閻臻,付曉瑞,李新敏,崔珺

(1 鄭州市婦幼保健院婦產(chǎn)科,河南 鄭州 450052； 2 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科； 3 鄭州市婦幼保健院病理科)

宮頸癌是與乳癌具有相似病死率的婦科惡性腫瘤，嚴(yán)重危害女性生活質(zhì)量[1]。其目前可用治療方式(外科手術(shù)為主、放化療為輔)和治療效果均值得肯定[2-3]。然而，上述療法仍然存在一定的局限性，腫瘤復(fù)發(fā)率高、放化療毒副作用大[4]。目前的研究重點(diǎn)已轉(zhuǎn)向新型分子靶向藥物的研發(fā)[5]。國內(nèi)外相關(guān)研究認(rèn)為，腫瘤發(fā)展由多因素共同作用，其中遺傳學(xué)因素發(fā)揮重要作用[6-8]。在多種腫瘤中，RAS基因家族的基因突變使其激活，從而成為具有致癌活性的癌基因[9]。研究結(jié)果顯示，Harvery鼠肉瘤病毒癌基因(HRAS)隸屬于RAS基因家族，在胃癌、乳癌中異常表達(dá)[10-11]。同時，PTEN基因?yàn)槎喾N腫瘤抑制基因，其適度表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞生長、浸潤和轉(zhuǎn)移[12-14]。本研究通過生物學(xué)預(yù)測網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)HRAS和PTEN信號通路在宮頸癌中具有顯著作用，本文探究HRAS基因表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞自噬及凋亡的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞(中國科學(xué)院細(xì)胞庫，上海)；人宮頸癌標(biāo)本(鄭州市婦幼保健院手術(shù)切除標(biāo)本)；無特定病原體級雌性BALB/c小鼠(中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部，飼養(yǎng)于本院實(shí)驗(yàn)室)；HRAS沉默質(zhì)粒(si-HRAS)、HRAS過表達(dá)質(zhì)粒(HRASvector)等質(zhì)粒(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，北京百奧萊博科技有限公司)；PCR擴(kuò)增引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)；實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒(ABI公司，美國)；ABI 7500熒光定量PCR儀(北京京科瑞達(dá)科技有限公司)；RIPA細(xì)胞裂解液(上海圖赫實(shí)業(yè)有限公司)；Western blot檢測抗體(上海博谷生物科技有限公司)；BCA試劑盒(上海炎熙生物科技有限公司)；ECL熒光檢測試劑盒(蘇州宇恒生物科技有限公司)；Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，江蘇)；流式細(xì)胞儀(BD公司，美國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1宮頸癌小鼠模型的構(gòu)建及組織處理 取BALB/c小鼠，每5只合并一籠飼養(yǎng)，12 h-12 h晝夜交替光照，能自由獲取食物和水。采用數(shù)字表法將18只小鼠隨機(jī)分成3組：正常組(A組)，假手術(shù)組(B組)，模型組(C組)，每組6只小鼠。在無菌操作條件下，將人宮頸癌新鮮腫瘤標(biāo)本經(jīng)處理清除壞死組織和血塊后，剪成約2 mm3的組織塊備用。將模型組小鼠經(jīng)乙醚吸入麻醉后固定于操作臺，腹部消毒，做長0.5 cm切口，將制備標(biāo)本植于腹部皮下。假手術(shù)組小鼠經(jīng)腹腔注射1 mL純生理鹽水。手術(shù)全程在無菌條件下完成。正常組小鼠不做任何處理。于超凈工作臺打開小鼠腹腔，直接用肉眼觀察荷瘤病灶形態(tài)。取模型組小鼠腫瘤組織分為兩部分：一部分用于蘇木精-伊紅(HE)染色；一部分在液氮中速凍，然后移至-70 ℃保存，用于后續(xù)檢測。

1.2.2細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將宮頸癌Hela細(xì)胞分為4組，空白對照組(A組：不轉(zhuǎn)染任何序列)、陰性對照組(B組：轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒)、HRASvector組(C組：轉(zhuǎn)染HRAS過表達(dá)質(zhì)粒)、si-HRAS組(D組：轉(zhuǎn)染HRAS沉默質(zhì)粒siRNA)。將對數(shù)生長期Hela細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞生長至30%～50%融合時行轉(zhuǎn)染，室溫孵育后加入細(xì)胞培養(yǎng)孔，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2條件下培養(yǎng)6～8 h后，換完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24～48 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3qRT-PCR檢測 取各組小鼠組織標(biāo)本以及各分組轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提取組織和細(xì)胞中總RNA。組織水平上檢測HRAS和PTEN的表達(dá)量；細(xì)胞水平上檢測HRAS、PTEN、ATG7、LC3、Beclin1、bax、Fas和E-cadherin的表達(dá)量。取反應(yīng)液進(jìn)行熒光定量PCR，采用ABI 7500熒光定量PCR儀檢測。采用2-ΔΔCt計(jì)算mRNA表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4Western blot檢測 轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞裂解后，離心棄除沉淀，取上清為細(xì)胞總蛋白。取上清液采用BCA試劑盒測定各樣品的蛋白濃度。滴加一抗兔多克隆抗體HRAS、PTEN、ATG7、LC3、Beclin1、bcl-2、bax、Fas和E-cadherin，4 ℃孵育過夜，次日加HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗室溫下孵育。以化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀進(jìn)行曝光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢查 采用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測各組細(xì)胞染色后凋亡變化。將各組細(xì)胞置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，PBS洗滌后將細(xì)胞重懸，加入Annexin V-FITC和PI輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min。使用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488 nm處檢測細(xì)胞凋亡水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 宮頸癌小鼠模型構(gòu)建

建模21 d后，小鼠全部成活，模型組小鼠均荷瘤成功，成瘤率為100%。肉眼觀察和HE染色結(jié)果顯示，正常組和假手術(shù)組小鼠行動和外觀相對正常、無體質(zhì)量的明顯變化，均未見腫瘤病灶的形成，組織切面無異常變化，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整；模型組小鼠精神萎靡、行動遲緩、體質(zhì)量明顯下降，有半球形伴破潰和出血的腫瘤病灶形成，組織切面灰白、質(zhì)硬、血管豐富，癌細(xì)胞呈巢狀、胞核增大、核仁不明顯，表明建模成功。見圖1。

A：正常組，B：假手術(shù)組C：模型組。HE染色，200倍。

2.2 組織HRAS和PTEN的mRNA和蛋白表達(dá)

qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，正常組和假手術(shù)組小鼠組織中的HRAS和PTEN的mRNA和蛋白表達(dá)量均無明顯差異(t=1.180～1.821，P>0.05)。與正常組相比較，模型組小鼠組織中HRASmRNA和蛋白的表達(dá)量均顯著增加，PTENmRNA和蛋白的表達(dá)量下降(t=9.450～14.260，P<0.05)。見圖2。

①qRT-PCR檢測；②Western blot檢測。A：正常組，B：假手術(shù)組，C：模型組。與正常組小鼠組織相比，*P<0.05。

2.3 HRAS基因表達(dá)對PTEN信號通路的影響

qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，空白對照組HRASmRNA和蛋白表達(dá)與陰性對照組比較差異無顯著性(t=0.186～1.088；均P>0.05)；與空白對照組和陰性對照組比較，HRASvector組HRAS的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯上升(F=19.600、23.270，P<0.05)，PTEN的表達(dá)水平則明顯下降(F=16.760、35.130，P<0.05)。si-HRAS組HRAS的mRNA以及蛋白表達(dá)水平明顯下降(F=8.127、13.160，P<0.05)，PTEN的表達(dá)水平明顯上升(F=9.456、22.940，P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

①qRT-PCR檢測；②Western blot檢測。A：空白對照組，B：陰性對照組，C：HRASvector組，D：si-HRAS組。與空白對照組和陰性對照組相比，*P<0.05。

2.4 HRAS基因表達(dá)對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

qRT-PCR和Western blot檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化因子E-cadherin表達(dá)的結(jié)果顯示，E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)在空白對照組與陰性對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.069、0.686，P>0.05)；與空白對照組和陰性對照組比較，HRASvector組E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降(F=4.220、8.110，P<0.05)。si-HRAS組E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯上升(F=12.600、18.280，P<0.05)。見圖4。

①qRT-PCR檢測；②Western blot檢測。A：空白對照組，B：陰性對照組，C：HRASvector組，D：si-HRAS組。與空白對照組和陰性對照組相比，*P<0.05。

2.5 HRAS基因表達(dá)對細(xì)胞自噬的影響

qRT-PCR和Western blot檢測細(xì)胞自噬相關(guān)因子ATG7、LC3、Beclin1表達(dá)結(jié)果顯示，空白對照組與陰性對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.130～0.470，P>0.05)；與空白對照組和陰性對照組比較，HRASvector組ATG7、LC3、Beclin1 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下降(F=2.742～7.310，P<0.05)。si-HRAS組ATG7、LC3、Beclin1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯上升(F=3.160～30.970，P<0.05)。見圖4。

2.6 HRAS基因表達(dá)對細(xì)胞凋亡相關(guān)因子和凋亡率的影響

qRT-PCR和Western blot檢測bax、Fas、bcl-2結(jié)果顯示，空白對照組和陰性對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.245～1.459，P>0.05)；與空白對照組和陰性對照組相比較，HRASvector組bax和FasmRNA及蛋白表達(dá)水平明顯下降(F=1.011～7.314，P<0.05)，bcl-2mRNA和蛋白表達(dá)水平則明顯上升(F=177.300、220.400，P<0.05)。si-HRAS組bax及FasmRNA和蛋白表達(dá)水平明顯上升(F=11.200～41.180，P<0.05)，bcl-2mRNA和蛋白表達(dá)則明顯下降(F=113.600、129.800，P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)的檢測結(jié)果表明，空白對照組和陰性對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.020，P>0.05)。與空白對照組和陰性對照組相比較，HRASvector組細(xì)胞凋亡率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=31.020，P<0.05)；si-HRAS組細(xì)胞凋亡則明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=622.800，P<0.05)。見圖4、5。

①細(xì)胞轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞凋亡圖；②統(tǒng)計(jì)分析圖。A：空白對照組，B：陰性對照組，C：HRASvector組，D：si-HRAS組。與空白對照組和陰性對照組相比，*P<0.05。

3 討 論

基因治療通過基因上調(diào)或沉默，介導(dǎo)特定作用通路，發(fā)揮對人類腫瘤的治療作用[15]。宮頸癌為女性常見婦科腫瘤之一，其發(fā)病率呈年輕化趨勢[16]。人類乳頭狀瘤病毒(HPV)感染已被證實(shí)為宮頸癌的主要誘因，且既往研究已證實(shí)HPV感染可通過刺激或抑制一系列復(fù)雜信號通路，進(jìn)而誘導(dǎo)宮頸上皮細(xì)胞的瘤變或癌變[17-18]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是人類惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要原因之一，其可改變腫瘤細(xì)胞特性或腫瘤細(xì)胞微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤生長、誘導(dǎo)癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[19-20]。PTEN是最早發(fā)現(xiàn)的抑癌基因之一，已被證實(shí)在人類諸多癌癥中發(fā)生基因突變或高頻缺失，如生殖系統(tǒng)腫瘤、消化道腫瘤、呼吸系統(tǒng)腫瘤等[21-22]。PTEN可以調(diào)控多條信號通路，如PIK/AKT通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。例如，SONG等[23]就曾報道m(xù)icroRNA-126可通過靶向PIK3R2基因，進(jìn)而調(diào)控PTEN/PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。國內(nèi)亦有相似研究報道，如蔣立峰等[24]報道肺癌病人外周血Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯升高，且其機(jī)制可能與PTEN表達(dá)下調(diào)激活PI3K-AKT信號通路相關(guān)；孫吉春等[25]發(fā)現(xiàn)抑制MiR-21表達(dá)可能通過調(diào)控PTEN/AKT信號通路抑制胰腺癌細(xì)胞AS-PC-1增殖和侵襲。目前，通過靶向激活PTEN信號通路從而促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、促進(jìn)細(xì)胞增殖侵襲、自噬和凋亡等細(xì)胞生物學(xué)行為，已成為腫瘤基因治療的一新型熱點(diǎn)方向。

RNA干擾是通過關(guān)閉特定基因序列表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因表達(dá)沉默的過程。基因沉默在基因功能研究以及關(guān)聯(lián)信號通路的研究中發(fā)揮著重要作用，可用于探究腫瘤生長機(jī)制，為腫瘤的基因治療提供潛在的治療途徑[26]。鑒于此，本研究初步推測：HRAS基因沉默可能通過介導(dǎo)PTEN信號通路參與宮頸癌發(fā)病過程。

本文HE染色結(jié)果顯示，宮頸癌小鼠造模成功。造模后HRAS在宮頸癌小鼠中呈高表達(dá)，PTEN表達(dá)被抑制，過表達(dá)HRAS基因抑制PTEN表達(dá)，表明上調(diào)HRAS基因可能抑制PTEN信號通路的激活。同時，結(jié)合PCR、Western blot檢測細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、自噬和凋亡相關(guān)因子及凋亡率的結(jié)果表明，上調(diào)HRAS表達(dá)可導(dǎo)致bcl-2mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯上升，PTEN、ATG7、LC3、Beclin1、bax、Fas和E-cadherin呈低表達(dá)，細(xì)胞凋亡率明顯下降；與此同時，低表達(dá)HRAS基因可激活PTEN信號通路活性，導(dǎo)致PTEN表達(dá)的上升，并下調(diào)bcl-2的表達(dá)，上調(diào)ATG7、LC3、Beclin1、bax、Fas和E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。上述研究結(jié)果說明，HRAS基因沉默可誘導(dǎo)PTEN信號通路的激活，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡。ATG7、LC3、Beclin1是細(xì)胞自噬的關(guān)鍵蛋白[27]；bax和Fas為促凋亡蛋白，而bcl-2為抑制凋亡蛋白[28]。細(xì)胞自噬為繼細(xì)胞凋亡的另一種細(xì)胞程序性死亡，其和細(xì)胞凋亡均在腫瘤細(xì)胞生存中扮演重要角色；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化同樣對腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移意義重大。作者推測外源性HRAS基因沉默通過促進(jìn)PTEN信號通路的激活，發(fā)揮PTEN抑制細(xì)胞增殖分裂、腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移及促腫瘤細(xì)胞凋亡效應(yīng)；誘導(dǎo)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白ATG7、LC3和Beclin1表達(dá)，促凋亡蛋白bax和Fas表達(dá)、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化特征性蛋白E-cadherin表達(dá)，并下調(diào)抑制凋亡蛋白bcl-2表達(dá)，提示上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞自噬和凋亡均參與了宮頸癌細(xì)胞死亡過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合既往研究有關(guān)HRAS基因表達(dá)和PTEN信號通路作用的報道。例如，SUN等[29]發(fā)現(xiàn)，HRAS異常甲基化誘導(dǎo)該促癌基因的激活可能是膀胱腫瘤發(fā)生的早期事件，并可能進(jìn)一步作為膀胱組織腫瘤生物標(biāo)志物用于早期診斷和作為潛在的治療靶點(diǎn)。WU等[30]對吉西他濱在乳癌中的耐藥性進(jìn)行研究，結(jié)果提示miR-21可通過PTEN/AKT信號通路誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其結(jié)果可用于預(yù)測最佳乳癌治療并為逆轉(zhuǎn)吉西他濱耐藥性提供潛在治療靶點(diǎn)。

總而言之，本研究顯示HRAS基因表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)PTEN信號通路的激活，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、小鼠宮頸癌細(xì)胞自噬和凋亡，從而抑制宮頸癌的發(fā)生。本研究結(jié)果有助于深入探究宮頸癌發(fā)生相關(guān)分子機(jī)制，從而為PTEN作為預(yù)防和改善宮頸癌治療方案潛在功能分子提供理論依據(jù)。然而，本文尚存在部分問題有待進(jìn)一步研究，例如下調(diào)HRAS基因表達(dá)如何激活PTEN信號通路、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及自噬和凋亡等，HRAS基因表達(dá)下調(diào)介導(dǎo)PTEN信號通路激活在動物模型中的作用驗(yàn)證，等等。這些問題均有助于我們更充分地理解HRAS基因表達(dá)通過PTEN信號通路介導(dǎo)宮頸癌發(fā)生的作用機(jī)制，為該腫瘤的治療提供充分的理論證據(jù)。