滅活酵母培養(yǎng)物對育肥羔羊瘤胃發(fā)酵和細(xì)菌群落及免疫指標(biāo)的影響

曹文新，李艷琴，紀(jì)守坤，嚴(yán) 慧，段春輝，郭云霞，劉月琴，張英杰，王 康，尹雪姣

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北保定 071000）

羔羊育肥周期短、效益好，是我國畜牧業(yè)的朝陽產(chǎn)業(yè)[1]。目前，對于集約化飼養(yǎng)的育肥羔羊來說，高精料日糧成為一種典型的營養(yǎng)策略，但飼喂高精料在提高生長性能的同時，也會發(fā)生腹瀉、瘤胃酸中毒等營養(yǎng)性疾病[2]。隨著養(yǎng)羊業(yè)的不斷發(fā)展，飼料添加劑的應(yīng)用逐漸廣泛。酵母培養(yǎng)物（Yeast Culture，YC）作為一種新型飼料添加劑，其含有大量的代謝產(chǎn)物、酵母細(xì)胞壁及培養(yǎng)基成分，可以改變瘤胃微生物群落，調(diào)節(jié)瘤胃內(nèi)環(huán)境，提高動物免疫與抗氧化能力，從而提高生長性能，已被廣泛應(yīng)用于奶牛和肉牛養(yǎng)殖中[3-5]，對反芻動物的高效生產(chǎn)及機(jī)體健康具有重要意義。關(guān)于YC 在羔羊育肥中應(yīng)用，Opsi 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，高精料日糧中添加滅活釀酒酵母對pH 和總揮發(fā)性脂肪酸無顯著影響，但對乙酸、丙酸、丁酸和戊酸影響顯著。閆佰鵬等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在不同淀粉來源（精粗比6.5:3.5）育肥湖羊日糧中添加1%活性YC 對瘤胃發(fā)酵參數(shù)無顯著影響。目前，關(guān)于YC 在不同日糧結(jié)構(gòu)下對育肥羔羊瘤胃pH 和揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的影響的研究較多，滅活酵母培養(yǎng)物不同添加量對高精料條件下羔羊瘤胃發(fā)酵及免疫抗氧化性能的研究鮮有報道。因此，本試驗旨在研究高精料羔羊育肥條件下不同水平的滅活酵母培養(yǎng)物對羔羊瘤胃發(fā)酵、瘤胃細(xì)菌多樣性、抗氧化和免疫性能的影響，為YC 在育肥羔羊日糧的利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 滅活酵母培養(yǎng)物由德國萊博有限公司提供，其營養(yǎng)成分：粗蛋白質(zhì)≥24%，粗脂肪≥3.2%，粗纖維≥11%，粗灰分≤6.4%，賴氨酸≥1.6%，蘇氨酸≥1.2%，蛋氨酸≥0.4%。

1.2 試驗設(shè)計與日糧 選擇體重（35.65±1.84）kg 的3.5月齡健康公羔（杜泊和湖羊雜交F1）80 只，隨機(jī)分為4 組，每組5 個重復(fù)，每個重復(fù)4 只羊。在飼喂基礎(chǔ)飼糧的同時分別添加滅活酵母培養(yǎng)物 0（CON 組）、5（YCL 組）、10（YCM 組）、15g/（只d）（YCH 組），預(yù)試期7 d，正試期60 d。

基礎(chǔ)飼糧的配制參考NRC（2007）[8]推薦的35kg羔羊日增重300g 營養(yǎng)需要量確定日糧營養(yǎng)水平，配方組成見表1，以全混合日糧（TMR）形式飼喂。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)成分(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 飼養(yǎng)管理 試驗前圈舍用具消毒，試驗羊打耳號，并進(jìn)行相關(guān)免疫及驅(qū)蟲處理，每天08:00 和15:00 飼喂，自由飲水。為使試驗羊采食到設(shè)計量YC，先將各組YC 與少量TMR 料混勻，使試驗羊采食完畢，其余TMR 料自由采食。每天早晨飼喂前打掃圈舍，保障環(huán)境清潔衛(wèi)生。

1.4 樣品采集與處理

1.4.1 瘤胃液采集與處理 試驗第60 天，每組隨機(jī)選取10 只羊（每個重復(fù)2 只羊），晨飼前，口腔插管采集瘤胃液6 mL，立即測定pH；采集2 mL 分裝到凍存管中，液氮保存，備測微生物區(qū)系；另取4 mL 濾液，10 000 ×g 離心10 min，移取1.5 mL 上清液至無菌離心管中，加0.15 mL 25%偏磷酸，渦流混合器搖勻，靜置30 min，10 000×g 離心15 min，取上清液-20℃保存，用于測定VFA。

1.4.2 血液樣品的采集與處理 試驗第60 天，每組隨機(jī)選取10只羊（每個重復(fù)2只羊）于晨飼前頸靜脈無菌采血，置于5 mL 促凝管中，離心機(jī)3 000×g 離心10 min。將離心好的血清分裝到1.5 mL 無菌離心管中，置于-20℃冰箱保存，用于測定免疫及抗氧化指標(biāo)。

1.5 指標(biāo)測定及方法

1.5.1 瘤胃液pH 和VFA 濃度的測定 使用Sartorius PB-10型pH 計測定瘤胃液pH。采用外標(biāo)法利用Agilent-7890A氣相色譜儀（美國Agilent Technologies）測定瘤胃液VFA 濃度[9]。

1.5.2 瘤胃微生物測定分析 瘤胃液高通量測序，參照DNA Kit（Omega Bio-tek,Norcross,GA，U.S.）試 劑盒說明書提取樣本DNA，用細(xì)菌16s rDNA V3-V4 區(qū)引物擴(kuò)增PCR，利用IlluminaMiseq PE300 高通量測序平臺測序。下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過QIIME（v1.8.0）軟件過濾、拼接、去除嵌合體，去除低質(zhì)量序列[10]。根據(jù)barcodes歸類各處理組序列信息，物種分類的OTU（Operational Taxonomic Units）序列相似性設(shè)置為97%。對比silva數(shù)據(jù)庫，得到每個OTU 對應(yīng)的物種分類信息[11]。再利用Mothur 軟件（version 1.3.1.2）進(jìn)行α多樣性分析?；贘accard 距離，使用R（v3.1.1）軟件進(jìn)行β多樣性分析[12-13]。

1.5.3 免疫及抗氧化指標(biāo)測定 采用酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）測定[14]血清中免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、α干擾素（IFN-α）、白介素6（IL-6）以及總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA），試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.6 統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)利用Excel（2007）進(jìn)行初步整理，然后利用SPSS21.0 進(jìn)行Duncan's 法多重比較，并對滅活酵母培養(yǎng)物添加水平進(jìn)行線性和二次分析，瘤胃細(xì)菌的分析通過R 軟件Vegan（3.3.2）包進(jìn)行。數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，統(tǒng)計顯著性水平為P<0.05，具有顯著性趨勢為0.05

2 結(jié)果

2.1 滅活酵母培養(yǎng)物對羔羊瘤胃液pH 及VFA 的影響 由表2 可知，pH 在各組間差異不顯著，隨著滅活酵母培養(yǎng)物添加量增加，乙酸濃度呈先降低后升高的二次曲線變化（P<0.05），YCH 組丙酸、TVFA 濃度較YCM 組和CON 組升高（P<0.05），并存在線性和二次增加（P<0.05），丁酸濃度呈一次線性增加（P<0.05），各組乙酸、丙酸及丁酸的摩爾比例和乙酸/丙酸比差異不顯著。

2.2 滅活酵母培養(yǎng)物對羔羊瘤胃細(xì)菌多樣性的影響

2.2.1 不同滅活酵母培養(yǎng)物添加量對羔羊瘤胃細(xì)菌α多樣性的影響 由圖1 可以看出，各試驗組覆蓋率（Good Coverage）均在0.99 以上，表明測序深度能夠真實反映瘤胃微生物群落。各組間Chao1 指數(shù)、觀測到的物種數(shù)（Observed Species）、香農(nóng)指數(shù)（Shannon）、辛普森指數(shù)（Simpson）和PD 值均無顯著差異。

2.2.2 不同滅活酵母培養(yǎng)物添加量對羔羊瘤胃細(xì)菌菌群豐度的影響 由表3 可知，在門水平上，厚壁菌門和擬桿菌門是各組試驗羊瘤胃內(nèi)優(yōu)勢菌群；YCH 組擬桿菌門豐度顯著高于CON 組和YCL 組，呈線性顯著升高；纖維桿菌門線性增加，厚壁菌門、變形菌門、螺旋體門和軟壁菌門豐度在各試驗組間無顯著差異。

表2 不同滅活酵母培養(yǎng)物添加量對羔羊瘤胃液pH 及VFA 的影響

圖1 不同滅活酵母培養(yǎng)物添加量對羔羊瘤胃細(xì)菌α 多樣性的影響

由表4 可知，在屬水平上，各組試驗羊瘤胃中普氏菌屬為優(yōu)勢菌。普氏菌屬1、克里斯滕森菌、毛螺菌屬、月形單胞菌屬豐度各組間均無顯著差異（P>0.05）；YCH 組和YCL 組理研菌屬豐度顯著低于CON 組和YCM 組（P<0.05）；瘤胃菌屬豐度隨滅活酵母培養(yǎng)物添加量的增加呈一次線性增加（P<0.05）。

2.2.3 不同滅活酵母培養(yǎng)物添加量對羔羊瘤胃細(xì)菌β多樣性的影響 由圖2 可知，基于Jaccard 距離的PCoA 分析顯示，橫坐標(biāo)的貢獻(xiàn)率為68.3%，縱坐標(biāo)貢獻(xiàn)率為23.8%，兩坐標(biāo)軸共解釋了不同細(xì)菌群落差異的92.1%，YCH 組與CON 組組間菌群結(jié)構(gòu)差異顯著（ANOSIM，P<0.05），其他組間差異不顯著（ANOSIM，P>0.05）。

2.3 滅活酵母培養(yǎng)物對羔羊機(jī)體抗氧化能力的影響 由表5 可知，YCH 和YCL 組T-AOC 濃度顯著高于CON和YCM 組；YCL、YCM、YCH 組SOD 活性顯著高于CON 組，并存在線性和二次增加（P<0.05）；YCH 組MDA 含量顯著低于CON 組；各試驗組間GSH-Px 含量差異不顯著。

2.4 滅活酵母培養(yǎng)物對羔羊機(jī)體免疫指標(biāo)的影響 由表6 可知，YCM 和YCH 組IgM、IgG、IgA 含量顯著高于CON 組；隨著滅活酵母培養(yǎng)物添加量的增加，IgM、IgG 含量線性增加（P<0.05）；各組間IFN-α、IL-6 含量無顯著差異。

3 討 論

3.1 滅活酵母培養(yǎng)物對羔羊pH 及VFA 的影響 pH 是評價羔羊瘤胃健康的重要直觀因素。高精料日糧容易降低瘤胃pH，影響營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收[15]。本試驗中，添加滅活酵母培養(yǎng)物后，盡管統(tǒng)計上未達(dá)到顯著水平，但可以看到添加滅活酵母培養(yǎng)物一定程度提高了瘤胃pH，與周傳社等[16]在湘東黑山羊添加YC 的結(jié)果一致。目前，就YC 在高精料條件下能否對瘤胃pH 造成影響，研究結(jié)果并不一致。Lascano 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在荷斯坦奶牛高精料日糧中添加YC，發(fā)現(xiàn)YC 有穩(wěn)定瘤胃pH的功能；郭永清等[18]研究結(jié)果表明，日糧中添加活性YC 組斷奶犢牛pH 較未添加組未發(fā)生顯著變化。向洋[19]和Liu 等[20]分別在奶牛和綿羊高精料日糧中添加無活性YC，發(fā)現(xiàn)未對瘤胃pH 產(chǎn)生顯著影響。前人研究推測，添加滅活酵母培養(yǎng)物后，瘤胃pH 未發(fā)生顯著變化，可能是滅活酵母培養(yǎng)物含有的氨基酸、肽、維生素和有機(jī)酸等營養(yǎng)物質(zhì)可以刺激瘤胃內(nèi)乳酸利用菌的生長，從而將過多的乳酸轉(zhuǎn)變?yōu)槎替溨舅幔瑴p少乳酸在瘤胃內(nèi)的蓄積，起到穩(wěn)定瘤胃pH 的作用[16,20]。本試驗中，盡管羔羊采食高精料日糧，各組瘤胃液pH 均較高，推測可能與瘤胃液采集于晨飼前，非結(jié)構(gòu)性碳水化物已得到充分消化，瘤胃pH 較穩(wěn)定有關(guān)。

表3 不同滅活酵母培養(yǎng)物添加量對羔羊瘤胃細(xì)菌菌群組成的影響（門水平） %

表4 不同滅活酵母培養(yǎng)物添加量對羔羊瘤胃細(xì)菌菌群組成的影響（屬水平） %

圖2 基于Jaccard 距離的PCoA 分析

表5 不同滅活酵母培養(yǎng)物添加量對羔羊機(jī)體抗氧化能力的影響

表6 不同滅活酵母培養(yǎng)物添加量對羔羊免疫指標(biāo)的影響

瘤胃VFA 的含量和組成是評價反芻動物瘤胃發(fā)酵能力的直接指標(biāo)。反芻動物60%的消化能由VFA 提供，而乙酸、丙酸、丁酸約占VFA 含量的95%[20]。YC 可以提高瘤胃發(fā)酵過程中VFA 濃度[4,21-23]。本試驗中，添加滅活酵母培養(yǎng)物后，乙酸呈二次曲線變化、丁酸線性顯著增加、YCH 組丙酸和TVFA 含量較CON 組顯著增加，說明滅活酵母培養(yǎng)物能夠提高VFA 含量。滅活酵母培養(yǎng)物可以提高VFA 含量，一方面可能是滅活酵母培養(yǎng)物含有的氨基酸、肽類、有機(jī)酸等代謝產(chǎn)物增加了高精料日糧下羔羊唾液的分泌，促進(jìn)了瘤胃發(fā)酵機(jī)能，從而改善了淀粉等的利用[15,21-23]；另一方面可能是滅活酵母培養(yǎng)物穩(wěn)定了瘤胃pH，減少了高精料條件下乳酸在瘤胃的蓄積，為微生物的生長提供了適宜的環(huán)境，保障了羔羊瘤胃正常發(fā)酵[21]。本試驗中，YCM 組乙酸、丙酸含量較YCL 和YCH 組低，可能是由動物個體差異引起，具體原因需進(jìn)一步研究。

3.2 滅活酵母培養(yǎng)物對羔羊瘤胃細(xì)菌多樣性的影響 反芻動物瘤胃微生物種類復(fù)雜，數(shù)量龐大，每克瘤胃食糜中約含1011個細(xì)菌，是一個相對穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng)[24]，因此常使用α多樣性和β多樣性反映群落內(nèi)物種多樣性和群落間物種相似性[25]。本試驗添加滅活酵母培養(yǎng)物后，瘤胃細(xì)菌α多樣性未產(chǎn)生顯著差異，但瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，與樸光赫[21]研究結(jié)果一致。這可能是試驗所用滅活酵母培養(yǎng)物經(jīng)過低溫滅活，雖然不含活性酵母細(xì)胞，但其中的氨基酸、脂類、肽、酶、有機(jī)酸、寡糖、維生素以及未知生長因子等可以選擇性調(diào)控瘤胃特定微生物生長，從而影響瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)[26]。

在門水平上，大量研究表明，厚壁菌門和擬桿菌門是反芻動物瘤胃優(yōu)勢菌群[27]。擬桿菌能夠協(xié)助宿主降解非纖維物質(zhì)（蛋白質(zhì)和多糖），促進(jìn)該類物質(zhì)的消化吸收，纖維桿菌門可以分解纖維素使動物能夠消化吸收[28]。甄玉國等[29]研究表明，YC 組綿羊瘤胃擬桿菌門相對豐度高于未添加組。本試驗中，YCH 組擬桿菌門的相對豐度顯著高于CON 組，纖維桿菌門豐度隨滅活酵母培養(yǎng)物添加量的增加線性增加。高精料日糧中，淀粉含量高，擬桿菌能夠降解多糖，而滅活酵母培養(yǎng)物可以穩(wěn)定瘤胃pH，防止高精料日糧造成的瘤胃內(nèi)環(huán)境改變，為擬桿菌和纖維桿菌的生長繁殖提供適宜環(huán)境。

在屬水平上，本研究發(fā)現(xiàn)，各試驗組普氏菌屬均占主要地位，當(dāng)滅活酵母培養(yǎng)物添加量為15g/（只d）時，普氏菌屬和月形單胞菌屬相對豐度有所增加，YCH 組和YCL 組理研菌屬相對豐度顯著低于YCM 組和CON組，同時隨著滅活酵母培養(yǎng)物添加量的增加，瘤胃菌屬相對豐度線性增加。普氏菌屬和瘤胃菌屬可分解纖維生成乙酸，這2 種菌屬相對豐度的增加有利于瘤胃中乙酸的生成；理研菌屬屬于一種有害菌，與短鏈脂肪酸的產(chǎn)生有關(guān)；月形單胞菌屬和少數(shù)瘤胃菌屬均可參與瘤胃丙酸的生成。本試驗發(fā)現(xiàn)，添加滅活酵母培養(yǎng)物組月形單胞菌屬豐度有所增加。Jiang[30]在泌乳牛日糧中添加滅活酵母培養(yǎng)物亦增加了月形單胞菌屬的豐度。高精料日糧能夠促進(jìn)上述微生物的增殖，導(dǎo)致丙酸的生成增多[31]，這與本試驗丙酸增加的結(jié)果相對應(yīng)，同時滅活酵母培養(yǎng)物可促進(jìn)乳酸利用菌增殖從而發(fā)揮穩(wěn)定瘤胃pH 的作用，為纖維分解菌、乙酸和丙酸生成菌的增殖提供了適宜的環(huán)境[31]。

3.3 滅活酵母培養(yǎng)物對羔羊機(jī)體抗氧化性能的影響T-AOC、GSH-Px、SOD、MDA 是反映機(jī)體抗氧化能力的主要指標(biāo)[32]。本試驗中，滅活酵母培養(yǎng)物添加量為15g/（只d）時，顯著提高了羔羊血清中T-AOC 和SOD活性，降低了MDA 含量。YC 可以提高機(jī)體抗氧化性能，如王衛(wèi)正[33]研究發(fā)現(xiàn)在奶牛日糧中添加3%YC 后血清SOD 活性極顯著提高，T-AOC 顯著提高；張愛忠[34]在絨山羊高精料日糧中添加YC，發(fā)現(xiàn)血清T-AOC 和SOD 活性顯著提高，MDA 含量顯著降低，GSH-Px 活性有所提高。滅活酵母培養(yǎng)物在生產(chǎn)過程中會釋放大量代謝產(chǎn)物以及酵母細(xì)胞壁成分，包括豐富的維生素（維生素C、維生素E、β-胡蘿卜素等）、寡糖、酶、谷胱甘肽及未知生長因子，維生素C、維生素E 及β-胡蘿卜素等均可不同程度清除自由基，提高機(jī)體抗氧化能力[34]。同時，滅活酵母培養(yǎng)物中含有GSH，可以提高肉羊體內(nèi)GSH 濃度，GSH-Px 可以利用GSH 作為還原劑促進(jìn)過氧化氫、有機(jī)氫過氧化物和脂質(zhì)過氧化物的還原，保護(hù)細(xì)胞免受抗氧化損傷[32,34]。另外，滅活酵母培養(yǎng)物能夠改善瘤胃內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)瘤胃發(fā)酵，從側(cè)面反映了其對動物抗氧化能力的影響[34]。本試驗中，YCM 組的T-AOC和GSH-Px 含量較YCH 組和YCL 組低，可能是由動物個體差異引起，具體原因需進(jìn)一步研究。

3.4 滅活酵母培養(yǎng)物對羔羊機(jī)體免疫功能的影響 免疫球蛋白是由漿細(xì)胞產(chǎn)生，并且具有抗體活性的蛋白質(zhì)，具有抗細(xì)菌、抗病毒、抗外毒素和激活補(bǔ)體的功能[35]。本試驗中，滅活酵母培養(yǎng)物顯著提高了羔羊血清中IgM、IgG 和IgA 含量，免疫球蛋白含量升高說明滅活酵母培養(yǎng)物可以提高機(jī)體免疫能力，發(fā)揮作用的可能是滅活酵母培養(yǎng)物中含有的甘露寡糖和β-葡聚糖，它們具有激活機(jī)體特異性和非特異性免疫的作用[36]。王蘭惠[36]試驗表明，在綿羊瘤胃灌注滅活酵母培養(yǎng)物后21 d，血清中IgG 含量極顯著升高，IgA 含量顯著升高。張愛忠[34]研究發(fā)現(xiàn)，YC 可以顯著提高血清IgA 含量，IgG 含量增加，但無顯著差異。另外，滅活酵母培養(yǎng)物中含有小肽、氨基酸、有機(jī)酸和一些未知生長因子等豐富的代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物可以促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收，參與機(jī)體營養(yǎng)代謝活動，從而提高機(jī)體免疫功能[37]。

細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生的一類多功能蛋白質(zhì)多肽分子，包括白細(xì)胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子、集落刺激因子等，可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)抗病毒介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和造血等多種生物學(xué)功能，其中IL-6 在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，IFN-α具有抗病毒作用[35]。前人研究表明，高精料日糧下，瘤胃中氨基酸和糖代謝發(fā)生改變，提高了脂多糖在肝臟的蓄積，促使血液中促炎因子、急性期蛋白濃度迅速升高，滅活酵母培養(yǎng)物中含有的甘露寡糖、有機(jī)酸和氨基酸等代謝產(chǎn)物可能會降低腸道脂多糖含量，從而降低炎癥反應(yīng)，提高機(jī)體免疫功能[38]。但本試驗結(jié)果顯示，添加滅活酵母培養(yǎng)物后，血清中IL-6和IFN-α含量均未發(fā)生顯著變化，這可能與本試驗日糧并未引起炎癥反應(yīng)有關(guān)。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果表明，滅活酵母培養(yǎng)物添加量為15g/（只d）時，淀粉和纖維分解相關(guān)細(xì)菌的相對豐度升高，瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，VFA 產(chǎn)量顯著增加，促進(jìn)了瘤胃發(fā)酵，同時提高了羔羊免疫及抗氧化性能。