沙依拜沙比提叢媛媛古麗尼歌爾阿布都米吉提帕麗達阿不力孜

(新疆醫(yī)科大學藥學院,烏魯木齊 830011)

惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康的一類常見疾病,尋找有效的抗癌藥物和方法是世界醫(yī)學面臨的重要課題。研究發(fā)現(xiàn)中藥治療惡性腫瘤,無論是在減輕臨床癥狀,提高生存質(zhì)量,防止復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,延長生存期,還是在與放化療配合,增效減毒等方面都有很好的效果。

阿里紅(Fomes Officinals(Vill.ex.Fr.) Ames)是一種藥用菌,隸屬多孔菌科、層孔菌屬[1]。研究發(fā)現(xiàn),阿里紅中所含多糖(FOPS)為阿里紅藥材的活性成分之一,具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化等藥理作用[2-4]。課題組前期研究表明阿里紅多糖在體外具有抗腫瘤活性[5],但鮮有阿里紅多糖體內(nèi)抗腫瘤作用的報道。因此,本研究使用S180 荷瘤小鼠,研究阿里紅多糖體內(nèi)抗腫瘤作用效果和機制,旨在為后續(xù)阿里紅藥效學研究提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

60 只6 周齡SPF 級雄性昆明小鼠,體重18 ～20 g,購買于新疆醫(yī)科大學動物實驗中心【SCXK(新)2018-0002】。飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學動物實驗中心【SYXK(新)2018-0003】。飼養(yǎng)期間各組小鼠自由飲水,飼喂普通維持飼料由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境:晝夜各半循環(huán)照明,恒溫 22 ～ 25℃、恒濕 40% ～ 70%。鼠源 S180 腹水瘤細胞,購自上海中喬新舟公司,由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心傳代保種。所有操作均符合新疆醫(yī)科大學倫理委員會要求( 批準文號: IACUC-20170222046)。

1.1.2 試藥

阿里紅藥材購于新疆維吾爾醫(yī)院,由新疆醫(yī)科大學天藥/生藥教研室帕麗達·阿不力孜教授鑒定為阿里紅Fomes OfficinalsAmes。按文獻[6]制備FOPS,得率為3.06%,通過苯酚硫酸法測得含量為57.4%,用生理鹽水制備5、10、20 mg/mL 藥液待用。注射用環(huán)磷酰胺(CTX, 盛迪醫(yī)藥有限公司,18102525),生理鹽水制備成5 mg/mL 藥液待用。

1.1.3 主要試劑與儀器

TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-1β、IL-6 ELISA 試劑盒(安徽巧伊生物公司);引物β-actin、p38MAPK、p-cjun(上海生工生物有限公司);抗體β-actin(CST 公司);p38MAPK、p-NF-κB(Abcam 公司);p-c-jun、NF-κB(Bioswamp 公司);BCA 蛋白定量試劑盒、蛋白分子量標準Marker、特超敏ECL 化學發(fā)光試劑盒(索萊寶公司);實時熒光定量PCR 試劑盒(TaKaRa 公司)。

Multiskan Go 全波長酶標儀(美國 Thermo 公司);AB304-S 電子分析天平(德國梅特勒公司);UV2700 紫外-可見分光光度計(日本島津公司);3-30 K 臺式低溫離心機(德國 Sartorius 公司);BC-5000VET 血細胞分析儀(中國Mindray 公司)。

1.2 方法

1.2.1 荷瘤模型制備

常規(guī)方法復(fù)蘇S180 小鼠腹水瘤細胞,取0.2 mL 細胞懸液注射于健康小鼠腹腔,連續(xù)傳代兩次得到S180 腹水瘤小鼠。無菌條件下抽取腹水,調(diào)整濃度至每毫升1 × 107個,注射細胞懸液于適應(yīng)飼養(yǎng)7 d 后的小鼠腋部皮下制備S180 荷瘤模型。

1.2.2 動物分組及給藥

將50 只建模成功小鼠隨機分為模型組、陽性對照組、FOPS 低、中、高劑量組,健康小鼠作為空白組,每組10 只?？瞻捉M與模型組給予生理鹽水灌胃,陽性對照組腹腔注射50 mg/kg 環(huán)磷酰胺,低、中、高劑量組給予不同濃度(50、100、200 mg/kg)FOPS 灌胃,連續(xù)給藥15 d。每日記錄小鼠體重,觀察小鼠飲食飲水、活動狀態(tài)等一般表現(xiàn)。

1.2.3 抑瘤率及臟器指數(shù)檢測

末次給藥24 h 后,頸椎脫臼處死小鼠,剝離瘤塊、臟器稱重,計算抑瘤率、臟器指數(shù)。抑制率(%)=(模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100%,臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體重。

1.2.4 外周血血常規(guī)檢測

小鼠取血,BC-5000Vet 血細胞分析儀檢測白細胞、淋巴細胞數(shù)目。

1.2.5 血清細胞因子含量檢測

小鼠取血,靜置2 h,4℃條件下3000 r/min 離心10 min 分離血清。按照ELISA 試劑盒說明書檢測血清 TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-1β、IL-6 含量。

1.2.6 小鼠臟器病理學觀察

剝離心、肝、脾、肺、腎等組織用4%甲醛固定,經(jīng)石蠟包埋、切片、HE 染色觀察病理學變化。

1.2.7 腫瘤組織 p38MAPK 和p-c-junmRNA 表達量檢測

液氮研磨適量腫瘤組織,使用TRIzol 試劑提取總RNA,測定RNA 總濃度,使用PCR 循環(huán)儀進行逆轉(zhuǎn)錄。用 qRT-PCR 定量檢測 p38MAPK 和p-c-junmRNA 表達量,用 2-△△Ct分析法計算結(jié)果,引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.8 腫瘤組織 p38MAPK、p-c-jun、NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表達量檢測

液氮研磨適量腫瘤組織,加入RIPA 裂解液提取蛋白。在4℃條件下,12 000 r/min 離心10 min,取上清液,使用BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。適宜條件下,進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育,二抗孵育等步驟。ECL 化學發(fā)光試劑曝光顯影,Image J 圖像分析法進行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

通過SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學分析,采用單因素方差分析,數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值± 標準差(±s)表示,P< 0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 FOPS 對荷瘤小鼠體重的影響

第1 ～3 天各組小鼠一般表現(xiàn)正常。第4 ～7天小鼠腋部皮下出現(xiàn)明顯瘤組織;模型組與陽性對照組小鼠皮毛粗糙、精神萎靡,與模型組比較,FOPS低、中、高劑量組小鼠精神狀態(tài)、飲食狀態(tài)良好。第8 ～15 天模型組小鼠瘤組織較大、右肢失去功能、皮毛稀松,陽性對照組食欲差、呼吸急促,由圖1 可見,體重下降,差異有顯著性(P< 0.01)。與模型組比較,FOPS 低、中、高劑量組皮毛光滑、體重變化小,差異無顯著性。

注:與模型組比較,*P< 0.05,??P< 0.01。(下圖/表同)圖1 FOPS 對荷瘤小鼠體重的影響(n=10)Note. Compared with model group,*P< 0.05,??P< 0.01. (The same in the following figures and tables)Figure 1 Effect of FOPS on body weight of tumor-bearing mice(n=10)

2.2 FOPS 對荷瘤小鼠瘤重、抑瘤率的影響

由表2 可見,與模型組比較,陽性對照組、FOPS低、中、高劑量組小鼠平均瘤重均明顯減小,差異有顯著性(P< 0.05),FOPS 低劑量組小鼠平均瘤重小于FOPS 中、高劑量組。陽性對照組、FOPS 低、中、高劑量組抑瘤率分別為84.87%、54.29%、40.57%、30.84%。結(jié)果提示,FOPS 對S180 荷瘤小鼠腫瘤生長有抑制作用。

表2 FOPS 對荷瘤小鼠瘤重、抑瘤率的影響(n=10)Table 2 Effect of FOPS on tumor weight and tumor inhibition rate of tumor-bearing mice(n=10)

2.3 FOPS 對荷瘤小鼠臟器指數(shù)、白細胞、淋巴細胞數(shù)目的影響

由表3 可見,與模型組比較,FOPS 低、中劑量組小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、白細胞數(shù)目均顯著升高(P< 0. 05),FOPS 低劑量組淋巴細胞數(shù)目顯著升高(P< 0. 05)。結(jié)果提示,FOPS 可提高荷瘤小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù),升高白細胞、淋巴細胞數(shù)目。

2.4 FOPS 對荷瘤小鼠血清細胞因子的影響

由表4 可見,與模型組比較,FOPS 低、中劑量組TNF-α 含量均顯著升高(P< 0.05),FOPS 低劑量組IFN-γ 含量顯著升高(P< 0.05),FOPS 低、中、高劑量組IL-2 含量顯著升高(P< 0.05),FOPS 低、中、高劑量組 IL-1β、IL-6 含量顯著降低(P< 0.01)。該結(jié)果提示 FOPS 可升高荷瘤小鼠血清 TNF-α、IFN-γ、IL-2 含量,降低 IL-1β、IL-6 含量。

2.5 FOPS 對荷瘤小鼠臟器病理學的影響

由圖2 知,各組小鼠心臟組織切片心肌纖維排列整齊,形態(tài)正常。空白組肝細胞結(jié)構(gòu)完整,排列整齊,胞質(zhì)豐富,核仁清晰;模型組與陽性對照組肝細胞排列分散無序,與模型組比,FOPS 低、中、高劑量組小鼠肝細胞排列規(guī)則,形態(tài)基本正常。空白組小鼠脾組織細胞排列整齊緊密,紅髓與白髓分界清晰;模型組與陽性對照組小鼠脾組織紅髓與白髓分界不清,不易觀察;與模型組比,FOPS低、中、高劑量組小鼠脾組織細胞排列相對整齊,紅髓和白髓分界可見。各組小鼠肺組織切片組織結(jié)構(gòu)疏松呈蜂窩狀,未見炎細胞浸潤現(xiàn)象?？瞻捉M腎組織細胞形態(tài)正常,結(jié)構(gòu)完整;模型組腎組織細胞排列紊亂,腎小球體積減小;與模型組比較,FOPS 低、中、高劑量組腎小球結(jié)構(gòu)相對完整,細胞排列相對整齊。

2.6 FOPS 對荷瘤小鼠腫瘤組織p38MAPK 和pc-jun mRNA 表達的影響

由表5 可見,與模型組比較,FOPS 低、中劑量組小鼠p38MAPK mRNA 表達量升高,差異具有顯著性(P< 0.05),FOPS 低劑量組小鼠p-c-junmRNA 表達量升高,差異具有顯著性(P< 0.01)。

表3 FOPS 對荷瘤小鼠臟器指數(shù)、白細胞、淋巴細胞數(shù)目的影響(n=10)Table 3 Effect of FOPS on organ index, WBC and LYM of tumor-bearing mice(n=10)

表4 FOPS 對荷瘤小鼠血清細胞因子的影響(n=10)Table 4 Effect of FOPS on serum cytokines of tumor-bearing mice(n=10)

2.7 FOPS 對荷瘤小鼠腫瘤組織 p38MAPK、p-cjun、NF-κB 和 p-NF-κB 蛋白表達的影響

由表6、圖3 可見,與模型組比較,FOPS 低劑量組p38MAPK 表達量升高,差異具有顯著性(P<0.05),FOPS 低、中劑量組p-c-jun表達量均升高,差異具有顯著性(P< 0.05),FOPS 低、中、高劑量組p-NF-κB 表達量均升高,差異具有顯著性(P<0.01)。

表5 FOPS 對荷瘤小鼠腫瘤組織p38MAPK 和p-c-jun mRNA 表達的影響(n=6)Table 5 Effect of FOPS on p38MAPK and p-c-jun mRNA expression in tumor tissues of tumor-bearing mice(n=6)

圖2 FOPS 對荷瘤小鼠臟器病理學變化的影響Figure 2 Effect of FOPS on histopathological changes in tissues of tumor-bearing mice

表6 FOPS 對荷瘤小鼠腫瘤組織 p38MAPK、p-c-jun、NF-κB 和 p-NF-κB 蛋白表達的影響(n=6)Table 6 Effect of FOPS on p38MAPK, p-c-jun, NF-κB and p-NF-κB protein expression in tumor tissues of tumor-bearing mice(n=6)

圖3 FOPS 對荷瘤小鼠腫瘤組織p38MAPK、p-c-jun、NF-κB 和 p-NF-κB 蛋白表達的影響Figure 3 Effect of FOPS on p38MAPK, p-c-jun, NF-κB and p-NF-κB protein expression in tumor tissues of tumor-bearing mice

3 討論

3.1 FOPS 對荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用

惡性腫瘤治愈率低、致死率高,是嚴重危害人類健康的疾病之一[7]。環(huán)磷酰胺等抗腫瘤藥物對多種實體瘤有良好的抑制作用,在小鼠S180 移植瘤模型中常被用作陽性對照藥。但其消化道反應(yīng)、生殖毒性、骨髓抑制及免疫抑制等嚴重毒副作用及不良反應(yīng)[8],對人體產(chǎn)生較大損害。天然來源的植物多糖具有調(diào)節(jié)機體免疫、增強抗腫瘤活性、抗病毒、抗氧化等眾多功效,且毒性反應(yīng)及副作用小[9-11]。本研究結(jié)果顯示,與模型組比較,FOPS 低、中、高劑量組小鼠瘤重均減小,差異具有顯著性(P< 0.05),FOPS 低劑量組抑瘤效果優(yōu)于FOPS 中、高劑量組。通常,藥物在一定范圍內(nèi)具有優(yōu)良效果,超過范圍藥效降低、消失甚至產(chǎn)生毒副作用。該結(jié)果表明,FOPS 對荷瘤小鼠腫瘤生長具有抑制作用,從量效關(guān)系來看不同濃度的FOPS 對荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用不同,并不是劑量越大藥效越好。造成這種劑量與藥效關(guān)系不成正比的原因可能是,FOPS是粗多糖,其中不同的多糖組分可能具有各自的作用途徑或有效濃度范圍,對不同的組織、細胞和細胞因子表達產(chǎn)生的影響可能不同。并且,中藥存在多成分、多靶點的特性,FOPS 劑量升高可能抑制或激活了其他作用靶點或受體,使其抗腫瘤活性降低。

3.2 FOPS 對荷瘤小鼠免疫功能的影響

脾和胸腺是哺乳動物最主要的免疫器官。脾和胸腺發(fā)生功能或器質(zhì)性改變,表現(xiàn)為淋巴細胞、白細胞減少和細胞因子的改變,極大增加細菌和病毒感染的機會[12-14]。本研究結(jié)果顯示,FOPS 可提高荷瘤小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù),升高小鼠外周血白細胞、淋巴細胞數(shù)目,差異具有顯著性(P< 0.05),該結(jié)果提示FOPS 改善機體免疫功能。

3.3 FOPS 對荷瘤小鼠細胞因子的影響

TNF-α 是由單核細胞與巨噬細胞產(chǎn)生的多肽類細胞因子,對腫瘤具有直接溶解和抑制增殖的作用。IFN-γ 由淋巴細胞與NK 細胞產(chǎn)生,可通過增加TNF-α 的釋放來達到殺傷腫瘤細胞的作用。IL-2 可促進IFN-γ 分泌,也可促進 T、B 細胞活化和增殖,并最終提高細胞和體液反應(yīng)[15-16]。IL-6、IL-1β 的大量產(chǎn)生則會引起廣泛的炎癥反應(yīng),促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[17-18]。研究表明,FOPS 升高 TNF-α、IL-2、IFN-γ等細胞因子含量(P< 0.05),降低IL-6、IL-1β含量(P< 0.01),從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

3.4 FOPS 對荷瘤小鼠臟器病理學的影響

本研究通過對心、肝、脾、肺、腎等臟器進行病理學觀察考察FOPS 的安全性,結(jié)果顯示FOPS 能減輕荷瘤小鼠臟器損傷,并且安全性較高。

3.5 FOPS 對 MAPK/NF-κB 信號通路的影響

MAPK/NF-κB 信號通路在多種腫瘤組織及細胞內(nèi)活化表達,已成為研究抗腫瘤藥物的熱門靶點之一。MAPK 是細胞內(nèi)廣泛存在的絲/蘇氨酸蛋白激酶,與細胞周期調(diào)節(jié)、細胞存活、細胞因子分泌等過程有關(guān)[19-20]。NF-κB 在細胞受到刺激時發(fā)生磷酸化,從細胞質(zhì)進入細胞核內(nèi),與核內(nèi)DNA 特異序列結(jié)合,啟動或增強相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。在癌癥早期,NF-kB 可以抑制腫瘤生長,但突變的積累可能導致腫瘤抑制功能喪失。NF-κB 被視為應(yīng)激反應(yīng)因素,在炎癥過程中同時產(chǎn)生促炎和抗炎介質(zhì),發(fā)揮何種作用抑制腫瘤取決于時間和組織[21]。本研究結(jié)果表明,FOPS 能夠上調(diào)腫瘤組織 p38MAPK 和p-cjunmRNA表達及 p38MAPK、p-c-jun和p-NF-κB 蛋白表達,差異具有顯著性(P< 0.05),激活MAPK/NF-κB 信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述,體內(nèi)給予FOPS 可抑制S180 荷瘤小鼠腫瘤生長,調(diào)節(jié)荷瘤小鼠血清細胞因子含量,其機制與激活MAPK/NF-κB 信號通路有關(guān)。