金潔琪，光夢(mèng)凱

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院口腔科，北京 100050；2.中日友好醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心，北京 100029）

透明質(zhì)酸（hyaluronan，HA）廣泛存在于人體軟組織及結(jié)締組織，包括牙周膜組織等的細(xì)胞外基質(zhì)中，其對(duì)抗炎、傷口愈合起關(guān)鍵作用，目前臨床上應(yīng)用廣泛[1，2]。內(nèi)源性HA 作為牙周膜組織的重要組成部分，可以抗炎并促血管生成及傷口愈合[3]，而外源性HA 對(duì)牙周組織的應(yīng)用有待進(jìn)一步研究。人牙周膜細(xì)胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）有分化潛能[4]，本實(shí)驗(yàn)旨在研究在HA 的作用下其增殖及分化的情況，為HA 應(yīng)用于牙周疾病的治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞為慕尼黑大學(xué)牙學(xué)院基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室自有hPDLCs 細(xì)胞系。成骨誘導(dǎo)（osteogenic stimulation，OS）液：FBS，盤(pán)尼西林鏈霉素，地塞米松，L-抗壞血酸，β-甘油磷酸鹽，抗壞血酸等（均來(lái)自美國(guó)Sigma 公司）加入細(xì)胞培養(yǎng)液配成。HA 來(lái)自Hyalose 公司。查文獻(xiàn)后選擇分子量3～6Da 的Nano HA 及分子量150K Da 的HA。實(shí)驗(yàn)中HA 濃度為20ng/ml[5]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組（Con）；OS 組（osteogenic stimulation，+OS，陽(yáng)性對(duì)照）；Nano HA 組（+OS+Nano HA）；150K HA組（+OS+150K HA）。

21d 細(xì)胞培養(yǎng)：hPDLCs 培養(yǎng)于37℃，5% CO2的恒溫箱中，每周換液2 次。每周同一時(shí)間對(duì)細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡拍照及形態(tài)學(xué)觀察。

細(xì)胞增殖WST-1檢測(cè)：將hPDLCs均勻種在4盒48 孔培養(yǎng)皿中，等待48h，細(xì)胞完全附著生長(zhǎng)后，標(biāo)記為起點(diǎn)，分別在第0d，7d，14d，21d 進(jìn)行細(xì)胞增殖測(cè)驗(yàn)。WST-1 試劑盒來(lái)自Roche 公司，加入培養(yǎng)皿30min后，將細(xì)胞進(jìn)行ELISA測(cè)試。

對(duì)牙骨質(zhì)相關(guān)的牙骨質(zhì)附著蛋白（cementum attachment protein，CAP），牙骨質(zhì)蛋白（cementum protein 1，CEMP1），韌帶相關(guān)的Scleraxis（SCX），感染相關(guān)的Toll 樣受體（toll like receptor 4，TLR4）基因進(jìn)行rt-PCR 檢測(cè)：將hPDLCs 均勻種在6孔培養(yǎng)皿中，等待48h，細(xì)胞完全附著生長(zhǎng)后，標(biāo)記為起點(diǎn)，分別在第0d，3d，7d，21d 刮取細(xì)胞，提取RNA，轉(zhuǎn)化為cDNA 后，進(jìn)行rt-PCR 試驗(yàn)。管家基因選擇甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase，GAPDH）。具體基因序列見(jiàn)表1。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

表1 rt-PCR檢測(cè)的標(biāo)記物的基因序列

應(yīng)用Prism 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩兩比較采用t檢驗(yàn)，組間比較采用one-way ANOVA。

2 結(jié)果

2.1 hPDLCs21d細(xì)胞培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察

由圖1（見(jiàn)封二）可見(jiàn)，A 組空白對(duì)照組中hPDLCs 呈梭形生長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，集落逐漸融合，細(xì)胞均勻聚集分布，培養(yǎng)后期細(xì)胞逐漸經(jīng)緯狀交疊，細(xì)胞形態(tài)尖銳，邊緣伸展（圖A1～A3）。C 組為Nano HA 組（圖C1～C3），D 組為150K HA組（圖D1～D3），細(xì)胞形態(tài)均較空白對(duì)照組較為圓鈍，邊緣收縮，細(xì)胞培養(yǎng)后期（21d）時(shí)尤為明顯。B 組為成骨誘導(dǎo)的陽(yáng)性對(duì)照組OS 組（圖B1～B3），hPDLCs 形態(tài)介于空白對(duì)照組及HA 組之間，較空白對(duì)照組圓鈍，但細(xì)胞收縮程度不如HA組明顯。

圖1 hPDLCs培養(yǎng)7d、14d、21d時(shí)顯微鏡下觀察照片（×10）

2.2 HA抑制hPDLCs增殖

實(shí)驗(yàn)初期，各組細(xì)胞生長(zhǎng)速度接近，組內(nèi)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從第7d 開(kāi)始，空白對(duì)照組顯著高于OS 組及150K HA 組（P＜0.01）；OS 組顯著高于Nano HA 組（P=0.0009）。第14d 時(shí)，hPDLCs 增殖速度空白對(duì)照組＞OS 組＞Nano HA 組＞150K HA 組。第21d 時(shí)，空白對(duì)照組增速顯著高于Nano HA 組及150K HA組（P＜0.01）；OS組細(xì)胞增殖速度亦顯著高于Nano HA 組及150K HA 組（P=0.0398，P=0.0057）。Nano HA 與150K HA 兩組之間細(xì)胞增殖速度無(wú)明顯差異。綜合看來(lái)HA 對(duì)hPDLCs 增殖明顯有抑制作用，見(jiàn)圖2。

圖2 PDLCs WST-1增殖實(shí)驗(yàn)

2.3 HA抑制hPDLCs表達(dá)CAP

圖3A 示，7d 時(shí)4 個(gè)組的CAP 表達(dá)均達(dá)到高峰，而21d 時(shí)回落至初始線以下。3d 時(shí)可見(jiàn)空白對(duì)照組比OS，Nano HA 組及150K HA 組都高（P＜0.01）；OS 組亦高于150K HA 組（P=0.0191），可見(jiàn)150K HA 對(duì)CAP 表達(dá)有抑制作用。7d 時(shí)2 個(gè)HA組CAP 表達(dá)亦低于空白對(duì)照和OS 組，Nano HA組更是低于150K HA 組（P=0.0103）。21d 時(shí)，HA組的CAP表達(dá)亦低于空白對(duì)照組，而與OS組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？傊瓾A 基本上抑制hPDLCs 表達(dá)CAP。

2.4 HA抑制hPDLCs表達(dá)CEMP1

圖3B 示，HA 刺激下，hPDLCs 中CEMP1 的表達(dá)與CAP 類似，7d 時(shí)均有較高的表達(dá)，21d 時(shí)回落。3d 時(shí)，HA 對(duì)CEMP1 的表達(dá)有抑制作用，HA組均低于空白對(duì)照組和OS 組。7d 時(shí)，空白對(duì)照組最高，而OS 組，Nano HA 組及150K HA 組內(nèi)無(wú)明顯差異。21d 時(shí)，Nano HA 組與空白對(duì)照組的CEMP1 表達(dá)無(wú)明顯差異；而空白對(duì)照組的表達(dá)高于OS組及150K HA組（P=0.0036，P=0.0004）；Nano HA 組的CEMP1 表達(dá)亦高于150K HA 組（P=0.0375）?？傊瓾A，尤其是150K HA抑制hPDLCs表達(dá)CEMP1。

2.5 150K HA先促進(jìn)后抑制hPDLCs表達(dá)SCX

圖3C 示，hPDLCs 的表達(dá)量很低。前3d 各組之間SCX的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。7d時(shí)，OS組和150K HA 組的SCX 表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組，亦顯著高于Nano HA 組（均P＜0.01）。21d 時(shí)，空白對(duì)照組SCX 表達(dá)升高，而150K HA 組表達(dá)降低，顯著低于空白對(duì)照組，P=0.004）。

圖3 hPDLCs rt-PCR 中CAP、CEMP1、SCX的表達(dá)

2.6 HA促進(jìn)hPDLCs表達(dá)TLR4

圖4 示，前期hPDLCs 的TLR4 表達(dá)在較低水平，而在21d 時(shí)顯著提升。3d 時(shí)HA 組TLR4 表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組及OS組；Nano HA組亦高于150K HA 組（P=0.0378）。7d 時(shí)各組表達(dá)均高于空白對(duì)照組，而150K HA 組則低于OS 及Nano HA 組（P=0.0461，P=0.0132）。21d 時(shí)各組高于空白對(duì)照組，而OS 組、Nano HA 組及150K HA 組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。總之，HA 尤其是Nano HA，促進(jìn)hPDLCs表達(dá)TLR4。

圖4 hPDLCs rt-PCR 中TLR4的表達(dá)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察中，在Nano HA 和150K HA 刺激下，hPDLCs 形態(tài)較空白對(duì)照組明顯圓鈍；印證了Al-Rekabi等學(xué)者的研究成果：HA可提高h(yuǎn)PDLCs 的收縮性，且降低其細(xì)胞遷移能力。該實(shí)驗(yàn)中，HA 刺激下的hPDLCs 形態(tài)較對(duì)照組明顯收縮[6]。HA 對(duì)大部分細(xì)胞有抑制增殖的作用[7]，在本實(shí)驗(yàn)中亦得到了驗(yàn)證。不過(guò)也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)HA 可以促進(jìn)PDL 細(xì)胞增殖[8]，其觀測(cè)時(shí)間為細(xì)胞種植后的3d 和5d，與本實(shí)驗(yàn)不同；且使用的HA 分子量未知，而HA 對(duì)細(xì)胞的作用與HA的分子量相關(guān)，因此與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論相悖。

牙周附著喪失是牙周炎癥的重要表現(xiàn)。CAP和CEMP1 是牙周附著及牙骨質(zhì)相關(guān)蛋白[9]。hPDLCs是具有分化潛能的細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)下可以分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞[10]?？上г诒緦?shí)驗(yàn)中，2種HA 都對(duì)hPDLCs 的成牙骨質(zhì)分化起抑制作用。7d 時(shí)所有組CAP 及CEMP1 表達(dá)均升高而在21d回落，HA 組表達(dá)CAP 均低于空白對(duì)照組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別；21d 時(shí)150K HA 明顯抑制CEMP1 表達(dá)。SCX 是調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞形成纖維組織的蛋白，可以促上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，對(duì)組織愈合纖維形成起關(guān)鍵作用[11]。此外SCX還可以機(jī)械壓力下促進(jìn)腱細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖，從而修復(fù)肌腱[12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)150K HA 在7d 可促進(jìn)SCX 表達(dá)，而在21d 時(shí)抑制hPDLCs 表達(dá)SCX?？紤]到牙周組織承受各種咀嚼壓力，因此很有必要進(jìn)一步研究HA 對(duì)SCX 的調(diào)節(jié)作用。TLR4 是炎癥相關(guān)因子，炎癥狀態(tài)下可激活組織免疫反應(yīng)[13]。TLR4 還可以調(diào)節(jié)hPDLCs 的成骨分化[14]。本實(shí)驗(yàn)中，2 種HA，尤其是Nano HA，在3d 可明顯促進(jìn)hPDLCs表達(dá)TLR4，21d 時(shí)OS 組與HA 組間無(wú)差異，但亦均明顯高于空白對(duì)照組。HA 可誘導(dǎo)受損組織中成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞分化以修復(fù)受損傷的組織[15]。此外HA 還可以誘導(dǎo)軟骨、韌帶的修復(fù)及hPDLCs 神經(jīng)方向的分化[16，17]，且可以促進(jìn)hPDLCs早期成骨分化[8]。有學(xué)者在老鼠牙周炎模型上使用了HA 凝膠，得到很好的骨再生[18]。因此HA在牙周炎患者的臨床應(yīng)用還是很有前景。