內(nèi)蒙古絨山羊Wnt10b 干擾載體的構(gòu)建及鑒定

吳子賢，吳 靜，王 榮，周 健，王瑞雪，劉俊陽，劉佳森，趙艷紅*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古烏蘭察布市商都縣職業(yè)技術(shù)學(xué)校，內(nèi)蒙古烏蘭察布 013450；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031）

在眾多動物纖維中，山羊絨因其良好的御寒功能和極好的柔軟親膚性受到廣大消費者喜愛，被譽為“纖維皇后”。隨著消費者對羊絨產(chǎn)品需求量的不斷增加，提高羊絨產(chǎn)量成為研究熱點。內(nèi)蒙古絨山羊是經(jīng)過自然選擇和人工選育的優(yōu)良地方品種，不僅肉質(zhì)鮮美而且還是異質(zhì)雙重毛被類型，經(jīng)濟價值頗高。全球40% 的羊絨產(chǎn)自內(nèi)蒙古，有“世界羊絨看中國，中國羊絨看內(nèi)蒙”一說[1-3]。盡管目前內(nèi)蒙古絨山羊羊絨產(chǎn)量龐大，但有粗毛過多影響絨毛生長的問題，因此在保證絨毛產(chǎn)量的同時提高絨毛質(zhì)量是亟待解決的問題[4]。

上述問題的解決，離不開對毛囊發(fā)育周期及組織結(jié)構(gòu)的深入研究。毛囊分為初級毛囊與次級毛囊，次級毛囊由初級毛囊分化而來[5]，絨山羊毛囊的周期變化一般指次級毛囊的季節(jié)性再生過程，一般而言，次級毛囊經(jīng)歷生長期（4—11 月）、退行期（12 月至次年1 月）、休止期（2—3 月）3 個時期[6]。毛囊生長發(fā)育受眾多信號通路調(diào)控，其中Wnt 信號通路在毛囊生長發(fā)育和分化中起到重要作用[7]。Wnt 分泌蛋白可刺激細(xì)胞中多種信號通路，作為生長調(diào)節(jié)因子影響細(xì)胞的增殖、分化以及遷移，許多研究證實經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路對毛囊生長的決定性作用[8-10]。Wnt10b作為通路中的核心影響因子[11-13]，在小鼠與兔子的表皮中均有大量表達(dá)[14-15]，常子麗[16]、王巖[17]等證實Wnt10b在內(nèi)蒙古絨山羊皮膚中有大量表達(dá)，但未有細(xì)胞水平驗證Wnt10b功能的研究。本文通過Wnt10b干擾載體的構(gòu)建以及轉(zhuǎn)染內(nèi)蒙古絨山羊耳皮膚細(xì)胞對Wnt10b基因的表達(dá)進行分析，旨在為后續(xù)通路中相關(guān)基因表達(dá)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 自內(nèi)蒙古呼和浩特市土左旗金萊牧業(yè)種山羊場選取1 歲齡內(nèi)蒙古絨山羊，取耳根部組織，常溫保存并快速帶回細(xì)胞實驗室清洗和酒精消毒，操作臺中通風(fēng)剪碎培養(yǎng)元代細(xì)胞。

1.2 實驗試劑 DPBS（Hyclone）、0.25%胰酶（Gibco）、高糖培養(yǎng)基DMEM/F12（含丙酮酸鈉，不含hepes、Hyclone）、青霉素和鏈霉素（雙抗，Gibco）、BI 胎牛血清（Biological Industries）、DMSO（日本和光劑）、DNA 內(nèi)切酶HindIII、BbsI（Peprotech）、無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA 提取試劑盒（OMEGA）、總RNA 提取試劑盒（RNAsimple Total RNA Kit，TIANGEN）、熒光定量染料（TB Green Premix Ex Taq II，TaKaRa）、實時定量PCR 試 劑（Taq PCR Mastermix kit，TIANGEN)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa）、DNA Maker DL500（TaKaRa）。

1.3 實驗方法

1.3.1 絨山羊Wnt10b基因的克隆 根據(jù)NCBI 上的山羊Wnt10b基 因CDS 序 列（XM_018047850.1）使 用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列為：F：5'-TGCTCACAAC CGCAACTC-3'；R：5'-GGTCTCGCTCGCAGAAG-3'。合成基因片段使用Taq PCR Mastermix kit（TIANGEN）試劑盒進行PCR 擴增，擴增體系為25 μL：cDNA 1 μL（100 ng/μL），上下游引物各1 μL（0.2 μmol/L），Gree Mix 23 μL（1×）。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 5 min，變性95℃ 30 s，退火60℃ 30 s（變性和退火運行30 個循環(huán)），延伸72℃ 10 min。

1.3.2 真核表達(dá)載體構(gòu)建 擴增物經(jīng)退火反應(yīng)后膠回收并連接到pSGU6-shRNA 模板，引物序列為：，shRNA 模板中的loop 結(jié)構(gòu)選用了TTCAAG AGA（方框內(nèi)）以避免形成終止信號，shRNA 的轉(zhuǎn)錄終止序列采用T6 結(jié)構(gòu)。正義鏈模板的5' 端添加了CACC（下劃線），與BbsI 酶切后形成的粘端互補；反義鏈模板的5' 端添加了AGCT（下劃線），與HindIII 酶切后形成的粘端互補；如果siRNA 的第一個堿基不是G，則在CACC 后補加一個G。

1.3.3 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 對質(zhì)粒進行測序驗證（上海生工生物工程股份有限公司完成），測序驗證的pSGU6-Wnt10b質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，-80℃冰箱中取出大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，冰浴至細(xì)胞解凍，加入10 μL 連接產(chǎn)物并混勻繼續(xù)冰浴30 min；轉(zhuǎn)到42℃水浴鍋中90 s；快速放回冰浴中3 min，加入800 μL不含抗生素的LB 液體培養(yǎng)基，蓋嚴(yán)離心管，搖床內(nèi)37℃、220 r/min 細(xì)菌復(fù)蘇45 min，產(chǎn)物均勻涂抹在含卡那霉素的固體LB 培養(yǎng)基上，置于37℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。

1.3.4 質(zhì)粒提取 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后挑單克隆抗體于200 mL 液體LB 培養(yǎng)基中繼續(xù)轉(zhuǎn)化16 h，所得菌液使用OMEGA無內(nèi)毒 素質(zhì)粒提取試劑盒大量提取，操作按說明書逐步完成，所得DNA 要求OD260/OD280在1.8～2.0，且濃度適用于后續(xù)實驗步驟，可在-20℃條件下長期保存。

1.3.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h 細(xì)胞鋪6 孔板，觀察細(xì)胞生長至80%左右時，使用Lipofectamine-3000 轉(zhuǎn)染試劑，按照說明書操作，每孔質(zhì)粒為5 μg，轉(zhuǎn)染3 h 后換為含血清的完全培養(yǎng)基，分別在轉(zhuǎn)染后12、24、48 h 使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染熒光情況。

1.3.6 RNA 提取及qRT-PCR 轉(zhuǎn)染48 h 后使用Trizol將所有細(xì)胞提取RNA，后續(xù)均使用TaKaRa 公司試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR 反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄條件為：變性：37℃ 15 min，復(fù)性：85℃ 5 s，延伸：4℃。選β-actin 為內(nèi)參基因，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列見表1，qRT-PCR 使用Applied Biosystems 7500，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，39 個循環(huán)；95℃變性15 s，60℃退火60 s，95℃延伸15 s。以轉(zhuǎn)染48 h 的細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞RNA 反轉(zhuǎn)錄所得cDNA 為模板，利用qRT-PCR 檢測Wnt10b相對表達(dá)量，看家基因選為β-actin，其中對照組為未處理細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)先用Excel 2010 參照2-ΔΔct法計算處理，結(jié)果用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示，之后采用SPSS 25.0 軟件中的單因素ANOVA 方差檢驗分析，P<0.01 為差異極顯著，P<0.05 為差異顯著。

表1 基因擴增引物序列表

2 結(jié)果與分析

2.1 原代耳皮膚細(xì)胞生長狀態(tài) 原代耳皮膚細(xì)胞在前3 d貼壁速率較慢，前期切忌晃動培養(yǎng)瓶影響貼壁速率，第5 天開始貼壁，第7 天時出現(xiàn)島嶼狀分布生長狀態(tài)，第9 天時生長密度達(dá)到80%，且呈鵝卵石狀，傳代后第3天為指數(shù)生長期，傳至第5 代時細(xì)胞增殖速率降低。如圖1 中達(dá)到第9 天細(xì)胞密度時，可進行細(xì)胞傳代。

圖1 原代耳皮膚細(xì)胞增殖（×100）

2.2 重組質(zhì)粒 利用全基因合成法獲得絨山羊Wnt10b基因的CDS 全長片段，經(jīng)過PCR 擴增，將選取的pSGU6 載體與目的基因進行酶切處理，使用PCR 儀將其結(jié)合，最終產(chǎn)物為重組質(zhì)粒。連接物中加入卡那霉素抗性篩選標(biāo)記物，載體帶有GFP 綠色熒光標(biāo)記物，熒光標(biāo)記有利于后續(xù)實驗確認(rèn)細(xì)胞是否轉(zhuǎn)染成功。所構(gòu)建的pSGU5-Wnt10b載體線性結(jié)構(gòu)如圖2 所示。

圖2 重組質(zhì)粒pSGU5-Wnt10b 的線性結(jié)構(gòu)

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 利用脂質(zhì)體法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至耳皮膚細(xì)胞中，在細(xì)胞貼壁24 h 后加入混合質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染試劑，期間避光培養(yǎng)3 h 后換為無轉(zhuǎn)染試劑的普通培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)染前12 h，綠色熒光較弱，24 h 后出現(xiàn)形態(tài)分布，但細(xì)胞形態(tài)模糊，48 h 后轉(zhuǎn)染熒光強度最高，圖3 為轉(zhuǎn)染48 h 后暗場細(xì)胞熒光圖和明場細(xì)胞狀態(tài)圖，轉(zhuǎn)染效率達(dá)50%以上，處理細(xì)胞可用于后續(xù)提取RNA。

圖3 pSGU6-Wnt10b 轉(zhuǎn)染絨山羊皮膚細(xì)胞

2.4 實時熒光定量PCR 由圖4 可知，轉(zhuǎn)染pSGU6-Wnt10b后的細(xì)胞與未處理細(xì)胞相比Wnt10b基因表達(dá)量顯著降低，表明質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)染至耳皮膚細(xì)胞中，有效降低了Wnt10b基因的表達(dá)，可用于后續(xù)實驗的研究。

圖4 qRT-PCR 結(jié)果

3 討 論

在前人研究成果中，多利用皮膚組織進行體內(nèi)研究實驗，結(jié)果顯示影響毛囊生長的重要通道為Wnt[15]、BMP[17]、FGF[18]等基因通路，在多種動物體內(nèi)已驗證這些基因的蛋白表達(dá)調(diào)控毛囊的產(chǎn)生和發(fā)育，但在體外培養(yǎng)細(xì)胞中尚有部分基因未得到實驗驗證。由于耳皮膚細(xì)胞生長力旺盛且易獲得，有助于后續(xù)瞬時轉(zhuǎn)染處理，瞬時轉(zhuǎn)染因其時效短、效率高等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用，因此本研究選用內(nèi)蒙古絨山羊耳皮膚細(xì)胞對Wnt10b干擾載體進行驗證。

在Wnt通路中眾多信號相互作用，有研究證明，在皮膚中毛囊的動態(tài)形成過程中，Wnt信號在表皮層就已開始作用，在表皮層缺乏Wnt信號的前提下毛乳頭發(fā)育不正常，表明Wnt信號通過表皮信號誘導(dǎo)真皮層毛乳頭的形成，其中Wnt10b在毛基板形成中的作用顯著[18]。對小鼠、兔子的研究發(fā)現(xiàn)，Wnt10b基因功能失活或表達(dá)沉默會導(dǎo)致毛被異常生長的狀況[19]。將Wnt10b添加在小鼠的毛乳頭細(xì)胞中，經(jīng)過100 d 的毛囊發(fā)育周期后，硫酸軟骨素蛋白（versican）及淋巴增強因子（Lef-1）等毛囊生長相關(guān)基因均顯著性表達(dá)[20]，盡管Wnt10b及其信號通路在毛囊發(fā)育中的作用研究已取得很大進展，然而仍有一些問題尚未解決，進一步驗證Wnt10b的生物學(xué)功能對其在經(jīng)濟動物生產(chǎn)中的應(yīng)用具有重要意義。近年來有學(xué)者使用免疫組化確定Wnt10b在內(nèi)蒙古絨山羊皮膚毛囊中蛋白表達(dá)位置，通過PCR 檢測毛囊3 個階段中Wnt10b表達(dá)量差異[21]，但尚未有在細(xì)胞水平使用基因干擾手段驗證該基因在毛囊發(fā)育中的作用。對Wnt10b基因進行功能驗證不僅僅是對此基因的研究，同時也對此信號通路中其他基因的研究提供基礎(chǔ)，Wnt10基因表達(dá)抑制可能會影響對β-catenin、Lef-1等因子的控制，本研究對內(nèi)蒙古絨山羊耳皮膚細(xì)胞中的Wnt10b基因進行干擾處理，為后續(xù)驗證通路中受Wnt10b影響的基因以及個體水平的研究提供合適的供體細(xì)胞，為解決內(nèi)蒙古絨山羊羊絨產(chǎn)量及質(zhì)量改良的問題提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究選用內(nèi)蒙古絨山羊耳皮膚細(xì)胞對Wnt10b干擾載體進行驗證，成功構(gòu)建載體并將其轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，利用實時熒光PCR 技術(shù)驗證細(xì)胞中Wnt10b基因表達(dá)量，其表達(dá)量相對于未處理細(xì)胞有極顯著差異，說明pSGU6-Wnt10b干擾載體可有效干擾細(xì)胞中基因表達(dá)，且成功轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，研究結(jié)論為后續(xù)研究毛囊生長相關(guān)信號通路提供了基礎(chǔ)。