劉鈺瑩，張妍，汪哲遠(yuǎn)，李廷強(qiáng),2*

（1.浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，污染環(huán)境修復(fù)與生態(tài)健康教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310058；2.國家級環(huán)境與資源實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心（浙江大學(xué)），杭州310058）

施用化學(xué)氮肥是促進(jìn)水稻生長、提高產(chǎn)量的主要途徑。但在稻田生態(tài)系統(tǒng)中，氮素能通過揮發(fā)、反硝化、徑流、淋溶等多種途徑損失，不僅降低氮肥利用率，也對生態(tài)環(huán)境帶來潛在威脅[1]。因此，減少稻田氮素?fù)p失，提高氮肥利用效率并降低其環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)迫切需要解決的問題。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤為紅壤發(fā)育的酸性水稻土（采自江西省吉安市）和潮土發(fā)育的中性水稻土（采自浙江省杭州市）。取耕層0～20 cm土壤，自然風(fēng)干，磨細(xì)過4 mm尼龍網(wǎng)篩，其基本理化性質(zhì)如表1所示。供試DMPP 純度達(dá)97%，由浙江奧復(fù)托化工有限公司提供。供試生物炭為在300 ℃和500 ℃條件下制備的玉米秸稈生物炭（分別記為300BC和500BC），由南京三聚生物質(zhì)新材料科技有限公司提供，其基本理化性質(zhì)如表2所示。供試水稻品種為Ⅱ優(yōu)023，由杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019 年5—9 月在浙江大學(xué)紫金港校區(qū)農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行，光照為自然光。試驗(yàn)共設(shè)4 個(gè)處理:1）對照（CK）；2）DMPP；3）DMPP+300 ℃生物炭（DMPP+300BC）；4）DMPP+500 ℃生物炭（DMPP+500BC）。3 次重復(fù)，完全隨機(jī)區(qū)組排列。采用口徑為22 cm 的塑料桶進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，每盆裝土10 kg。試驗(yàn)中氮（N）、磷（P2O5）、鉀（K2O）的用量分別為1、0.4、0.46 g/盆，氮、磷、鉀肥分別為尿素、過磷酸鈣和氯化鉀。所有肥料均作為基肥一次性均勻施入，DMPP 用量按對應(yīng)處理尿素純氮量的1%添加，與尿素混勻后施用，再分別添加8 L 去離子水，使土壤保持淹水泡田狀態(tài)，平衡2 d后進(jìn)行水稻移栽，每盆2株，并保持長期淹水管理。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 土壤氮素形態(tài)及反硝化活性測定

1.3.2 水稻收獲與分析

水稻成熟后收獲，實(shí)測每盆籽粒產(chǎn)量。采集各處理植株樣，烘干，經(jīng)H2SO4-HClO4消煮后，采用靛酚藍(lán)比色法測定籽粒和秸稈中氮含量[15]。

1.3.3 土壤氨氧化微生物豐度分析

1.3.3.1 土壤總DNA提取

采用FastDNA SPIN 試劑盒（美國MP Biomedicals 公司）提取土壤總DNA，具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。將提取的土壤總DNA 分管保存于－20 ℃冰箱中，備用。

1.3.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）

氨氧化古菌（ammonia oxidizing archaea,AOA）和氨氧化細(xì)菌（ammonia oxidizing bacteria,AOB）基因豐度的定量PCR 擴(kuò)增采用特異引物（表3）在LightCycler 480Ⅱ（瑞士Roche公司）儀器上進(jìn)行。

熒光定量反應(yīng)體系為10 μL，采用384孔板，包括DNA 模板0.5 μL，SYBR Green Premix ExTaq（日本TaKaRa公司）5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL和滅菌超純水3.5 μL。AOA 和AOB 的反應(yīng)條件均為：95 ℃預(yù)變性60 s；95 ℃變性5 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，40 個(gè)循環(huán)。根據(jù)擴(kuò)增循環(huán)閾值（CT）、已知質(zhì)粒濃度和阿伏伽德羅常數(shù)計(jì)算AOA、AOB的amoA基因拷貝數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒在試驗(yàn)前以10倍梯度進(jìn)行稀釋，稀釋倍數(shù)為101～108，每個(gè)樣品重復(fù)3 次，同時(shí)做3 個(gè)空白對照組。用已知拷貝數(shù)的AOA和AOBamoA基因進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，產(chǎn)物的特異性通過熔解曲線進(jìn)行驗(yàn)證。PCR擴(kuò)增效率為90%～97%，曲線R2＞0.99。

表1 土壤基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physical and chemical properties of the soils

表2 不同生物炭的基本理化性質(zhì)Table 2 Basic physical and chemical properties of different biochars

表3 用于PCR擴(kuò)增的引物序列Table 3 Primer sequences for PCR amplification

1.4 數(shù)據(jù)分析

硝化抑制率/%=（A－B）/A×100.

式中：A為不添加硝化抑制劑處理的土壤培養(yǎng)后NO－3-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/kg；B為添加硝化抑制劑處理的土壤培養(yǎng)后NO－3-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/kg。

反硝化活性以每克土壤每小時(shí)生成的N2O微克數(shù)表示，參照PHILIPPOT等[14]的方法計(jì)算：

反硝化活性/（μg/（g?h））=（V×F×MN2O）/（VM×m×t）.式中：V為采樣瓶頂空體積，L；F為測定的N2O質(zhì)量濃度，μg/L；MN2O為N2O摩爾質(zhì)量，44；VM為標(biāo)況下摩爾體積，22.4；m為測定的土樣質(zhì)量，g；t為培養(yǎng)時(shí)間，h。

水稻氮肥利用率/%=（施肥后水稻收獲時(shí)地上部的吸氮總量－未施肥水稻收獲時(shí)地上部的吸氮總量）/化肥氮的投入量×100.

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 8.0 和SPSS 22.0 進(jìn)行分析，采用鄧肯新復(fù)極差檢驗(yàn)法進(jìn)行處理間的差異顯著性分析，差異顯著性水平設(shè)定為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 DMPP 與生物炭配施對水稻生物量和氮肥利用率的影響

與CK相比，在酸性水稻土中，無論是DMPP處理還是DMPP 配施生物炭處理，水稻秸稈生物量和籽粒產(chǎn)量都明顯提高，但氮含量沒有顯著變化；而與DMPP 處理相比，配施生物炭對DMPP 在水稻生長及氮素吸收利用中的促進(jìn)效果沒有顯著差異，且2種生物炭之間也沒有明顯變化（表4）。

對于中性水稻土而言，與CK 相比，單施DMPP和DMPP配施生物炭都能提高水稻秸稈生物量、籽粒產(chǎn)量和氮肥利用率；與單施DMPP相比，配施2種生物炭后水稻籽粒產(chǎn)量和氮含量都有明顯增加，并能提高水稻氮肥利用率，尤其是配施500 ℃生物炭使中性水稻土中水稻籽粒產(chǎn)量和氮肥利用率的提升效果更顯著，分別提高8.5%和10.6%（P＜0.05）（表4）。

2.2 DMPP與生物炭配施對水稻土氮素轉(zhuǎn)化的影響

表4 DMPP配施生物炭對水稻生物量和氮肥利用率的影響Table 4 Effects of combined application of DMPP and biochar on rice biomass and nitrogen use efficiency

圖1 DMPP配施生物炭對水稻土NH＋4-N和NO－3-N含量的影響Fig.1 Effects of combined application of DMPP and biochar on NH＋4-N and NO－3-N contents in paddy soils

2.3 DMPP 與生物炭配施對水稻土硝化抑制率的影響

2種水稻土中，與單施DMPP相比，配施生物炭能有效延長硝化抑制時(shí)長，可產(chǎn)生硝化抑制效果后移的現(xiàn)象，且以500 ℃生物炭配施對DMPP 的硝化抑制率提升效果更好（表5）。在酸性水稻土中，培養(yǎng)第7 天，配施生物炭處理的硝化抑制率與單施DMPP 相比略有降低；而到第21、42 天，配施500 ℃生物炭處理的硝化抑制率比單施DMPP處理分別提高18.0%和35.3%。在中性水稻土中，配施500 ℃生物炭對不同時(shí)期的硝化抑制率均有提升效果，在第7、21、42 天 分 別 比 單 施DMPP 處 理 提 高8.5%、22.2%、41.2%?？傮w而言，DMPP配施500 ℃生物炭對中性水稻土的硝化抑制效果優(yōu)于酸性水稻土。

表5 DMPP配施生物炭對水稻土硝化抑制率的影響Table 5 Effects of combined application of DMPP and biochar on nitrification inhibition rate of paddy soils %

2.4 DMPP 與生物炭配施對水稻土反硝化活性的影響

酸性水稻土的反硝化活性總體上大于中性水稻土，尤其在水稻生長前期（圖2）。對于酸性水稻土，與單施DMPP 相比，配施生物炭能顯著降低土壤反硝化活性。水稻培養(yǎng)21 d，單施DMPP 處理的反硝化活性降低了17.3%，而配施300 ℃和500 ℃生物炭處理的反硝化活性分別降低了45.4%和80.9%（P＜0.05）。在處理后第42天，DMPP處理的反硝化活性與對照沒有差異，而DMPP+500BC處理的反硝化活性顯著降低，表明在酸性水稻土中DMPP 配施500 ℃生物炭能顯著延長反硝化活性的抑制時(shí)長。對于中性水稻土，與單施DMPP相比，配施生物炭也能夠增強(qiáng)其對土壤反硝化活性的抑制效果，但沒有酸性水稻土明顯。在處理后第42天，各處理之間沒有顯著差異，表明在中性水稻土中，配施生物炭并不能延長DMPP對反硝化活性的抑制時(shí)長。

圖2 DMPP配施生物炭對水稻土反硝化活性的影響Fig.2 Effects of combined application of DMPP and biochar on denitrification activity of paddy soils

2.5 DMPP 與生物炭配施對水稻土氨氧化微生物的影響

圖3 DMPP配施生物炭對水稻土氨氧化微生物豐度的影響Fig.3 Effects of combined application of DMPP and biochar on AOA and AOB abundance in paddy soils

3 討論

DMPP的作用效果受土壤類型、有機(jī)質(zhì)含量、水肥管理措施等因素的綜合影響[18]。施用生物炭是改善土壤性質(zhì)、提升耕地生產(chǎn)力的重要措施[19-20]，但是有關(guān)DMPP 配施生物炭對水稻產(chǎn)量及氮肥利用率的研究目前少有報(bào)道。我們的研究結(jié)果表明，與單施DMPP 處理相比，配施生物炭能提高2 種水稻土水稻產(chǎn)量和氮肥利用率，尤其在中性水稻土中，配施500 ℃生物炭不僅能顯著提高水稻籽粒產(chǎn)量和氮肥利用率（P＜0.05），還能提高籽粒氮含量，這可能與生物炭可以提高水稻根系活力，增強(qiáng)氮素吸收利用能力有關(guān)[21]。本研究中，2 種生物炭的促進(jìn)效果不同，在中性水稻土中配施500 ℃生物炭顯著優(yōu)于300 ℃生物炭，這可能是由于低溫制備的生物炭含有較多的揮發(fā)性物質(zhì)和有機(jī)物（如酚類）等，對水稻生長反而有一定的抑制作用[22]。

DMPP 施入土壤后會對土壤微生物的活性、種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量產(chǎn)生影響。通常情況下，氨氧化細(xì)菌被認(rèn)為是氨氧化過程的主要參與者，所以，目前大多數(shù)研究認(rèn)為DMPP 通過抑制氨氧化細(xì)菌的活性來抑制硝化反應(yīng)的進(jìn)行[31]。本試驗(yàn)中，單施DMPP后，2 種水稻土中AOBamoA基因拷貝數(shù)都有所下降，而AOAamoA基因拷貝數(shù)沒有顯著變化，進(jìn)一步證實(shí)DMPP 主要通過抑制氨氧化細(xì)菌的活性來抑制土壤硝化作用，主要原因在于DMPP 對土壤中AOB 氨單加氧酶轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用遠(yuǎn)大于AOA[32]。近年來，有關(guān)生物炭對土壤氨氧化微生物的影響也有相關(guān)報(bào)道[33]，而DMPP 配施生物炭對土壤氨氧化微生物的影響如何目前還不清楚。本研究中，DMPP配施生物炭對水稻土AOA豐度沒有顯著影響，而對AOB 的影響在2 種土壤中完全不同。在酸性水稻土中，配施生物炭處理提高了AOB 豐度，主要原因在于配施生物炭增加了生物炭-土壤復(fù)合體對DMPP的吸附，進(jìn)而降低了DMPP對AOB的抑制作用。而在中性水稻土中，AOB豐度顯著降低，尤其在水稻生長前期。這與KEIBLINGER等[12]的研究結(jié)果一致，即配施生物炭對DMPP 的硝化抑制效果有協(xié)同增強(qiáng)作用。生物炭配施對水稻土氨氧化細(xì)菌的影響不僅取決于土壤類型，還取決于生物炭原料種類和燒制溫度[34]。在中性水稻土中，2種生物炭對AOB的協(xié)同抑制效果不同，以500 ℃生物炭更加明顯（P＜0.05），推測其與生物炭的毒性有關(guān)。已有研究表明，隨著裂解溫度的提高，生物炭芳香族化合物增加，可能影響氨氧化微生物的活性[35]。

4 結(jié)論

1）與單施DMPP 相比，DMPP 配施500 ℃生物炭顯著提高了中性水稻土中水稻籽粒產(chǎn)量和氮肥利用效率，但對酸性水稻土的作用效果不顯著。

2）DMPP 配施生物炭能夠延長硝化抑制時(shí)長，提高硝化抑制效果，且對中性水稻土的效果優(yōu)于酸性水稻土，其中500 ℃生物炭的效果優(yōu)于300 ℃生物炭；同時(shí)，DMPP配施生物炭能抑制土壤反硝化活性，且以酸性水稻土中配施500 ℃生物炭的效果更好。

3）DMPP 配施生物炭對水稻土AOA 豐度沒有顯著影響，但減緩了DMPP對酸性水稻土中AOB的抑制效果，而在中性水稻土中表現(xiàn)為對AOB的協(xié)同抑制。