15 μmol/（minmg protein）。而重組GH5-47 對(duì)微晶纖維素、刺槐豆膠和羧甲基纖維素則沒有催化作用（表2）。

圖1 GH5-47 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

圖2 重組GH5-47 SDS-PAGE 和酶譜分析

2.5 金屬離子和EDTA 對(duì)重組GH5-47 活性的影響 分析金屬離子和EDTA 對(duì)重組GH5-47 活性的影響可以發(fā)現(xiàn)（圖4），重組GH5-47 對(duì)K+和EDTA 的耐受能力較強(qiáng)，經(jīng)0.5～10 mmol/L K+或EDTA 處理1 h 后，仍能保持90% 以上殘余活性（P>0.05）。同時(shí)，0.5～1 mmol/L Al3+或0.5 mmol/L Pb2+不影響GH5-47 的催化活 性，但高濃度（5～10 mmol/L）情況下，GH5-47 活性降低（P<0.001）。此外，Cu2+或Zn2+均能抑制GH5-47 的活性（P<0.001）。0.5 mmol/L Zn2+卻能促進(jìn)GH5-47的催化作用，其原因暫不清楚。

3 討 論

草食動(dòng)物消化道微生物通常被認(rèn)為對(duì)植物性飼料具有高效降解能力。其中，瘤胃微生物菌群數(shù)量極其龐大，每克瘤胃內(nèi)容物中約包含1011個(gè)細(xì)菌、104～106個(gè)纖毛蟲和102～104個(gè)厭氧真菌[12]。這些微生物在反芻動(dòng)物日糧消化、利用過程中發(fā)揮主導(dǎo)作用，直接影響動(dòng)物生產(chǎn)效率[13-14]。然而，由于瘤胃等動(dòng)物消化道環(huán)境較為特殊，采用常規(guī)純培養(yǎng)技術(shù)很難獲取這類極端環(huán)境微生物。目前，僅有少數(shù)纖維降解菌等瘤胃微生物通過亨氏滾管[15-16]、厭氧培養(yǎng)箱和選擇性分離培養(yǎng)基[17]分離獲得。近年來，隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，研究人員采用多組學(xué)分析技術(shù)從奶牛[18]、湖羊[10]、駱駝[19]等反芻動(dòng)物的瘤胃或腸道微生物中篩選獲得大量的潛在CAZymes 基因。由于候選CAZymes 基因數(shù)量龐大，且部分基因存在序列不完整或信息缺失等情況，其中僅少數(shù)功能酶的性質(zhì)得到研究。

前期本課題組采用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在湖羊瘤胃微生物中發(fā)現(xiàn)15 個(gè)GHs 家族共2 151 個(gè)潛在CAZymes基因序列，并研究了與纖維素降解相關(guān)的GH5 家族中的Cel5A-h11 和Cel5A-28 的基本酶學(xué)性質(zhì)[8]。本研究通過系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹、BLAST 等序列分析發(fā)現(xiàn)，該CAZymes 基因資源庫中的葡聚糖酶GH5-47 催化結(jié)構(gòu)域?yàn)镚H5 家族典型的（β/α）8桶狀結(jié)構(gòu)，氨基酸序列與已報(bào)道的內(nèi)切葡聚糖酶相似度較低。除硬壁菌門細(xì)菌ADurb.BinA205 內(nèi)切葡聚糖酶（GenBank No:OPZ19512）外，絕大多數(shù)序列均來自黃色瘤胃球菌（GenBank No:WP_109726445 和WP_173322629），但氨基酸序列一致性均低于72%，推測(cè)GH5-47 為一種新型內(nèi)切葡聚糖酶。

圖3 重組GH5-47 的基本酶學(xué)性質(zhì)

表2 重組GH5-47 多底物動(dòng)力學(xué)分析（n=4）

圖4 金屬離子和EDTA 對(duì)重組GH5-47 活性的影響

本研究進(jìn)一步克隆并表征了該CAZymes 基因資源庫中的葡聚糖酶GH5-47，發(fā)現(xiàn)該酶對(duì)葡聚糖、地衣多糖底物發(fā)揮高效降解作用，并具備一定的魔芋膠底物催化作用。由于葡聚糖是大麥等谷物類植物細(xì)胞壁中的主要NSPs 之一，表明該酶對(duì)谷物類飼料具有較強(qiáng)降解、利用能力，進(jìn)一步提示從反芻動(dòng)物消化道中篩選飼用酶制劑是一種良好的策略[20]。酶學(xué)性質(zhì)分析表明，GH5-47 重組蛋白的最適反應(yīng)溫度為50℃，在50℃以下活性較為穩(wěn)定，而在60℃以上活性迅速下降。這與前期從瘤胃微生物中分離的纖維素酶[10]、木聚糖酶[20-21]等CAZymes 的熱穩(wěn)定性不佳相一致，推測(cè)這與反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)（38～41℃）環(huán)境相適應(yīng)的結(jié)果。然而，飼用酶制劑在實(shí)際應(yīng)用中通常需要制備成顆粒飼料，GH5-47蛋白雖然酶活性較高，但在制粒工藝（通常80℃以上）中會(huì)完全喪失活性。因此，為滿足工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的需求，可以采用基因工程、酶工程技術(shù)進(jìn)一步改造或修飾GH5-47 提示其熱穩(wěn)定性[22-25]。

4 結(jié) 論

本研究從湖羊瘤胃微生物中克隆了葡聚糖酶基因GH5-47，在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)。GH5-47 重組蛋白在pH4.0～6.0 較為穩(wěn)定，最適反應(yīng)pH 為5.0；在50℃以下較為穩(wěn)定，最適反應(yīng)溫度為50℃；對(duì)0.5～10 mmol/L K+或EDTA、0.5～1 mmol/L Al3+或0.5 mmol/L Pb2+表現(xiàn)較強(qiáng)耐受能力；GH5-47 對(duì)葡聚糖、地衣多糖和魔芋膠均具有催化作用，可用于后續(xù)新型飼用酶制劑的研發(fā)。