丁珍,于菲,萬經(jīng)紅

(淄博市中醫(yī)醫(yī)院兒科,山東 淄博 255300)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征的異質(zhì)性疾病。哮喘慢性氣道炎癥最終導(dǎo)致氣道的持續(xù)性損傷而致氣道結(jié)構(gòu)異常，即氣道重塑。氣道重塑是哮喘的重要病理特征，顯著影響哮喘的預(yù)后。哮喘的發(fā)生發(fā)展與遺傳因素和環(huán)境因素有關(guān)，其中哮喘易感基因發(fā)揮重要作用。血清類黏蛋白1樣蛋白3(ORMDL3)基因是一種哮喘關(guān)聯(lián)基因，與哮喘氣道重塑的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1]。吸入布地奈德可以減少ORMDL3表達(dá)，并減輕氣道重塑的嚴(yán)重程度，二者有明顯相關(guān)性[2]。然而，長期大劑量使用糖皮質(zhì)激素會產(chǎn)生較大副作用，誘發(fā)或加重感染，抑制機(jī)體的免疫功能[3-4]。川芎嗪為中藥川芎主要有效成分，是一種應(yīng)用廣泛的中藥活性成分，臨床用于治療冠狀動脈疾病、缺血性腦血管疾病以及腫瘤等[5]。有研究表明，川芎嗪具有多種生物活性，如抗氧化活性、對多種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、預(yù)防內(nèi)皮細(xì)胞損傷等[6]，川芎嗪還能抑制成纖維細(xì)胞合成膠原纖維[7]。還有研究顯示，川芎嗪有影響哮喘病人氣道重塑的能力[8]。然而其作用機(jī)制尚未闡明。本研究旨在觀察川芎嗪對ORMDL3表達(dá)影響，為早期防治哮喘氣道重塑提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人支氣管上皮(HBE)細(xì)胞(上海博古生物科技有限公司，CBNumber：CB35771380)；南美胎牛血清(FBS，維森特生物技術(shù)有限公司)；Trizol (上海普飛公司)；四甲基吡嗪(美國Sigma公司)；Primer、二甲基亞砜(DMSO)、MTT(上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司)；RNase Inhibitor (Promega公司)；SYBR Master Mixture(TAKARA)；oligo dT (生工生物工程(上海)有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HBE細(xì)胞加入RPMI-1640培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)0.10的FBS，10 000 kU/L青霉素、10 g/L鏈霉素)中，置于培養(yǎng)箱(37 ℃,含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2)中培養(yǎng)，隔天換液，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞長至80%表面面積時傳代。

1.2.2藥物作用時間選擇 取對數(shù)生長期HBE細(xì)胞接種于 96 孔板，每孔加入 1×104個細(xì)胞，應(yīng)用含有體積分?jǐn)?shù)0.10 FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。另設(shè)空白組、對照組(加入相應(yīng)體積的PBS)。每組設(shè) 6個平行復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，加入MTT溶液，培養(yǎng)箱孵育4 h。離心去上清后加入DMSO溶液，酶標(biāo)儀檢測570 nm 波長處吸光度(A)值。計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活細(xì)胞率(%)=(實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.2.3川芎嗪濃度選擇及實驗分組 以100 μg/L的IL-4+IL-13培養(yǎng)的HBE細(xì)胞為模型組,分別加入不同濃度的川芎嗪(200、300、400、500、600、700、800 μg/L)作用72 h，觀察川芎嗪對IL-4+IL-13誘導(dǎo)HBE細(xì)胞ORMDL3mRNA干預(yù)作用。以作用最明顯的川芎嗪濃度作為實驗濃度，將實驗濃度的川芎嗪加入100 μg/L IL-4+IL-13培養(yǎng)HBE細(xì)胞作為治療組，以100 μg/L IL-4+IL-13培養(yǎng)HBE細(xì)胞為模型組，以PBS培養(yǎng)HBE細(xì)胞作為空白組。3組培養(yǎng)時間均為72 h。

1.3 檢測指標(biāo)及方法

1.3.1RT-PCR方法檢測ORMDL3mRNA表達(dá)取各組培養(yǎng)后的HBE細(xì)胞，采用Trizol法提取mRNA,按照RT-PCR試劑盒說明書將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,使用RT-PCR方法檢測ORMDL3mRNA表達(dá)。所用引物及其序列見表1。反應(yīng)體系20 μL，內(nèi)含：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5 μL，上下游引物共5 μL，SYBR Green 10 μL。以GAPDH為內(nèi)參照。反應(yīng)條件為：95 ℃，預(yù)變性30 s，1個循環(huán)；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40個循環(huán)；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，95 ℃、5～10 min，1個循環(huán)。

表1 PCR引物及其序列

1.3.2Western blot方法檢測ORMDL3蛋白表達(dá)取培養(yǎng)后的各組細(xì)胞，加入200 μg/L的RIPA裂解液，在冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心30 min。取上清液，行SDS-PAGE凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入50 g/L脫脂奶粉，室溫封閉2 h。加入兔抗人ORMDL3抗體(1∶200稀釋)，4 ℃冰箱過夜，室溫下TBST洗膜3次，加入1∶5 000稀釋的羊抗兔二抗，常溫孵育2 h；TBST室溫下洗膜3次，光化學(xué)法顯影，用Image J軟件掃描各條帶灰度值，以β-action(1∶200稀釋)為內(nèi)參照，以各條帶灰度值/內(nèi)參照灰度值表示ORMDL3蛋白表達(dá)。

1.3.3免疫組化檢測ORMDL3蛋白表達(dá) 取各組細(xì)胞，制作細(xì)胞爬片。血清封閉，PBS漂洗，向切片上分別滴加ORMDL3抗體(Abcam107639，1∶200稀釋)孵育過夜，PBS漂洗，二抗孵育，DAB顯色。光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞棕色著色為ORMDL3蛋白陽性表達(dá)。應(yīng)用Image J軟件計算ORMDL3蛋白相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同培養(yǎng)時間細(xì)胞存活率及不同藥物濃度組ORMDL3 mRNA表達(dá)比較

培養(yǎng)24、48、72 h細(xì)胞存活率分別為(90.13±1.96)%、(94.51±1.91)%、(97.22±1.91)%，各時間比較差異有顯著性(n=6，F(xiàn)=20.60，P<0.05)，培養(yǎng)72 h細(xì)胞存活率最高。后續(xù)實驗以72 h為藥物培養(yǎng)時間。200、300、400、500、600、700、800 μg/L濃度的川芎嗪作用HBE細(xì)胞72 h，其ORMDL3mRNA表達(dá)分別為2.472±0.178、0.763±0.058、0.823±0.142、0.994±0.059、0.978±0.038、1.084±0.079、0.947±0.036，各組比較差異有顯著性(n=6，F(xiàn)=5.34,P<0.05)。400 μg/L川芎嗪對IL-4+IL-13誘導(dǎo)HBE細(xì)胞血清ORMDL3mRNA表達(dá)的干預(yù)作用最明顯。后續(xù)實驗以400 μg/L為川芎嗪藥物濃度。

2.2 各組ORMDL3 mRNA表達(dá)比較

空白組、模型組、治療組ORMDL3mRNA表達(dá)分別為0.947±0.036、1.000±0.0371、0.763±0.058，各組ORMDL3mRNA比較差異有顯著性(n=6，F(xiàn)=176.45，P<0.01)。

2.3 各組ORMDL3蛋白表達(dá)比較

Western blot及免疫組化檢測結(jié)果均顯示，模型組、治療組ORMDL3蛋白表達(dá)較空白組升高，治療組較模型組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=23.48、91.56，P<0.01)。見表2和圖1、2。

表2 各組ORMDL3蛋白表達(dá)比較

A:空白組;B:模型組；C:治療組。

A:空白組;B:模型組；C:治療組。箭頭所示為ORMDL3陽性染色。DAB顯色，400倍。

3 討 論

哮喘病因為痰、虛、瘀，痰瘀互結(jié)是哮喘發(fā)作期的主要病機(jī)，治療應(yīng)以治痰活血并重?！蹲x醫(yī)隨筆》云：“痰為血類，停痰與瘀血同治?！碧迫荽ā堆C論》說：“須知痰水之壅，由瘀血使然，但去瘀血則痰水自消?！毕牟C(jī)是“內(nèi)有壅塞之氣，外有非時之感，膈有膠固之痰?！迸R床研究發(fā)現(xiàn)，對于哮喘發(fā)作期及緩解期的寒哮、熱哮證，川芎都有顯著的療效[9]。哮喘病兒久病正氣不足，伏痰內(nèi)生，氣虛血瘀，故痰瘀互結(jié)是哮喘的主要病因病機(jī)。血瘀證貫穿于哮喘的始終?！侗静菥V目》有云：“川芎者，血中之氣藥?！贝ㄜ盒翜叵阍铮叨皇?，既能行散，上達(dá)巔頂；又入血分，下行可達(dá)血海，為血中之氣藥，能通達(dá)氣血，活血祛瘀之功效顯著。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，哮喘屬于多基因遺傳病,由環(huán)境因素和遺傳因素共同作用而形成。ORMDL3基因位于17號染色體上,包括3個外顯子和2個內(nèi)含子,編碼1個位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的跨膜蛋白,可以通過調(diào)節(jié)Ca2+濃度導(dǎo)致未折疊蛋白反應(yīng),為哮喘炎性反應(yīng)發(fā)生的內(nèi)源性誘因[10]。哮喘的一個重要的病理特點是氣道重塑。氣道重塑可發(fā)生于成人及兒童哮喘病人，而ORMDL3基因高表達(dá)的兒童哮喘可能會加速早期氣道重塑的進(jìn)程[11]。既往研究已顯示，ORMDL3過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型可出現(xiàn)氣道炎癥、氣道重塑、氣道高反應(yīng)性和IgE水平升高[12]。

川芎嗪是川芎生物堿的主要成分之一，在我國被用于改善血液循環(huán)及緩解疼痛至少有2 000年的歷史。川芎嗪(化學(xué)名稱四甲基吡嗪)是自中藥川芎分離提純出來的一種酰胺生物堿，是一種鈣離子拮抗劑，可影響器官血液流變學(xué)參數(shù)，有擴(kuò)張血管、減輕炎癥、抗脂質(zhì)過氧化、抑制鈣超載、減輕纖維化、抑制血小板聚集等作用。另外，川芎嗪還有降低氣道高反應(yīng)、改善氣道炎癥、調(diào)節(jié)免疫等作用[13-14]。

研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪對過敏性炎癥反應(yīng)和氣道重塑具有抑制作用[16-17]。哮喘發(fā)病的主要機(jī)制是慢性氣道炎癥，而持續(xù)的慢性氣道炎癥可以引起氣道重塑。已有研究表明，HBE細(xì)胞在過敏原和細(xì)胞因子(IL-4和IL-13)刺激下可誘導(dǎo)ORMDL3表達(dá)[15]；ORMDL3可通過激活ERK1/2/MMP-9信號通路影響哮喘氣道炎癥和氣道重塑進(jìn)展[16-18]。本研究應(yīng)用IL-4+IL-13誘導(dǎo)HBE細(xì)胞ORMDL3過表達(dá)作為哮喘細(xì)胞模型，探討川芎嗪對氣道重塑的影響。結(jié)果顯示，IL-4、IL-13可誘導(dǎo)HBE細(xì)胞ORMDL3mRNA過表達(dá)，400 μg/L濃度川芎嗪作用72 h可顯著降低IL-4+IL-13誘導(dǎo)的HBE細(xì)胞ORMDL3mRNA和蛋白表達(dá)，說明川芎嗪可以抑制哮喘氣道炎癥和氣道重塑。其機(jī)制可能為：川芎嗪是一種鈣離子拮抗劑，可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度導(dǎo)致未折疊蛋白反應(yīng)，從而減輕氣道炎癥反應(yīng)，影響氣道重塑進(jìn)程。其具體機(jī)制需要進(jìn)一步的實驗證實。

綜上所述,川芎嗪可能通過阻斷IL-4+IL-13誘導(dǎo)所致HBE細(xì)胞ORMDL3蛋白過表達(dá)，在一定程度上改善哮喘氣道重塑。本文研究結(jié)果為川芎嗪治療哮喘及其機(jī)制研究提供依據(jù)。