人參皂苷Rh2-殼聚糖納米粒子制備及對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用

顧 倩，周 靜,2，張建梅，尚 志，沈 婷，楊曉君，胡衛(wèi)成,

（1.淮陰師范學(xué)院 江蘇省區(qū)域現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與環(huán)境保護(hù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 淮安 223300；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

肺癌具有高發(fā)率和高致死率，已經(jīng)成為當(dāng)今嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和生命的惡性腫瘤之一。非小細(xì)胞肺癌是最常見(jiàn)的肺癌類(lèi)型，由基因和環(huán)境因素共同作用引發(fā)，與吸煙關(guān)系密切[1]，占所有肺癌病例的80%。非小細(xì)胞肺癌對(duì)多數(shù)抗癌藥物呈現(xiàn)出低敏感度，導(dǎo)致通過(guò)開(kāi)發(fā)特殊藥物治愈非小細(xì)胞肺癌的方法很難成功[2]。

人參是一種名貴的藥食同源中藥材，根莖花果實(shí)均可食用，生物活性廣泛，有“百草之王”的美稱(chēng)[3]。人參的主要活性成分是人參皂苷，在提升免疫力、抗氧化、抗衰老、降糖降脂[4]等方面有顯著功效，廣泛應(yīng)用于保健食品[5]。人參皂苷Rh2是紅參提取物的主要活性成分之一，具有抑制腫瘤生長(zhǎng)、抗病毒感染[6]等多種藥理學(xué)活性，能夠抑制前列腺癌[7]、結(jié)腸直腸癌[8]、腦膠質(zhì)瘤[9]、肝癌[10]等多種腫瘤細(xì)胞的增殖，是一種潛在的抗癌藥物。研究發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549對(duì)人參皂苷Rh2具有較高的敏感性[11]。Rh2能夠下調(diào)周期蛋白水平和激酶活性，上調(diào)pRb2/p130的活性，導(dǎo)致A549細(xì)胞G1期阻滯，抑制A549細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。人參皂苷Rh2具有C20立體異構(gòu)（S/R），張春晶等[12]研究表明人參皂苷Rh2具有構(gòu)效效應(yīng)，20(S)-Rh2對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用更為顯著。

盡管具有上述生物活性功效，但是人參皂苷Rh2屬于脂溶性小分子，故擴(kuò)散速率快、水溶性較差，且Rh2的生物相容度低、毒副作用大[13]，制約了其在臨床上的廣泛運(yùn)用。因此，提升Rh2的溶解性和延長(zhǎng)體內(nèi)滯留時(shí)間是實(shí)際應(yīng)用Rh2的首要難題。

納米粒子是微米級(jí)的聚合膠體粒子系統(tǒng)，直徑在10～500 nm之間[14]，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于包載并遞送生物活性物質(zhì)。納米粒子具有良好的緩釋性能，能夠增加藥物的溶解度，提升藥物的穩(wěn)定性，通過(guò)胞吞作用被細(xì)胞攝取而增強(qiáng)藥物在體內(nèi)的吸收，提升藥物在機(jī)體循環(huán)中的生物活性[15]。此外，腫瘤的微環(huán)境區(qū)別于正常細(xì)胞，具有高滲透和滯留效應(yīng)，腫瘤組織血管豐富、通透性強(qiáng)、淋巴回流少，納米載體因易在特定的微環(huán)境中聚集而具有一定的靶向性[16]。

殼聚糖（chitosan，CS）由蝦蟹類(lèi)甲殼素脫乙酰化而成，具有良好的抑菌性、抗病毒性[17]，同時(shí)有一定的成膜性，可以起到防腐保鮮的作用，用于食品包裝中可以提高產(chǎn)品保存品質(zhì)[18]。研究表明CS能夠被人體內(nèi)的特定酶（如溶菌酶等）水解，具有良好的生物可降解性。此外，CS能夠打開(kāi)上皮組織間的緊密連接而加強(qiáng)滲透作用[19]。腫瘤細(xì)胞外環(huán)境呈酸性，CS能夠在酸性條件下溶解，保證了包載藥物在特定的pH值條件下響應(yīng)性釋放[20]。CS納米粒子能夠控制藥物釋放，提升藥物的生物相容性，其來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建藥物遞送載體。制備CS納米粒子的方法有乳化交聯(lián)法、離子交聯(lián)法、溶劑蒸發(fā)法等[21]。其中離子交聯(lián)法最為常用。離子交聯(lián)法制備工藝簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和，無(wú)需有機(jī)溶劑和催化劑，且安全無(wú)毒。三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，TPP）的負(fù)電荷密度較高，是一種常用的交聯(lián)劑，CS主鏈上含有氨基，可提供大量交聯(lián)位點(diǎn)，兩者借助靜電作用形成可逆的物理交聯(lián)，制備的納米粒子具有較強(qiáng)的交聯(lián)度，穩(wěn)定性好[19]。

本研究設(shè)計(jì)一種納米藥物載體，通過(guò)離子交聯(lián)法制備CS載藥納米粒子，遞送人參皂苷20(S)-Rh2，并對(duì)其制備條件、結(jié)構(gòu)表征和抗腫瘤活性進(jìn)行研究，為遞送難溶性藥物提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

（S型）人參皂苷Rh2（相對(duì)分子質(zhì)量為622.87，純度大于98%） 成都曼斯特生物科技有限公司；CS（脫乙酰度為91.5%） 青島云宙生物科技有限公司；TPP（相對(duì)分子質(zhì)量為367.86） 上海麥克林生化科技有限公司；非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549 武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA、抗生素 加拿大Gibco公司；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI） 美國(guó)Sigma公司；Cy5.5-N-羥基琥珀酰亞胺酯（N-hydroxysuccinimide，NHS） 西安瑞禧生物科技有限公司；3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromid，MTT） 德國(guó)Biofroxx公司；所有有機(jī)溶劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Zetasizer Nano ZS90粒度儀 英國(guó)Malvern公司；1260高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；Infinite M200 Pro酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；LSM700激光共聚焦顯微鏡德國(guó)Zeiss公司；X’Pert Pro MPD型X射線衍射光譜儀荷蘭PANalytical公司；JY88-IIN型超聲波破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)德國(guó)Eppendorf公司；JEM-1230透射電子顯微鏡 日本JEOL公司；Alpha 1-2 LD plus型真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；BS224S分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CS納米粒子制備及工藝的考察

1.3.1.1 空白納米粒子的制備

CS粉末溶于體積分?jǐn)?shù)1%乙酸溶液，攪拌溶解，配制成1 mg/mL CS溶液，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至5左右。分別稱(chēng)取0.5、0.25、0.125、0.1 mg TPP溶于與上述CS溶液等體積的超純水中，將其以20 滴/min的速率滴加到CS溶液中，待TPP溶液全部滴加完畢后，攪拌交聯(lián)反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束過(guò)0.45 μm濾膜，冷凍干燥，4 ℃保存。

1.3.1.2 空白納米粒子制備工藝的篩選

按照1.3.1.1節(jié)方法，固定其他反應(yīng)條件，改變m（CS）∶m（TPP）（2∶1、4∶1、8∶1、10∶1）（固定CS分子質(zhì)量為50 kDa）、CS的分子質(zhì)量（50、80、212 kDa）（固定m（CS）∶m（TPP）為4∶1），制備空白納米粒子，探究CS分子質(zhì)量、m（CS）∶m（TPP）對(duì)納米粒子粒徑、Zeta-電位等成球特性的影響。

1.3.1.3 載藥納米粒子投藥量的篩選

稱(chēng)取4 mg CS，溶于4 mL體積分?jǐn)?shù)1%乙酸溶液，待CS全部溶解后，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至5。稱(chēng)取0.25、0.5、0.75、1 mg的人參皂苷Rh2溶于500 μL無(wú)水甲醇，以20 滴/min的速率滴加到CS溶液中。滴加完畢后，逐滴加入等體積的1 mg/mL TPP溶液，攪拌交聯(lián)反應(yīng)30 min，制成CS-Rh2-TPP納米粒子。反應(yīng)結(jié)束后溶液過(guò)0.45 μm濾膜，冷凍干燥，置于4 ℃保存。

1.3.2 納米粒子的粒徑、Zeta-電位的測(cè)定

取1.5 mL左右樣品溶液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，采用Zetasizer Nano ZS90粒度儀測(cè)定粒徑和Zeta-電位。

1.3.3 載藥量與包封率的測(cè)定

采用高效液相色譜法測(cè)定CS載藥納米粒子中包載的人參皂苷Rh2質(zhì)量濃度。稱(chēng)取凍干的載藥納米粒子樣品溶解于蒸餾水，制備成1 mg/mL溶液，超聲15 min，使人參皂苷Rh2充分釋放，離心后取上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，高效液相色譜法檢測(cè)其質(zhì)量濃度。色譜條件：ZORBAX SB-C18反向色譜柱（3.0 mm×50 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)65%乙腈溶液；柱溫為35 ℃；運(yùn)行時(shí)間為20 min；進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線換算Rh2質(zhì)量，分別按式（1）、（2）計(jì)算載藥量和包封率。

式中：m1為納米粒子中包載的Rh2質(zhì)量/μg；m2為載藥納米粒子的質(zhì)量/μg；m3為Rh2的總投藥質(zhì)量/μg。

1.3.4 CS載藥納米粒子的結(jié)構(gòu)表征

1.3.4.1 透射電子顯微鏡觀察微觀形態(tài)

取一滴樣品溶液置于碳包覆銅柵上，磷鎢酸負(fù)染，空氣干燥后用JEM-1230型透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.3.4.2 原子力顯微鏡觀察微觀形態(tài)

取5 μL樣品溶液置于云母片上，室溫下干燥，用NTEGRA Prima型原子力顯微鏡觀察樣品的表面形貌，經(jīng)NanoScope Analysis軟件分析獲得圖像。

1.3.5 X射線衍射光譜分析晶型變化

采用X射線衍射儀分別對(duì)人參皂苷Rh2、CS及CS-Rh2-TPP載藥納米粒子凍干粉末進(jìn)行光譜掃描分析，掃描角度范圍5°～90°，掃描速率為2（°）/min。

1.3.6 體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

1.3.6.1 細(xì)胞培養(yǎng)

在含體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃及飽和相對(duì)濕度條件下，用含10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，按體積比1∶4進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.6.2 MTT測(cè)試

A549細(xì)胞經(jīng)胰酶消化30～40 s后，加入適量MEM培養(yǎng)基輕輕吹打成細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色后在倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于96 孔板，在CO2培養(yǎng)箱（37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2）中培養(yǎng)。其中，空白組加培養(yǎng)基，處理組每個(gè)孔加入不同質(zhì)量濃度（5、10、20、40 μg/mL）的人參皂苷Rh2和CS-Rh2-TPP（質(zhì)量濃度以Rh2為準(zhǔn)）溶液孵育。24 h后，棄除培養(yǎng)基，每孔加入100 μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h，加100 μL終止液繼續(xù)培養(yǎng)16～20 h后于酶標(biāo)儀550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值。按照式（3）計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

式中：OD1為實(shí)驗(yàn)組OD值；OD2為空白組OD值。

1.3.7 A549細(xì)胞對(duì)納米粒子的攝取實(shí)驗(yàn)

1.3.7.1 包載熒光探針納米粒子的制備

稱(chēng)取一定量的Cy5.5-NHS溶于無(wú)水甲醇，制備成1 mg/mL的熒光探針儲(chǔ)備液，避光4 ℃保存。熒光納米粒子的制備方法參考1.3.1.3節(jié)載藥納米粒子的制備，調(diào)節(jié)溶液pH值至5附近，向溶液中逐滴滴加熒光探針儲(chǔ)備液50 μL，保持避光。

1.3.7.2 細(xì)胞攝取

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于24 孔板中，培養(yǎng)16～20 h。空白對(duì)照組加新鮮MEM培養(yǎng)基，3 個(gè)處理組加5 μL CS-Rh2-TPP溶液，分別處理1、3、6 h。磷酸鹽緩沖液清洗后以質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛室溫固定15 min，再次清洗后加0.5% Triton X-100透化處理10 min，清洗后用含DAPI的抗猝滅封片劑封片，避光保存。在激光共聚焦顯微鏡下觀察不同孵育時(shí)間下細(xì)胞對(duì)納米粒子的攝取情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用單因素方差分析比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 m（CS）∶m（TPP）對(duì)納米粒子成球特性的影響

表1 CS/TPP不同質(zhì)量比對(duì)納米粒子粒徑和Zeta-電位的影響Table 1 Effect of CS-to-TPP mass ratio on size and zeta potential of nanoparticles

由表1可知，在等體積反應(yīng)體系中，納米粒子粒徑隨著CS添加量的增加而逐漸減小。這是由于溶液中CS添加量較少時(shí)，CS與TPP交聯(lián)形成疏松的結(jié)構(gòu)，在水溶液中的粒徑較大；隨著CS添加量的增加，未中和的氨基數(shù)量增多，導(dǎo)致更強(qiáng)的分子內(nèi)交聯(lián)，使得納米粒子的粒徑逐漸減小[22]。如果粒子的交聯(lián)程度過(guò)高，藥物釋放會(huì)受阻，不利于藥物緩釋。當(dāng)m（CS）∶m（TPP）較低時(shí)（2∶1），過(guò)量的TPP使得更多的CS參與單個(gè)納米粒子的形成，納米粒子表面電荷密度較低，無(wú)法維持大顆粒的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致顆粒沉淀。

Zeta-電位與膠體分散體系的穩(wěn)定性成正比，粒子表面電勢(shì)能夠反映納米分散體系的物理穩(wěn)定性[23]。當(dāng)表面電勢(shì)較高時(shí)，單個(gè)納米粒子之間同種電荷相互排斥，保持穩(wěn)定，可以有效防止聚集沉淀，且?guī)д姾傻哪z體粒子能夠通過(guò)與黏膜表面帶負(fù)電荷的粒子相互作用提升生物利用度。CS與TPP在質(zhì)量比4∶1條件下的Zeta-電位在25 mV左右，帶正電荷，相比于其他質(zhì)量比條件下制備的納米粒子以更穩(wěn)定的狀態(tài)存在，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)在該條件下開(kāi)展。

2.2 CS分子質(zhì)量對(duì)納米粒子成球特性的影響

如表2所示，隨著CS分子質(zhì)量的增加，納米粒子的粒徑呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。這是由于CS主鏈上存在大量的氨基和羥基基團(tuán)，在水溶液中存在較強(qiáng)的氫鍵和靜電相互作用。低分子質(zhì)量CS在特定的質(zhì)量濃度下，分子內(nèi)氫鍵的吸引力和靜電相互作用產(chǎn)生的排斥力處于一個(gè)平衡的狀態(tài)，易形成單個(gè)的納米粒子。高分子質(zhì)量CS具有更多的分子間氫鍵，使得表面張力大于低分子質(zhì)量CS。在其他條件保持不變的情況下，溶液體系的表面張力越小，納米粒子的粒徑越小[24]。

表2 不同CS分子質(zhì)量對(duì)納米粒子粒徑和Zeta-電位的影響Table 2 Effect of the molecular mass of chitosan on size and zeta potential of nanoparticles

納米粒子在體內(nèi)的分布取決于其粒徑[25]，粒徑較小的納米粒子在遞送藥物至靶組織或靶細(xì)胞時(shí)通常具有更高的效率，所以選取分子質(zhì)量為50 kDa的CS進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，以提高所載藥物的利用度。

2.3 投藥量對(duì)載藥納米粒子成球特性的影響

表3 不同投藥量對(duì)納米粒子粒徑、Zeta-電位、載藥量和包封率的影響Table 3 Effect of Rh2 levels on size, zeta potential, encapsulation and loading efficiencies of nanoparticles

如表3所示，納米粒子粒徑隨Rh2投藥量的增加而增大。粒徑影響納米粒子在體內(nèi)的分布，不同投藥量制備的CS納米粒子粒徑在129～353 nm之間，能夠通過(guò)腫瘤組織的高滲透和長(zhǎng)滯留效應(yīng)聚集在病變部位附近。

Zeta-電位是評(píng)估膠體分散體系穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于分散穩(wěn)定的膠體溶液，理想的表面電勢(shì)的絕對(duì)值應(yīng)大于30 mV[25]。納米粒子表面電勢(shì)越高越穩(wěn)定，正電荷能夠增強(qiáng)納米粒子對(duì)組織的黏附性和滲透性[26]。如表3所示，不載藥的CS納米粒子Zeta-電位為26.90 mV，隨著投藥量的增加，Zeta-電位明顯增加，絕對(duì)值均大于30 mV，表明包載藥物后CS納米粒子具有良好的分散性[27]。

當(dāng)CS與人參皂苷Rh2的質(zhì)量比從8∶0.5減少至8∶1.5時(shí)，載藥量從1.70%增加到了7.89%，包封率從18.95%增加到了49.54%，表明投藥量影響藥物的載藥量和包封率，這時(shí)藥物主要以包埋的方式存在于納米粒子內(nèi)部；當(dāng)CS與Rh2的質(zhì)量比從8∶1.5減少至8∶2時(shí)，載藥量和包封率增幅不大，而粒徑從（222.70±17.34）nm增加到了（353.27±7.17）nm，這可能是由于藥物負(fù)載過(guò)多，多余的藥物吸附在CS納米粒子表面，引起納米粒子粒徑突然增加，納米粒子不能維持較小的表面張力，容易引起聚集沉淀[28]。所以一味地增加投藥量，并不能獲得更高的包封率。綜合考慮粒徑、包封率，為利于藥物運(yùn)載，選擇m（CS）∶m（Rh2）∶m（TPP）＝8∶1.5∶2的比例進(jìn)行后續(xù)研究。

2.4 載藥納米粒子的粒徑與Zeta-電位分布

圖1 CS-Rh2-TPP載藥納米粒子的粒徑（A）和Zeta-電位（B）分布Fig.1 Size (A) and zeta potential (B) distribution of CS-Rh2-TPP nanoparticles

如圖1A所示，載藥納米粒子粒徑呈正態(tài)分布，具有良好的分散性和穩(wěn)定性。結(jié)合表3和圖1B可知，載藥納米粒子較空白納米粒子有較高的Zeta-電位，正電荷間的排斥作用保證了納米粒子具有較好的穩(wěn)定性，即較低的分散度。

2.5 載藥納米粒子形態(tài)觀察結(jié)果

2.5.1 透射電子顯微鏡形態(tài)觀察結(jié)果

圖2 CS-Rh2-TPP載藥納米粒子透射電子顯微鏡圖Fig.2 CS-Rh2-TPP nanoparticles observed by transmission electron microscopy

如圖2所示，載藥納米粒子呈圓球形或類(lèi)球形，分布均勻，無(wú)明顯的黏連現(xiàn)象。可能由于粒度儀測(cè)量的是納米粒子水合狀態(tài)下的尺寸，而透射電子顯微鏡的圖像是在樣品干燥狀態(tài)下獲得的，所以透射電子顯微鏡觀察到的粒徑比粒度儀測(cè)量到的粒徑尺寸要小一些[29]。

2.5.2 原子力顯微鏡形態(tài)觀察結(jié)果

原子力顯微鏡具有納米級(jí)的分辨率，為非破壞性成像，是表征納米水平粒子表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的有力工具，被廣泛用于生物大分子及高分子的形態(tài)觀察[30]。圖3和圖4分別為CS-Rh2-TPP原子力顯微鏡的二維和三維圖像。載藥納米粒子呈圓球形，分散均勻，與透射電子顯微鏡結(jié)果一致；載藥納米粒子平均直徑在200 nm左右，與粒度儀測(cè)定結(jié)果一致，符合腫瘤靶向藥物遞送載體的要求。

圖3 原子力顯微鏡CS-Rh2-TPP載藥納米粒子二維圖像Fig.3 2D atomic force microscopic image of CS-Rh2-TPP nanoparticles

圖4 原子力顯微鏡CS-Rh2-TPP載藥納米粒子三維圖像Fig.4 3D atomic force microscopic image of CS-Rh2-TPP nanoparticles

2.6 納米粒子X(jué)射線衍射分析結(jié)果

圖5 人參皂苷Rh2、CS、CS-Rh2-TPP納米粒子的X射線衍射圖Fig.5 X-ray diffraction curves of ginsenoside Rh2, chitosan,and CS-Rh2-TPP

如圖5所示，CS的X射線衍射顯示在2θ為20.16°處有一個(gè)明顯的特征峰，制備成球后，該特征峰消失；且2θ為27.72°、12.06°處特征峰強(qiáng)度和位置發(fā)生改變，可能是由于交聯(lián)過(guò)程中CS晶型結(jié)構(gòu)破壞[31]。藥物Rh2呈現(xiàn)許多尖銳的晶體衍射峰，在CS-Rh2-TPP納米粒子體系中，衍射圖譜中沒(méi)有出現(xiàn)明顯的藥物晶體衍射峰。上述結(jié)果表明Rh2不是簡(jiǎn)單地與CS混合在一起，而是以無(wú)定形的形式存在于CS納米微粒中，形成了固相包合物。

2.7 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果

如圖6所示，隨著給藥質(zhì)量濃度的增加，游離Rh2和CS-Rh2-TPP載藥納米粒子對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用增強(qiáng)。在各個(gè)質(zhì)量濃度條件下，CS-Rh2-TPP載藥納米粒子較游離的Rh2呈現(xiàn)出更高的細(xì)胞毒性，這可能是載藥納米粒子對(duì)藥物的持續(xù)釋放引發(fā)的。游離的Rh2是通過(guò)自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用的，CS的生物黏附性能夠促進(jìn)細(xì)胞攝取藥物，將納米粒子遞送至胞內(nèi)緩慢釋放Rh2[32]。Chen Chao等[20]研究指出CS納米粒子可能通過(guò)內(nèi)吞作用被細(xì)胞攝取，質(zhì)子化的CS能夠通過(guò)靜電相互作用與細(xì)胞膜上的糖萼相互作用，加速納米粒子的內(nèi)化過(guò)程，提高包載藥物的滲透性和細(xì)胞毒性。

圖6 不同質(zhì)量濃度的人參皂苷Rh2和CS-Rh2-TPP載藥納米粒子對(duì)A549細(xì)胞的毒性Fig.6 Cytotoxicity of different concentrations of Rh2 and CS-Rh2-TPP on A549 cells

2.8 A549細(xì)胞對(duì)納米粒子的體外攝取結(jié)果

圖7 A549細(xì)胞對(duì)CS-Rh2-TPP載藥納米粒子的攝取Fig.7 Cellular uptake of CS-Rh2-TPP nanoparticles by A549 cells

在激光共聚焦顯微鏡下，CY5.5-NHS標(biāo)記的納米粒子呈紅色熒光，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。如圖7所示，相對(duì)于空白對(duì)照組，藥物處理過(guò)的A549細(xì)胞核周?chē)霈F(xiàn)紅色熒光，說(shuō)明納米粒子能夠內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞；孵育1 h后，細(xì)胞核附近熒光極其微弱，紅色熒光隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增強(qiáng)，表明更多的納米粒子被攝取進(jìn)入細(xì)胞，攝取過(guò)程呈時(shí)間依賴(lài)型。

3 結(jié) 論

本研究選用CS為載體，通過(guò)離子交聯(lián)法構(gòu)建了CS-Rh2-TPP納米粒子，實(shí)現(xiàn)對(duì)人參皂苷Rh2的包載，以提升藥物的溶解性和生物活性。實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化CS、TPP質(zhì)量比，CS的分子質(zhì)量以及投藥量等制備工藝，得到了粒徑可控、性能穩(wěn)定的納米粒子。CS-TPP納米粒子包載Rh2后，粒徑和Zeta-電位發(fā)生變化，當(dāng)載藥量適當(dāng)時(shí)，納米粒子呈圓球形，結(jié)構(gòu)規(guī)整、分布均一，具有較高的載藥量和包封率。X射線衍射圖譜表明藥物被成功地包被于納米粒子中。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CS-Rh2-TPP納米粒子能夠被細(xì)胞吞噬攝取，較游離的藥物具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性，綜上，該納米粒子有望成為腫瘤治療中遞送Rh2的理想載體。