聶小偉，陳志兵，顧曉慧，王曉玲，張 芹，任召珍，吳晴晴，王 磊

(威海海洋職業(yè)學(xué)院食品工程系，山東 威海 264300)

海帶是一種藥食同源的海洋巨藻，山東半島是我國海帶的主要產(chǎn)區(qū)[1-2]。目前，除少部分用于提取碘、甘露醇、海藻膠等產(chǎn)品深加工外，大部分以粗加工產(chǎn)品，如即食涼菜、鹽漬、海帶結(jié)和干制品為主，可以預(yù)見海帶深加工將在我國具有巨大的發(fā)展?jié)摿?。而海帶在加工過程中，會產(chǎn)生大量加工邊角料，造成資源浪費。如何充分利用海帶資源，提升其附加值，推動海帶加工產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，成為廣大學(xué)者研究的熱點。

研究表明，在海帶細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)存在一類天然生物大分子物質(zhì)——海帶多糖(包括海帶海藻酸、褐藻糖膠、昆布多糖等)，從海帶中分離出的海帶多糖具有增強(qiáng)免疫力、抗癌和防癌等功效，同時在抗凝血、抗病毒、減肥、降血糖和降血脂等方面具有顯著功效[3-7]。

目前，國內(nèi)外學(xué)者提取海帶多糖采用的主要方法有水提醇沉法、酸提法、堿提法、超聲波法和酶解法等。水提醇沉法簡單經(jīng)濟(jì)，但海帶多糖提取率較低，并且長時間高溫會導(dǎo)致海帶多糖結(jié)構(gòu)破壞[8]；堿提法和酸提法易導(dǎo)致海帶多糖降解，功能活性喪失[9-10]。而微波技術(shù)利用極性分子在電磁場中高速旋轉(zhuǎn)特性，加速活性分子溶出，具有提取率高、耗能低、時間短等優(yōu)勢[11]，在植物活性物質(zhì)提取中得到廣泛應(yīng)用[12]。復(fù)合酶解法可針對植物細(xì)胞壁組成和結(jié)構(gòu)，充分破壞植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，條件溫和，在海帶多糖提取率顯著提高的同時，可有效保護(hù)活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性[13]。近年來，將微波輔助浸提技術(shù)和生物酶解技術(shù)結(jié)合是一種新型的破壁提取方法，與傳統(tǒng)方法相比具有節(jié)能、快速、條件溫和、提取效率高等優(yōu)勢，已廣泛用于植物有效成分的提取[14]。

為改善現(xiàn)有海帶多糖提取方法的操作時間長、提取率低等不足，本研究擬結(jié)合木瓜蛋白酶、果膠酶、纖維素酶的酶解條件溫和、環(huán)保低能耗等特點與微波的高效節(jié)能等優(yōu)勢，采用微波-復(fù)合酶輔助提取海帶加工下腳料的海帶多糖，探求其最佳工藝條件，并對該方法獲取的海帶多糖體外抗氧化性能進(jìn)行研究，旨在為海帶多糖的提取研究提供新方法、新思路，為海帶多糖的實際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

木瓜蛋白酶(酶活力為1×105U/g，下同)購自浙江多味化工食品有限公司；纖維素酶(1×105U/g)購自寧夏夏盛實業(yè)集團(tuán)有限公司；果膠酶(6×104U/g)購自河南華銳化工產(chǎn)品有限公司；海帶加工廢棄物購自山東海之寶生物科技有限公司；檸檬酸(食品級)購自連云港科德食品配料有限公司；磷酸氫二鈉(食品級)購自濰坊英軒實業(yè)有限公司；苯酚購自天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；濃硫酸購自煙臺市雙雙化工有限公司；2,4,6-三吡啶基三秦(TPTZ)、七水合硫酸亞鐵、三羥甲基氨基甲烷、番紅、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。本研究所用分析化學(xué)試劑均為分析純。

MAS-Ⅱ plus型常壓微波合成/萃取反應(yīng)工作站購自上海新儀微波化學(xué)科技有限公司，SHA-C型恒溫振蕩器購自常州國華電器有限公司，V-1800型可見分光光度計購自翔藝儀器(上海)有限公司，BT125D型電子分析天平購自賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司，SC-3612型低速離心機(jī)購自安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司，RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自上海亞榮生化儀器廠，SHB Ш型循環(huán)水式多用真空泵購自鄭州長城科工貿(mào)易有限公司，DS-T300型高速多功能粉碎機(jī)購自上海頂帥電器有限公司。

1.2 樣品前處理

將新鮮的海帶加工廢棄料(初加工產(chǎn)品整形邊角料，冷凍儲藏)解凍、洗凈后切成3～5 cm條狀，在60 ℃下真空干燥至水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%以下；冷卻至室溫，經(jīng)高速組織粉碎機(jī)粉碎后，過40目標(biāo)準(zhǔn)篩，迅速裝入自封袋置于玻璃干燥器中保存待用。

1.3 酶種類的篩選

1.3.1 纖維素酶輔助提取 稱取2.00 g按照“1.2”處理過的樣品，在預(yù)試驗基礎(chǔ)上，選取pH5.5的水緩沖體系(磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，下同)，在液料比40.00 mL/g，溫度55 ℃，纖維素酶添加量(2.00 g樣品中達(dá)到的酶活力，下同)3.00×103U下酶解240 min后，在80 ℃下水浴滅酶10 min，離心過濾，取上清液定容，按“1.7”方法測定計算海帶多糖提取率。試驗平行3次，其結(jié)果取平均值。

1.3.2 果膠酶輔助提取 選取pH4.0的水緩沖體系和果膠酶添加量1.80×103U，按“1.3.1”方法進(jìn)行試驗。

1.3.3 木瓜蛋白酶輔助提取 選取pH6.0的水緩沖體系和木瓜蛋白酶添加量4.00×103U，按“1.3.1”方法進(jìn)行試驗。

1.3.4 復(fù)合酶輔助提取 選取pH6.0的水緩沖體系，纖維素酶、木瓜蛋白酶和果膠酶添加量3.40×103U、 3.00×103U和 1.56×103U(預(yù)試驗基礎(chǔ)上確定上述比例)，按“1.3.1”方法進(jìn)行試驗。

1.4 微波-復(fù)合酶輔助處理順序?qū)嵝Ч挠绊?/h3>

1.4.1 先酶解再微波處理 稱取2.00 g經(jīng)“1.2”處理的樣品，以樣品質(zhì)量40倍的pH5.0的水緩沖體系為浸提介質(zhì)，纖維素酶、木瓜蛋白酶、果膠酶添加量同“1.3.4”，在55 ℃下保溫酶解浸提240 min，過濾。濾渣在微波功率500 W，樣品質(zhì)量30倍的pH7.5的水浸提介質(zhì)中，75 ℃保溫浸提20 min，離心過濾。合并兩次上清液定容后，按“1.7”的方法測定計算海帶多糖提取率。試驗平行3次，結(jié)果取平均值。

1.4.2 微波、酶解同時處理 稱取2.00 g經(jīng)“1.2”處理的樣品，以樣品質(zhì)量30倍的pH5.0的水緩沖體系為浸提介質(zhì)，纖維素酶、木瓜蛋白酶、果膠酶添加量同“1.3.4”，在微波功率500 W，55 ℃下保溫浸提240 min(微波工作方式為工作1 min停歇12 min)，離心過濾。上清液定容后，按“1.7”的方法測定計算海帶多糖提取率。試驗平行3次，結(jié)果取平均值。

1.4.3 先微波再酶解處理 按“1.4.1”試驗方法和參數(shù)，先微波后酶解處理。

1.5 微波-復(fù)合酶輔助提取單因素試驗

1.5.1 微波浸提單因素試驗設(shè)計 按照“1.4”確定的方法提取海帶多糖，考察微波輔助浸提下水浸提液pH、微波溫度、微波時間、液料比以及微波功率對海帶多糖浸提效果的影響。每個因素試驗平行3次，結(jié)果取平均值。

1.5.2 酶解浸提單因素試驗設(shè)計 按照“1.3”確定的酶種類，考察微波浸提海帶殘渣酶解輔助浸提下的pH、酶解溫度、液料比、3種酶添加量、酶解時間對海帶多糖浸提效果的影響。每個因素試驗平行3次，結(jié)果取平均值。

1.6 優(yōu)化試驗設(shè)計

1.6.1 微波浸提響應(yīng)面試驗設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，在以水為浸提介質(zhì)、微波功率為400 W下，根據(jù)Box-Behnken原理，采用Design-Expert 8.0.5進(jìn)行4因素3水平試驗，確定海帶多糖微波輔助浸提最佳條件[15]。以海帶多糖提取率為指標(biāo)，緩沖溶液的pH、液料比、微波溫度和時間為自變量，試驗因素水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表Tab.1 Factors and levels of the response surface

1.6.2 酶解浸提正交試驗設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，固定液料比為40.00 mL/g，以海帶多糖提取率為評價指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗設(shè)計優(yōu)化[16]，確定最佳酶添加量、pH、溫度和時間，試驗因素水平見表2。

表2 L18(37) 正交試驗因素水平選取Tab.2 Selection of L18(37) orthogonal test on factors and levels

1.7 海帶多糖提取率計算

參照徐光域等(2005)[17]運(yùn)用硫酸-苯酚法測定海帶多糖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，且空白試樣以純水代替待測海帶多糖樣品進(jìn)行測定，海帶多糖提取率的計算公式如下：

(1)

式(1)中：Y為海帶多糖提取率(g/kg)，C為浸提液海帶多糖濃度(mg/L)，V為測定取樣體積(mL)，F(xiàn)為測定樣品稀釋倍數(shù)，m為稱取海帶粉質(zhì)量(g)。

1.8 抗氧化性測定

1.8.1 總抗氧化能力測定 參照魏碧娜(2016)繪制FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法[18]，求得回歸線性方程為Y=3.883 3X+0.037(r2=0.999 6)，其中Y為593 nm下吸光值，X為FeSO4濃度(mmol/L)。取海帶多糖樣品稀釋成200 mg/L的待測溶液，然后取上述待測溶液0.20 mL，再加入1.80 mL TPTZ工作溶液(稱取TPTZ樣品31.233 mg，用40 mmol/L的鹽酸定容至10 mL，即得10 mmol/L的TPTZ工作溶液)混勻后置于37 ℃水浴中保溫10 min，在593 nm處測定吸光值?？瞻捉M以超純水代替待測樣，其他條件相同。

1.8.2 羥自由基(·OH)清除能力測定 將制得的海帶多糖樣品稀釋成200 mg/L的待測溶液。以200 mg/L維生素C溶液做陽性對照，在測定管中依次加入磷酸鹽緩沖液(0.15 mol/L，pH7.4)1.00 mL，番紅溶液(360 ug/mL)1.00 mL，EDTA-Fe(2 mmol/L)0.50 mL，待測樣液1.00 mL，體積分?jǐn)?shù)為3%的H2O21.00 mL，反應(yīng)總體積為4.50 mL。將待測溶液混勻，在37 ℃水浴中保溫30 min；迅速冷卻至室溫，在520 nm處測定吸光值?？瞻捉M：以1.00 mL蒸餾水代替待測樣品；對照組：以1.00 mL維生素C溶液(200 mg/L)代替待測樣品[18]。其計算公式如下：

T=(A樣品-A空白)/(A對照-A空白)×100

(2)

式(2)中：T為羥自由基清除率(%)，A樣品為樣品在520 nm處吸光值，A對照為對照組在520 nm處吸光值，A空白為空白組在520 nm處吸光值。

1.8.3 DPPH自由基消除能力測定 用100%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇配制濃度為120 umol/L的DPPH，用40%甲醇配制200 mg/L的海帶多糖樣品。取4 mL樣品，加入1 mL DPPH，在30 ℃水浴保溫30 min，517 nm處測定吸光值。空白組用40%甲醇溶液代替待測樣品[19-20]。計算公式如下：

t=(1-B樣品/B空白)×100

(3)

式(3)中：t為清除率(%)，B樣品為樣品組在517 nm處的吸光值，B空白為空白對照組在517 nm處的吸光值。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、繪制圖表；運(yùn)用Design-Expert 8.0.5軟件對響應(yīng)曲面法設(shè)計試驗結(jié)果進(jìn)行方程擬合、參數(shù)優(yōu)化和方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶種類篩選

纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶及復(fù)合酶分別酶解海帶制備海帶多糖的效果見圖1。3種酶的復(fù)合酶輔助提取效果最好，海帶多糖提取率達(dá)到126.38 g/kg；其次為纖維素酶和木瓜蛋白酶；果膠酶輔助提取效果最差，但海帶多糖提取率也達(dá)到94.16 g/kg。從生產(chǎn)效率和成本的角度出發(fā)，選取3種酶的復(fù)合酶輔助提取制備海帶多糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 微波-復(fù)合酶輔助提取順序的確定

微波輔助提取與復(fù)合酶輔助提取順序?qū)Ф嗵翘崛⌒Ч挠绊懸妶D2。先微波再復(fù)合酶輔助提取效果最好，較先復(fù)合酶輔助提取再微波和微波-復(fù)合酶同時輔助提取效果有顯著提高，其海帶多糖提取率達(dá)到176.53 g/kg。從生產(chǎn)效率的角度出發(fā)，選取先微波再復(fù)合酶輔助提取制備海帶多糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化。

圖1 不同種類酶對提取效果的影響Fig. 1 Effects of different kinds of enzymes on extraction efficiency

圖2 微波與復(fù)合酶輔助提取順序?qū)μ崛⌒Ч挠绊慒ig. 2 Effects of microwave and compound enzyme-assisted extraction sequence on extraction efficiency

2.3 微波輔助提取響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面設(shè)計方案與試驗結(jié)果 在單因素試驗研究基礎(chǔ)上，確定對浸提效果影響較大的pH、溫度、時間、液料比等4個因素，采用Box-Benhnken中心組合方法設(shè)計響應(yīng)面試驗方案[21]。以海帶多糖提取率為響應(yīng)值，響應(yīng)曲面試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)曲面分析試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.3 Experimental design and results of the response surface

運(yùn)用Design-Expert 8.0.5軟件對表3中的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸擬合，構(gòu)建回歸模型，得到海帶多糖提取率與pH、溫度、時間、液料比等4個因素變量的二次多項式回歸方程：

Y=98.17+8.06A+4.08B+1.77C+8.04D

-0.90A·B+3.41A·C+2.05A·D

+2.04B·C-3.50B·D-1.95C·D-22.89A2

-6.55B2-3.87C2+0.02D2

(4)

式(4)中：A、B、C、D分別為pH、溫度、時間和液料比。

由回歸方程中一次方因素系數(shù)值大小可得出，各因素對海帶多糖提取率的影響大小順序為pH>液料比>溫度>時間。

2.3.2 回歸方程的建立及方差分析 由表4可知，回歸方程模型顯著(p<0.05)，而失擬項不顯著(p>0.05)；校正決定系數(shù)值為0.952 6，預(yù)測決定系數(shù)值為0.905 1，表明試驗結(jié)果與模型預(yù)測值聯(lián)系緊密，該回歸模型方程擬合性較好，可準(zhǔn)確考察各因素對微波輔助浸提海帶多糖的影響。

從表4可以看出，一次項A、B、D均達(dá)到了極顯著的水平(p<0.01)，而C是不顯著的(p>0.05)，說明pH、溫度和液料比對海帶多糖提取率的影響較大，因此要得到良好的浸提效果，就應(yīng)該嚴(yán)格控制浸提液的pH、溫度和液料比；而浸提時間達(dá)到一定范圍之后，對海帶多糖提取率影響不大。兩兩因素間的交互作用均不顯著(p>0.05)，表明因素之間的交互作用對海帶多糖提取率的影響不大。同時，二次項A2、B2表現(xiàn)為極顯著(p<0.01)，C2顯著(p<0.05)，而D2不顯著(p>0.05)。

表4 回歸方程的方差分析Tab. 4 Analysis of variance of regression equation

2.3.3 響應(yīng)曲面分析 圖3～8是依據(jù)回歸方程繪制的海帶多糖提取率與各因素交互作用項的響應(yīng)面關(guān)系圖，反映了各因素在海帶多糖提取過程中對響應(yīng)值的影響。

從圖3～8可以看出，海帶多糖提取率隨pH、溫度、時間的增大而增大，達(dá)到各因素中心值以后，提取率隨各因素增大而逐漸減小。對比各圖可知，pH對海帶多糖的提取率影響最大，表現(xiàn)為圖3～8的曲面較陡，由此可知，浸提液pH大小對海帶多糖提取效果至關(guān)重要；其次是溫度，再次是液料比。而響應(yīng)曲面隨微波浸提時間的變化幅度不大，說明該因素對海帶多糖提取率影響較小。

圖3～8中等高線橢圓形狀不明顯，由此可判別各因素之間的交互作用不強(qiáng)，驗證了回歸方程模型的方差分析是可靠的，說明響應(yīng)曲面法優(yōu)化設(shè)計可以很好的預(yù)測微波溫度、時間、pH和液料比等4個因素對海帶加工下腳料中海帶多糖提取率的影響。

圖3 pH與溫度相互作用的響應(yīng)面Fig. 3 Response surface plot of interaction between pH and temperature

圖4 pH與時間相互作用的響應(yīng)面Fig. 4 Response surface plot of interaction between pH and time

圖5 pH與液料比相互作用的響應(yīng)面Fig. 5 Response surface plot of interaction between pH and ratio of solvent to substrate

圖6 溫度與時間相互作用的響應(yīng)面Fig. 6 Response surface plot of interaction between temperature and time

圖7 溫度與液料比相互作用的響應(yīng)面Fig. 7 Response surface plot of interaction between temperature and ratio of solvent to substrate

圖8 時間與液料比相互作用的響應(yīng)面Fig. 8 Response surface plot of interaction between time and ratio of solvent to substrate

通過回歸方程模型擬合計算出微波浸提最佳提取工藝條件為：微波功率400 W、 pH6.6、溫度60 ℃、時間12.3 min和液料比60.00 mL/g，海帶多糖提取率的理論值可達(dá)107.40 g/kg。

為試驗操作方便，將工藝條件修正如下：微波功率400 W、 pH6.5、溫度60 ℃、時間12 min和液料比60.00 mL/g，進(jìn)行3次驗證性試驗，得海帶多糖的平均提取率為106.49 g/kg，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.14%，與預(yù)測值的相對誤差為0.85%，驗證值與預(yù)測值基本相符，可見運(yùn)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化微波輔助提取海帶多糖的工藝條件切實可行。

按上述所得修正的最佳工藝條件對海帶多糖進(jìn)行連續(xù)提取，結(jié)果表明，兩次后海帶多糖提取率為(107.52±0.16)g/kg，3次后海帶多糖提取率僅為(108.84±0.13)g/kg，可見增加微波浸提次數(shù)已無法大幅提高海帶多糖提取率，所以需要輔以其他方法來進(jìn)一步使海帶多糖從細(xì)胞中溶出，進(jìn)而提高海帶多糖提取率，避免資源浪費。

2.4 復(fù)合酶解輔助提取正交優(yōu)化試驗結(jié)果

以單因素試驗為基礎(chǔ)，選取酶解pH、溫度、時間和酶添加量(纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶)為考察因素，以海帶多糖提取率作為評價指標(biāo)，通過L18(37)正交試驗，試驗結(jié)果及極差分析如表5所示。

表5 L18(37) 正交試驗方案及結(jié)果Tab. 5 L18(37) orthogonal design and the results

由表5可知，以海帶多糖提取率為評價指標(biāo)，各因素對海帶多糖提取率影響的主次順序為時間>pH>果膠酶添加量>纖維素酶添加量>木瓜蛋白酶添加量=溫度。由表5直觀分析可知，酶解輔助浸提海帶多糖的最佳工藝條件為：液料比40.00 mL/g，溫度55 ℃、 pH6.0、時間105 min、纖維素酶4.00×103U、木瓜蛋白酶4.00×103U、果膠酶2.40×103U。在上述工藝條件下，海帶多糖的提取率為115.16 g/kg。

在上述最佳條件下，按照“1.3.1”方法，進(jìn)行微波-復(fù)合酶輔助提取海帶多糖，得海帶多糖平均提取率為208.93 g/kg，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.18%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.08%，較單獨使用微波或酶解技術(shù)浸提海帶多糖提取率有顯著提升[21-22]。同時，也說明本研究微波-復(fù)合酶輔助提取海帶多糖的工藝條件真實可靠，穩(wěn)定性較好，在實際生產(chǎn)中具有參考價值。

2.5 抗氧化性能測定

海帶多糖提取物樣品抗氧化能力結(jié)果如表6所示，測得其總抗氧化能力為0.128 0 mg/mL，對羥自由基和DPPH自由基清除率分別為64.10%和4.99%?？梢姡ㄟ^微波-復(fù)合酶輔助提取的海帶多糖提取物組分是具有還原性的多糖，總抗氧化能力顯著。對羥自由基有較強(qiáng)的清除能力，而對DPPH自由基的清除能力不強(qiáng)，可能與其濃度較低有關(guān)，但也可以作為自由基的抑制劑或清除劑的潛在抗氧化劑，有待做進(jìn)一步深入研究。

表6 抗氧化能力結(jié)果Tab. 6 Results of antioxidant capacity

3 結(jié)論

通過對微波-復(fù)合酶輔助提取海帶加工下腳料中海帶多糖的工藝進(jìn)行研究，最終得到微波-復(fù)合酶輔助提取海帶多糖的最佳工藝條件為：微波功率400 W、 pH6.5、溫度60 ℃、時間12 min和液料比60.00 mL/g，第二步酶解輔助浸提液料比40.00 mL/g，溫度55 ℃、 pH6.0、時間105 min、纖維素酶添加量4.00×103U、木瓜蛋白酶添加量4.00×103U、果膠酶添加量2.40×103U，在最佳工藝條件下海帶多糖的提取率可達(dá)(208.93±0.18) g/kg。因此，微波-復(fù)合酶輔助適用于海帶多糖的提取，與傳統(tǒng)酸液提取法、微波提取法及復(fù)合酶法、熱水浸提法相比，具有提取率顯著提高、總操作時間短、條件溫和、耗能低等優(yōu)點。上述參數(shù)下制得的海帶多糖清除羥自由基的能力較強(qiáng)，其具有的抗氧化活性，使其有望作為天然抗氧化劑和功能性產(chǎn)品而得到開發(fā)利用，成為提升海帶資源綜合開發(fā)利用水平的突破口。