江卓,唐杰,劉彩林,于永敏,高嶺

(1 鄭州市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,河南 鄭州 450000； 2 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科)

肝癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，肝癌治療雖取得明顯進(jìn)步，但病人生活質(zhì)量仍然較差[1]。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌惡性進(jìn)展與基因差異表達(dá)有關(guān)，這些基因參與調(diào)控肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，可成為腫瘤治療的潛在分子靶點(diǎn)[2]。因此，研究影響肝癌進(jìn)展的分子機(jī)制可為靶向治療提供分子靶點(diǎn)。miRNA可影響腫瘤進(jìn)展，認(rèn)為調(diào)控miRNA表達(dá)可能是有效抑制腫瘤惡性發(fā)生發(fā)展的途徑之一[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)miR-1292-5p在胃癌中低表達(dá)，上調(diào)miR-1292-5p可抑制胃癌細(xì)胞惡性生長(zhǎng)，表明miR-1292-5p可能是一種腫瘤抑制因子[5]。然而，miR-1292-5p在肝癌中作用及機(jī)制尚未見報(bào)道。Akt/PI3K信號(hào)通路與多種腫瘤進(jìn)展有關(guān)，Akt/PI3K信號(hào)通路過度激活可影響腫瘤細(xì)胞的惡性表型[6-8]。本次實(shí)驗(yàn)首先探討miR-1292-5p在肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中的表達(dá)差異，然后首次研究上調(diào)miR-1292-5p對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、自噬、周期和凋亡等影響，為靶向基因治療肝癌提供可能方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

肝癌HuH7、HCC9204和SNU-449細(xì)胞均購自廣州賽庫生物技術(shù)有限公司；正常肝L-02細(xì)胞購自通派(上海)生物科技有限公司；C-Caspase-3抗體、Beclin1抗體均購自Cell Signaling Technology；miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒、SYBR Premix Ex Taq miRNA kit購自大連TAKARA；p-Akt抗體、p-PI3K抗體和Cyclin D1抗體購自美國(guó)BD公司；miR-1292-5p mimics、mimics control購自北京科忠智生物技術(shù)開發(fā)有限公司；ATG5抗體、PI3K抗體和P21抗體購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Akt抗體購自美國(guó)Abcam。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)肝癌細(xì)胞中miR-1292-5p表達(dá) 在肝癌HuH7、HCC9204、SNU-449細(xì)胞和正常肝L-02細(xì)胞中添加Trizol試劑，分別提取各組細(xì)胞總RNA，以無RNA酶水將RNA溶解，以-20 ℃保存?zhèn)溆?。以miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄，體系含有：10 μL的2×miRNA L-RT Solution mix、200 ng的miRNA、1.5 μL的miRNA L-RT Enzyme mix以及1 μL的Stem-loop primer，最后添加RNase-free water至20 μL?；旌虾螅旁?6 ℃溫浴30 min，37 ℃溫浴30 min，85 ℃反應(yīng)5 min，cDNA以-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ肧YBR Premix Ex Taq miRNA kit進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，PCR體系中含有：1 μL的 Forward Primer、1 μL的Reverse Primer、12.5 μL的SYBR Premix Ex TaqⅡ、1 μL的cDNA，最后添加ddH2O至25 μL。PCR的反應(yīng)程序設(shè)置為：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，55 ℃、30 s，共45個(gè)循環(huán)。內(nèi)參照為U6，按照2-△△Ct法計(jì)算miR-1292-5p表達(dá)變化。引物序列見表1。

表1 PCR擴(kuò)增所用引物及其序列

1.2.2細(xì)胞分組及處理 在肝癌SNU-449細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-1292-5p mimics、mimics control，記為miR-1292-5p組和miR-NC組，細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟參照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行。把沒有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞設(shè)置為Control組。Control(A組)、miR-NC(B組)、miR-1292-5p(C組)細(xì)胞培養(yǎng)48 h之后，按照1.2.1中qRT-PCR方法測(cè)定miR-1292-5p表達(dá)。

1.2.3CCK-8測(cè)定細(xì)胞增殖 Control、miR-NC、miR-1292-5p組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，每孔分別加入15 μL的CCK-8，于37 ℃條件下結(jié)合4 h。檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處每個(gè)孔的OD值，以Control組細(xì)胞存活率為100%，分析miR-NC、miR-1292-5p組細(xì)胞存活率變化。

1.2.4PI單染法測(cè)定細(xì)胞周期 Control、miR-NC、miR-1292-5p組細(xì)胞培養(yǎng)48 h之后，加入4 ℃預(yù)冷后的PBS液洗滌2次。在細(xì)胞內(nèi)加入體積分?jǐn)?shù)0.75的乙醇，將細(xì)胞固定1 h。以9 400 r/min離心10 min，棄上清溶液，再添加PBS溶液重懸，加入PI染液混合，上流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期。

1.2.5Annexin V-FITC/PI雙染法測(cè)定細(xì)胞凋亡Control、miR-NC、miR-1292-5p組細(xì)胞培養(yǎng)48 h之后，收集各組細(xì)胞用冰預(yù)冷后的PBS溶液懸浮2次，最后將細(xì)胞懸浮在500 μL的Binding Buffer溶液中，再添加10 μL的PI以及Annexin V-FITC，在室溫中孵育結(jié)合15 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化。

1.2.6蛋白質(zhì)印跡方法測(cè)定C-Caspase-3、Beclin1、ATG5、P21、Cyclin D1、p-Akt、Akt、PI3K、p-PI3K蛋白表達(dá) Control、miR-NC、miR-1292-5p組細(xì)胞培養(yǎng)48 h之后，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解溶液，提取總蛋白，按照BCA方法檢測(cè)蛋白濃度。在蛋白內(nèi)加入1/4體積的5×Loading Buffer溶液，于100 ℃反應(yīng)5 min。分別制備100 g/L的分離膠及體積分?jǐn)?shù)0.05的濃縮膠，每個(gè)泳道內(nèi)加入30 μg的蛋白樣品，濃縮膠內(nèi)電壓為80 V，分離膠內(nèi)電壓為120 V，等到溴酚藍(lán)染料點(diǎn)樣到分離膠的底部以后，終止電泳。將分離膠切下，在4 ℃條件下以170 mA的電流轉(zhuǎn)膜。電轉(zhuǎn)以后的PVDF膜放在制備好的封閉液(其中含有體積分?jǐn)?shù)0.05的牛血清清蛋白)內(nèi)，在室溫環(huán)境中結(jié)合1 h，然后將PVDF膜放在稀釋以后的一抗孵育液內(nèi)，于4 ℃條件下過夜，然后將PVDF膜放在二抗稀釋液中，在室溫中結(jié)合1 h。以ECL方法發(fā)光，Image Lab分析條帶的OD值，以β-actin作為參照，分析目的蛋白表達(dá)水平。二抗按照1∶4 000稀釋，C-Caspase-3、Beclin1、ATG5、P21、Cyclin D1、p-Akt、Akt、PI3K、p-PI3K等一抗分別按照1∶400、1∶800、1∶800、1∶1 000、1∶1 000、1∶600、1∶1 000、1∶1 000、1∶600稀釋。

1.2.7Akt/PI3K信號(hào)激活劑對(duì)上調(diào)miR-1292-5p的肝癌細(xì)胞增殖、周期、凋亡和自噬影響檢測(cè) 取轉(zhuǎn)染miR-1292-5p mimics后的肝癌SNU-449細(xì)胞，用含有Akt/PI3K信號(hào)激活劑IGF-1(50 μg/L)的細(xì)胞培養(yǎng)液處理培養(yǎng)，記為miR-1292-5p+IGF-1組(D組)，以miR-1292-5p組為對(duì)照(C組)，以CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞增殖(步驟同1.2.3)，PI單染法檢測(cè)細(xì)胞周期(步驟同1.2.4)，Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡(步驟同1.2.5)，蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)C-Caspase-3、Beclin1、ATG5、P21、Cyclin D1、p-Akt、Akt、PI3K、p-PI3K蛋白表達(dá)(步驟同1.2.6)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 miR-1292-5p在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)

L-02、HuH7、HCC9204、SNU-449細(xì)胞中miR-1292-5p表達(dá)量分別為1.00±0.11、0.36±0.02、0.47±0.05和0.20±0.04，肝癌HuH7、HCC9204、SNU-449細(xì)胞中miR-1292-5p表達(dá)水平低于正常肝L-02細(xì)胞(F=260.440，q=13.159～20.505，P<0.05)；肝癌SNU-449細(xì)胞中miR-1292-5p表達(dá)水平低于肝癌HuH7、HCC9204細(xì)胞(q=10.733、12.650，P<0.05)。選用表達(dá)水平最低的 SNU-449細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 miR-1292-5p上調(diào)對(duì)肝癌SUN-449細(xì)胞生物學(xué)行為影響

結(jié)果表明，與miR-NC組比，miR-1292-5p組肝癌SNU-449細(xì)胞中miR-1292-5p表達(dá)水平升高，細(xì)胞存活率降低，G0/G1期比例升高，細(xì)胞凋亡率升高，C-Caspase-3、P21蛋白表達(dá)水平均升高，Cyclin D1、Beclin1、ATG5蛋白表達(dá)水平明顯降低(F=27.553～611.793，q=7.116～24.042，P<0.05)。miR-1292-5p mimics可上調(diào)肝癌SNU-449細(xì)胞中miR-1292-5p表達(dá)水平，抑制其細(xì)胞增殖和自噬，阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。見圖1和表2。

①流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；②Western blot檢測(cè)C-Caspase-3、Beclin1、ATG5、P21、Cyclin D1蛋白表達(dá)。A：Control組，B：miR-NC組，C：miR-1292-5p組。

表2 miR-1292-5p上調(diào)對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為和相關(guān)蛋白水平影響

2.3 miR-1292-5p上調(diào)對(duì)肝癌細(xì)胞中Akt/PI3K信號(hào)通路相關(guān)蛋白影響

結(jié)果表明，與miR-NC組比，miR-1292-5p組肝癌SNU-449細(xì)胞中p-Akt、p-PI3K蛋白表達(dá)水平降低(F=42.043、60.545，q=10.307、7.603，P<0.05)。提示miR-1292-5p mimics可以抑制肝癌SNU-449細(xì)胞中Akt/PI3K信號(hào)通路激活。見圖2。

A：Control組，B：miR-NC組，C：miR-1292-5p組。

2.4 Akt/PI3K信號(hào)通路激活劑逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-1292-5p對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為和相關(guān)蛋白影響

結(jié)果表明，與miR-1292-5p組比較，miR-1292-5p+IGF-1組肝癌SNU-449細(xì)胞存活率升高，G0/G1期細(xì)胞比例、凋亡率、細(xì)胞中C-Caspase-3與P21蛋白表達(dá)水平均降低，Beclin1、ATG5、Cyclin D1、p-Akt、p-PI3K蛋白表達(dá)水平升高，差異均有顯著性(t=5.154～15.949,P<0.05)。提示Akt/PI3K信號(hào)通路激活劑可以逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-1292-5p對(duì)肝癌SNU-449細(xì)胞增殖、自噬的抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展，抑制細(xì)胞凋亡。見圖3和表3。

①流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；②Western blot檢測(cè)C-Caspase-3、Beclin1、ATG5、P21、Cyclin D1、p-Akt、Akt、PI3K、p-PI3K蛋白表達(dá)。C：miR-1292-5p組，D：miR-1292-5p+IGF-1組。

表3 Akt/PI3K信號(hào)通路激活劑逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-1292-5p對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響

3 討 論

miRNA已成為生命科學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，miRNA參與調(diào)控多種疾病進(jìn)展，可能成為疾病治療的分子靶點(diǎn)[9-12]。miRNA表達(dá)改變與腫瘤細(xì)胞惡性程度有關(guān)，通過人為改變miRNA的表達(dá)能夠改變腫瘤細(xì)胞的惡性表型[13]。已有研究表明，miR-1292-5p在胃癌中發(fā)揮類似抑癌基因作用[5]。本文結(jié)果顯示，肝癌細(xì)胞中miR-1292-5p表達(dá)水平低于正常肝細(xì)胞，并且上調(diào)miR-1292-5p可降低肝癌細(xì)胞增殖能力，提示miR-1292-5p在肝癌進(jìn)展中可能發(fā)揮抑癌作用，與其在胃癌中的結(jié)果相一致。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，上調(diào)miR-1292-5p后的肝癌細(xì)胞G0/G1期比例升高，細(xì)胞凋亡率升高，說明上調(diào)miR-1292-5p可阻滯肝癌細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞周期分為分裂期和分裂間期，G0/G1期是細(xì)胞分裂間期中的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)，其受到多種蛋白的作用[14]。Cyclin D1促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期進(jìn)展，Cyclin D1表達(dá)上調(diào)促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展[15]。P21是細(xì)胞周期的抑制因子，P21表達(dá)上調(diào)能夠阻滯細(xì)胞周期[16]。Caspase蛋白家族是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，Caspase-3是Caspase蛋白家族成員，位于細(xì)胞凋亡的下游，Caspase-3被活化后形成C-Caspase-3可不可逆地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[17]。本實(shí)驗(yàn)表明，上調(diào)miR-1292-5p后的肝癌細(xì)胞中C-Caspase-3、P21表達(dá)上調(diào)，而Cyclin D1表達(dá)下調(diào)，提示上調(diào)miR-1292-5p可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展，這與細(xì)胞周期和凋亡檢測(cè)結(jié)果一致。

細(xì)胞自噬是機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持的重要途徑。腫瘤進(jìn)展與細(xì)胞自噬的關(guān)系目前還不十分明確，且存在較大爭(zhēng)議，一部分人認(rèn)為，自噬可以延緩腫瘤細(xì)胞凋亡；還有一部分人認(rèn)為自噬能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡[18]。Beclin1、ATG5均為自噬標(biāo)志蛋白，其表達(dá)水平升高表明細(xì)胞自噬水平升高[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，上調(diào)miR-1292-5p后的肝癌細(xì)胞Beclin1、ATG5蛋白表達(dá)水平明顯降低，提示上調(diào)miR-1292-5p能夠抑制肝癌細(xì)胞自噬。

Akt/PI3K是一個(gè)具有多種功能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖以及凋亡[20]。Akt/PI3K信號(hào)在自噬中的作用研究較多，但結(jié)果存在分歧[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-37通過抑制Akt/PI3K信號(hào)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬[22]。而下調(diào)lncRNA HAGLROS通過抑制Akt/PI3K信號(hào)通路降低肝癌細(xì)胞自噬水平[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，上調(diào)miR-1292-5p后的肝癌細(xì)胞中Akt/PI3K信號(hào)通路激活水平下降，并且Akt/PI3K信號(hào)激活劑可以逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-1292-5p對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和自噬抑制作用、凋亡抑制作用和周期阻滯作用，這說明上調(diào)miR-1292-5p可能通過抑制Akt/PI3K信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞自噬。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-1292-5p抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)與靶向調(diào)控DEK基因表達(dá)有關(guān)[5]。因此，我們推測(cè)，miR-1292-5p可能是通過靶向調(diào)控DEK的表達(dá)影響Akt/PI3K通路的激活。

綜上所述，miR-1292-5p在肝癌中可能發(fā)揮抑制作用，其能夠抑制肝癌細(xì)胞自噬、增殖，阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，機(jī)制可能與下調(diào)Akt/PI3K信號(hào)通路激活水平有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)沒有分析miR-1292-5p在肝癌組織中的表達(dá)及其表達(dá)改變與肝癌病人臨床病理特征之間的關(guān)系，尚未對(duì)miR-1292-5p通過何種靶向機(jī)制影響Akt/PI3K通路進(jìn)行詳細(xì)探討，以后會(huì)對(duì)上述部分進(jìn)行深入探討和補(bǔ)充。