李丹蔡方舟李哲王衛(wèi)

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所,新發(fā)再發(fā)傳染病動物模型研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100021)

人乳頭瘤病毒(human papillomavirs,HPV)可引起多種常見皮膚疾病,包括良性疣、光化性角化病及鱗狀細(xì)胞癌等[1-2],其中免疫抑制患者感染發(fā)病并進(jìn)展為癌癥比免疫健全的人高100 倍[3]。由于乳頭瘤病毒具有嚴(yán)格種屬特異性,HPV 無法感染實(shí)驗(yàn)動物建立動物模型?？茖W(xué)家們通過犬口腔乳頭瘤病毒(canine oral papillomavirus,COPV/CPV1)、棉尾兔乳頭瘤病毒(cottontail rabbit papillomavirus,CRPV)、 及兔口腔乳頭瘤病毒 ( rabbit oral papillomavirus,ROPV)以及牛乳頭瘤病毒(bovine papillomavirus,BPV)等感染動物模型來理解乳頭瘤病毒感染過程及發(fā)病機(jī)制[4-5],然而這些感染模型個體差異大及有限的技術(shù)等問題,使得更為理想的感染實(shí)驗(yàn)室小鼠模型尚待建立。2011 年,印度科學(xué)家從NMRI-Foxn1(Nu)/Foxn1(Nu)裸鼠上分離得到小鼠乳頭瘤病毒(mouse papillomavirus,MmuPV1),其可感染實(shí)驗(yàn)室小鼠品系,首次提供利用小鼠研究乳頭瘤狀病毒的機(jī)會[6-9]。本研究利用MmuPV1 感染T 細(xì)胞缺陷的Crl:NU-Foxn1nu小鼠尾部并進(jìn)展為病毒性皮膚疣模型,為進(jìn)一步研究HPV 持續(xù)感染、致病機(jī)制研究等提供研究平臺,有望助力于HPV 致病機(jī)制和治療方法研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

15 只 6 ～ 8 周齡 SPF 級雌性 NU/NU(Crl:NUFoxn1nu,編號403)小鼠,體重18 ～25 g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2016-006】。動物飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所 ABSL-2 級實(shí)驗(yàn)室【SYXK(京)2019-0014】,飼養(yǎng)條件:溫度 20 ～ 26℃,濕度 40% ～70%,光照周期12 h/12 h,動物自由采食和飲水。本動物實(shí)驗(yàn)已通過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所實(shí)驗(yàn)動物使用與管理委員會審批(批準(zhǔn)號:WW19001)。

1.1.2 病毒毒株

小鼠乳頭瘤病毒(MmuPV1)及質(zhì)粒pMusPV 由賓夕法尼亞州立大學(xué)Jiafen Hu 教授惠贈。

1.1.3 主要試劑與儀器

三溴乙醇(Sigma-Aldrich, T48402), DNeasy Blood &Tissue Kit(Qiagen,69506),QuantiTect Probe PCR Kits(Qiagen,204343),RNAscope? Probe-VMusPV-E4 ( Advanced Cell Diagnostic, 473281),RNAscope? 2.5 HD reagent kit-Brown(Advanced Cell Diagnostic,322300);PlatinumTMTaqDNA Polymerase High Fidelity(Invitrogen,11304029),Trans2K? Plus DNA Marker(全式金,中國)。

Bead Ruptor Elite 多功能生物樣品均質(zhì)器(OMNI International,美國),PCR 儀(Bio-Rad T100 Thermal Cycler,美國),實(shí)時定量 PCR 儀(Applied Biosystems Quantudio 3,美國),NanoZoomer S60 數(shù)字切片掃描儀(HAMAMATSU,日本)。

1.2 方法

1.2.1 病毒制備

MmuPV1 是從小鼠尾部病變部位分離[9]。具體步驟為利用手術(shù)刀片將增生組織置于勻漿管中,加入PBS,電動勻漿器5.65 m/s 45 s,間隔30 s 后再次勻漿,將勻漿后的產(chǎn)物以 10 000 rpm 離心2 min,上清液置于 EP 管中-80℃儲存。MmuPV1病毒液與 PBS 按1 ∶5進(jìn)行稀釋(即 40 μL 病毒液加入 200 μL PBS),混合后置于 0.22 μm 醋酸纖維素?zé)o菌離心過濾管,過濾管中再加入200 μL PBS,因過濾過程的損失,最終可得到250 μL病毒液。

1.2.2 小鼠感染

NU/NU 小鼠經(jīng)三溴乙醇麻醉,按每公斤體重腹腔注射240 mg。待小鼠麻醉后,利用刀片在小鼠尾部反復(fù)輕輕刮擦20 次左右,取10 μL 病毒液(1.5 ×108copies vrial DNA)滴加到刮擦過的尾部,待病毒液體自然干燥后,將感染后的小鼠放回鼠籠。感染后16 周安樂小鼠并收集增生組織。

1.2.3 MmuPV1 DNA 及載量檢測

利用Dneasy Blood&Tissue Kit(Qiagen)提取病毒或動物組織 DNA。使用 MmuPV1 E2 上下游引物,MmuPV1 _ E2 _1 (5’-GCCCGAAGACAACACC GCCACG-3’)和 MmuPV1_E2_2(5’-CCTCCGCCTCGTCCCCAAAAAATGG-3’)擴(kuò)增[10],PCR 反應(yīng)體系為25 μL, 具 體 為: 10 × High Fidelity PCR Buffer 2.5 μL、10 mmol/L dNTP Mix 0.5 μL、50 mmol/L MgSO41 μL、MmuPV1_E2_1 primer 1 μL、MmuPV1_E2_2 primer 1 μL、MmuPV1 DNA 3 μL、Platinum?TaqDNA polymerase High Fidelity 0.1 μL、去離子水15.9 μL。反應(yīng)條件:94℃ 10 min;94℃ 15 s、60℃30 s,68℃ 45 s,35 個循環(huán);68℃ 10 min,瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

qRT-PCR 法檢測病毒載量,利用已知濃度pMusPV 質(zhì)粒繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,同樣靶向MmuPV1_E2基因進(jìn)行檢測,上下游引物同PCR 擴(kuò)增引物,探針序列為 FAM-TGCCCTTTCAGTGGGTTGAGGACAGMGB[10]。反應(yīng)體系為20 μL,具體為:2 × QuantiTect Probe PCR Master Mix 10 μL、MmuPV1_E2_1 primer 1 μL、MmuPV1_E2_2 primer 1 μL、MmuPV1_E2_probe 0.5 μL、Template DNA 1 μL、Rnase-free water 6.5 μL。反應(yīng)條件:50℃ 2 min;95℃ 10 min;95℃15 s;60℃ 1 min,40 個循環(huán)。

1.2.4 免疫組化

感染16 周后,將MmuPV1 感染NU/NU 小鼠進(jìn)行安樂,采集尾部增生部位皮膚,制備成石蠟塊進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE 染色)。方法簡述:增生組織經(jīng)10%的多聚甲醛固定、脫水透明后,石蠟包埋后切片;切片脫蠟后進(jìn)行HE 染色,顯微鏡下觀察。

1.2.5 RNA 原位雜交

制備的石蠟切片,利用 RNAscope 檢測[11]。具體為:(1)切片脫蠟:60℃烤片1 h,二甲苯脫蠟,100%酒精,室溫靜置干燥5 min;(2)雙氧水靶標(biāo)修復(fù):滴加5 ～ 8 滴RNAscope? 雙氧水后孵育10 min,蒸餾水清洗,浸沒于煮沸的1 × RNAscope? 靶標(biāo)修復(fù)液中放置15 min,蒸餾水清洗,100%乙醇中清洗,室溫靜置干燥 10 min; (3) 畫疏水圈: 利用ImmedgeTM疏水筆在檢測樣本周圍畫疏水圈2 ～4次;(4)切片滴加5 滴 RNAscope? 蛋白酶 plus 的切片放入HybEZTM濕盒,再放入40℃雜交爐30 min,蒸餾水清洗;(5)探針雜交:切片滴加4 滴MmuPV1 E4探針,再放入濕盒,雜交爐40℃孵育2 h,1 × 清洗緩沖液清洗;(6)Amp 雜交反應(yīng):依次加入 Amp1 ～Amp6 雜交反應(yīng)液4 滴,分別放回濕盒,雜交爐40℃孵育,結(jié)束后用1 ×清洗緩沖液清洗,再依次進(jìn)行下次雜交;(7)信號檢測:切片上滴加120 μL DAB 工作液,靜置10 min,,蒸餾水洗3 ～5 次;(8)切片復(fù)染:放入蘇木精染色液中,室溫靜置2 min,蒸餾水洗3 ～ 5 次,0.02%氨水洗1 次,蒸餾水再洗3 ～ 5 次;(9)切片分別置于70%乙醇,100%乙醇孵育2 min,以及二甲苯溶液,靜置5 min;(10)切片風(fēng)干后,滴加1 滴 Cytoseal 封片劑,蓋上蓋玻片,風(fēng)干載玻片1 min;(11)結(jié)果判讀:觀察MmuPV1E4 轉(zhuǎn)錄本在感染增生組織中的表達(dá),棕色斑點(diǎn)判定為陽性信號。

2 結(jié)果

2.1 MmuPV1 感染尾部皮膚后外觀性狀

MmuPV1 病毒感染NU/NU 小鼠4 周左右,其中5 只小鼠即可見尾部皮膚出現(xiàn)小米粒大小增生;16周后可觀察到,小鼠尾部出現(xiàn)高于皮面,圓形或不規(guī)則形狀的乳頭瘤樣增生,并且伴有角化過度,表面粗糙(圖1)。收集增生組織,HE 染色進(jìn)行病理分析,組織學(xué)觀察可見感染小鼠尾部皮膚表面鱗狀上皮增生(圖2A),棘層肥厚,在棘層和顆粒層出現(xiàn)空泡化細(xì)胞(圖2B)。

圖1 MmuPV1 感染16 周后的NU/NU 小鼠尾部Figure 1 Tail skin of MmuPV1 infected NU/NU mouse after 16 weeks

2.2 PCR 檢測增生組織MmuPV1 DNA

MmuPV1 感染增生部位提取 DNA, 利用MmuPV1 E2 基因特異性引物擴(kuò)增鑒定MmuPV1 表達(dá)97 bp 片段。利用感染MmuPV1 的小鼠尾部提取DNA 進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明均可檢測到MmuPV1 DNA(圖3)。

2.3 qRT-PCR 法檢測增生組織病毒載量

制備 MmuPV1 病毒液按 1 ∶5與 PBS 稀釋后進(jìn)行過濾,又追加 200 μL PBS。取 5 μL 過濾后的病毒液提取DNA,利用實(shí)時定量PCR 方法檢測感染病變組織中MmuPV1 的病毒載量,同樣利用MmuPV1 E2基因進(jìn)行定量。結(jié)果表明,感染小鼠尾部增生部位均可檢測到病毒載量,該病毒提取物中每微升含有大于 1.3 × 108viral DNA copies,RNase-Free 水作為陰性對照(NC)(圖4)。

圖2 MmuPV1 感染小鼠尾部病變組織學(xué)分析Figure 2 Immunohistochemical analysis of mouse tail hyperplasia by MmuPV1 infection

注:1 ～15:MmuPV1 感染小鼠尾部DNA 樣本;16:pMusPV 質(zhì)粒(陽性對照);17:未感染小鼠尾部DNA(陰性對照);18:水(空白對照);M:Trans 2 k Plus DNA Marker。圖3 感染小鼠尾部MmuPV1 E2 基因PCR 鑒定Note. 1 ～15. Samples DNA from MmuPV1 tail infection. 16. pMusPV plasmid(Positive control). 17. DNA from the mock mice (Negative control). 18. Water (Blank control). M. Trans 2 k Plus DNA Marker.Figure 3 MmuPV1 DNA was analyzed by PCR on E2 gene from virus-induced mouse tails

圖4 qPCR 法檢測感染小鼠尾部病毒載量Figure 4 Vrial load in the MmuPV1-induced mouse tails by qPCR

2.4 RNA 原位雜交檢測MmuPV1 E4 轉(zhuǎn)錄本

RNAscope 原位RNA 雜交技術(shù)可呈現(xiàn)單個細(xì)胞中RNA 分子原位的可視化及量化。因此本研究利用RNAscope 原位雜交檢測MmuPV1 E4 轉(zhuǎn)錄本表達(dá),因MmuPV1 E4 轉(zhuǎn)錄本存在于大多數(shù)乳頭瘤病毒早期和晚期轉(zhuǎn)錄過程。用MmuPV1 E4 目的探針、陰性探針進(jìn)行檢測,出現(xiàn)棕色信號為探針結(jié)合RNA 分子,藍(lán)色信號為細(xì)胞核。結(jié)果表明,目的探針MmuPV1 E4 雜交后可見明顯的棕色斑點(diǎn)信號(圖5A,B),而陰性對照則只有藍(lán)色信號(圖5C,D)。

3 討論

乳頭瘤病毒感染導(dǎo)致的相關(guān)疾病已成為世界范圍內(nèi)的主要問題。大多數(shù)HPV 型感染是良性的,但如HPV16、HPV18 等高危型HPV 可導(dǎo)致宮頸癌、皮膚癌、頭頸鱗癌以及肛門生殖器癌癥等惡性腫瘤。皮膚疣是因感染HPV 而導(dǎo)致的一種良性增生,兒童及青少年發(fā)病率較高,多發(fā)于手、面和足部,表現(xiàn)為圓形乳頭狀角化增生。目前的治療方法主要以物理方法破壞疣體和手術(shù)切除,或者局部用藥、免疫增強(qiáng)劑等治療[12],但這些方法易復(fù)發(fā)、易感染,治療時間久且治療過程疼痛不適,使患者增加精神及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),配合程度較差。HPV 屬于自限性病毒,在HPV 感染、病變到致癌過程需經(jīng)歷數(shù)十年,而目前對于治療中的給藥途徑及劑量無法系統(tǒng)評價(jià),使得因HPV 感染而引起良性或惡性病變的患者尚無有效治療方案[13]。因?yàn)镠PV 感染具有嚴(yán)格物種特異性,前期科學(xué)家建立了棉尾兔乳頭瘤病毒(CRPV)、多乳鼠乳頭瘤病毒(MnPV1)等感染動物皮膚致病模型[14-15],但這些HPV 參比模型存在個體差異大,成本高和技術(shù)有限等問題,理想的感染動物模型的缺乏很大程度阻礙了HPV 感染致病機(jī)制及治療手段的研究,因此,建立適合的動物模型進(jìn)行該疾病的研究一直具有挑戰(zhàn)性。

MmuPV1 最初是從 NMRI-Foxn1nu/Foxn1nu裸鼠中分離鑒定中分離得到,與皮膚型β-HPV 基因組更為相似,如HPV5 和HPV8 等皮膚型人乳頭瘤病毒,與疣狀表皮發(fā)育不良及免疫抑制患者的鱗狀細(xì)胞癌有關(guān)。前期多個科研團(tuán)隊(duì)已利用MmuPV1 建立了尾巴,口腔周圍、背部以及耳朵的多個小鼠品系感染模型[6,8,16-17]。因?yàn)槊庖咭种苹颊吒赘腥径l(fā)展成疣或更高級病變,前期也有研究表明,T 細(xì)胞缺陷對病毒感染及進(jìn)展至關(guān)重要。因此,建立了MmuPV1 感染裸鼠皮膚模型,顯示其在尾部皮膚以及口腔周圍皮膚(未發(fā)表)引起肉眼可見高出皮面的圓形丘疹,乳頭瘤狀外生性增生,角化過度,組織病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)空泡細(xì)胞,并可進(jìn)展為高度鱗狀上皮不典型增生,與人類感染HPV 引起的疣狀病變相似。通過 PCR 可檢測到 MmuPV1 DNA 以及利用qRT-PCR 檢測到病毒載量,RNAscope 技術(shù)是在RNA 水平利用靶向特異性雙Z 設(shè)計(jì)探針檢測單鏈RNA 的原位雜交,解決了尚無MmuPV1 相應(yīng)抗體檢測及定量的問題,本模型利用RNA 原位雜交技術(shù),在MmuPV1 感染小鼠尾部皮膚檢測到明顯的E4 轉(zhuǎn)錄本信號,即在增生部位可原位檢測到乳頭瘤病毒的存在。

多個科學(xué)家團(tuán)隊(duì)已證明,MmuPV1 具有廣泛的組織嗜性[18],不僅可感染皮膚上皮細(xì)胞,也可感染HPV 性傳播有關(guān)的部位,如女性與男性生殖器粘膜、肛門和口咽部位,頭頸鱗癌等[11,17,19-22],這些結(jié)果與高危型HPV 非常相似。綜上所述,MmuPV1 的發(fā)現(xiàn)為乳頭瘤病毒多個領(lǐng)域的研究提供關(guān)鍵平臺,其感染是模擬HPV 病毒潛伏期、病變形成以及控制感染等方面更為充分的臨床前動物模型,有望改變我們對HPV 相關(guān)疾病的理解,并且?guī)椭鷮PV 相關(guān)疾病治療方法的建立。