翟思佳 尹時華 侯濤 任毅 廖行偉 黃巧 李念燊

耳蝸螺旋神經節(jié)神經元(spiral ganglion neuron,SGN)作為初級聽覺神經元，是外周聽覺信號傳遞到中樞神經系統(tǒng)的重要樞紐。SGN是水楊酸鈉(sodium salicylate，SS)首要作用的主要靶點[1]。SGN損傷與聽力損失息息相關，在水楊酸鈉誘導耳鳴的發(fā)病機制中占據(jù)重要地位。

最新研究發(fā)現(xiàn)神經炎癥是水楊酸鈉誘導聽覺損傷的新機制[2]，盡管已有研究證實水楊酸鈉會導致耳蝸SGN細胞中多種炎癥因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-1(IL-1)上調[3-5]，但其確切分子機制仍缺乏進一步研究。而過度免疫所激活的NLRP3炎癥小體可能是SGN細胞中炎癥因子上調的關鍵原因，NOD-like receptor(NLR)樣受體NLRP3作為模式識別受體，可識別各種危險信號，幫助炎癥小體組裝，促使半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase-1，CAPS-1)前體成熟并釋放IL-1β、IL-18，間接促進TNF-α等炎癥因子上調，加劇炎癥反應，導致耳蝸內重要結構損傷[6]。目前已證實NLRP3炎癥小體與老年性聾[7]、巨細胞病毒(CMV)感染誘發(fā)的感音神經性聾[8]和Mucklewell綜合征[9](由NLRP3突變而引起其在SGN高表達)等多種聽覺損害，以及阿爾茲海默病、帕金森病等神經退行性疾病[10]密切相關。

本研究旨在探討NLRP3炎性小體激活在水楊酸鈉誘導SGN損傷過程中的作用以及水楊酸鈉誘導耳蝸炎癥復合體激活的關鍵分子機制；并通過給予抑制NLRP3的預處理，觀察其否可以減輕炎癥因子的釋放，減輕聽覺系統(tǒng)損傷。

1 材料與方法

1.1主要試劑 人工外淋巴液(arfifical perilymph dluid,APL)，配制方法(單位：mM)：NaCl 137, KCl 5, CaCl22, NaH2PO41, Glucose 10, NaHCO312, MgCl21的溶液，pH 7.4±0.2；水楊酸鈉購于sigma公司；MCC950購自selleck公司(S7809，500 μM)；NLRP3抗體購自NOVUS公司(NBP2-12446SS，1∶500倍稀釋)；Caspase-1抗體購自Gene Tex公司(GTX123675,1∶100倍稀釋)；IL-1β抗體購自SAB公司(41059-1，1∶500倍稀釋)；二抗試劑盒購自北京中衫金橋公司；TRIZOL購自TaKaRa 公司；逆轉錄盒與熒光定量PCR試劑盒購于GeneCopoeia公司。

1.2實驗動物分組及造模 選取64只耳廓反應靈敏、未暴露于噪聲及耳毒性藥物環(huán)境的健康雄性SD大鼠(250～300 g)(購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心),均耳聲發(fā)射檢查通過，且聽性腦干反應(ABR)閾值<40 dB SPL，隨機分為4組，每組16只，對照(control)組：腹腔注射等量生理鹽水；人工外淋巴液(APL)組：左耳圓窗注入APL100 μl，腹腔注射生理鹽水；水楊酸鈉(SS)組：左耳經圓窗注入APL，腹腔注射10%水楊酸鈉(350 mg·kg-1·d-1)；水楊酸鈉+NLRP3抑制劑(SS+MCC950)組：左耳圓窗注入溶于APL的caspase抑制劑MCC950約100 μl后，腹腔注射水楊酸鈉。各組均連續(xù)用藥7 d。

圓窗給藥方法：10%水合氯醛全身麻醉滿意后，將大鼠置于固定板上，左耳后常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，利多卡因局部浸潤麻醉，于耳后溝后2 mm做弧形切口約1 cm長，鈍性分離軟組織，暴露聽泡，在解剖顯微鏡下于聽泡后上方鉆孔并暴露圓窗龕，以分別浸泡有人工外淋巴液、MCC950的明膠海綿置于圓窗膜表面，關閉術腔，逐層縫合軟組織及皮膚，切口涂紅霉素軟膏，取左耳朝上側臥位，待自然清醒。

1.3ABR檢測 實驗前及給藥結束后，在處死動物之前，對各組大鼠進行ABR測試。麻醉滿意后將大鼠置于隔聲室,記錄電極扎入額頂正中，參考電極接同側耳廓，鼻尖接地。click短聲刺激，刺激率21次/秒，帶通濾波300～3 000 Hz，觀察時程15 ms，疊加1 024次,刺激聲強度從90 dB SPL開始以10 dB或者5 dB逐漸遞減, 以能引出可分辨波Ⅱ的最小刺激強度為ABR反應閾，并重復檢測2次。

1.4畸變產物耳聲發(fā)射(DPOAE)檢測 給藥結束后，在處死動物之前，對各組大鼠進行DPOAE測試。麻醉后的大鼠置于隔聲室,刺激聲強度L1=65 dB SPL,L2=70 dB SPL,取2、3、4、6、8、10 kHz共6個頻率點進行測試,記錄各頻率的DPOAE反應幅值。

1.5耳蝸取材及切片制備 各組完成ABR及DPOAE檢測后，打開胸腔進行心臟灌注，待眼珠、四肢末端發(fā)白后快速斷頭，取出聽泡后剝離出耳蝸，在解剖顯微鏡下于蝸尖處挑開小孔，用1 ml注射器由蝸頂灌注4%多聚甲醛固定液，再將標本置于4%多聚甲醛中，在4 ℃冰箱內固定48 h；隨后將耳蝸置于10%EDTA溶液室溫脫鈣1個月，隔天更換一次脫鈣液。乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟定向包埋后平行耳蝸縱軸連續(xù)切片，片厚4 μm。

1.6HE染色 耳蝸石蠟切片置于60 ℃烤箱30 min，將切片取出進行二甲苯脫蠟和梯度酒精水化；蒸餾水沖洗，蘇木素染色1 min，水洗；蒸餾水浸泡1 min；1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水返藍30 min，伊紅染色2 min；梯度酒精脫水，二甲苯透明，晾干封片，鏡檢。對形態(tài)異常的損傷細胞進行定量分析，在不同的視野下，對SGN區(qū)內每100個SGN細胞中形態(tài)異常細胞數(shù)進行5次計數(shù)，取平均數(shù)作為結果。

1.7RNA提取 待大鼠麻醉充分，快速斷頭，迅速取出雙側耳蝸，置入RNA保存液中，在解剖顯微鏡下剝離蝸殼，取出膜迷路組織，迅速放入已加入300 μl TRIZOL的1.5 ml EP管中，用玻璃研磨棒在EP管中快速研磨碎，另加入700 μl TRIZOL，冰上放置10 min。4 ℃，12 000 g，離心5 min，吸取上清液到另一無酶EP管中，加入200 μl氯仿，震蕩15 s，冰上靜置5 min。4 ℃、12 000 g，離心15 min，小心吸取上層清液入新的無酶EP管中，切勿吸取到中間層。因耳蝸組織中膠原含量高，本實驗采用mRNA改良提取法：用200 μl異丙醇與200 μl高鹽溶液(0.8 mol/L檸檬酸鈉與1.2 mol/L NaCl的混合液)沉淀RNA，提高RNA純度，顛倒混勻后冰上靜置10 min；4 ℃ 12 000 g離心10 min，棄上清保留沉淀，加入75%乙醇1 ml洗滌沉淀。4 ℃ 12 000 g離心5 min，倒去乙醇，用小槍頭吸取殘留液體，室溫晾干，然后將RNA溶于無酶水中，微量核酸蛋白檢測儀測定RNA 濃度，OD260/OD280比值需在1.7～2.0之間，長期保存于-80 ℃冰箱。

1.8熒光定量PCR 取RNA 1 μg，按照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，然后通過美國ABI公司的Stepone進行qRT-PCR。以1 μl cDNA為反應模板，按照熒光定量PCR試劑盒說明書配置反應體系進行反應。反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 32 s，總共40個循環(huán)。選取GPHAD作為內參對照，設3 個復孔，采用2-△△CT法進行數(shù)據(jù)分析。引物序列如下: GPHAD序列為F: 5'-AGTGCCAGCCTCGTCTCATA-3'；R:5'-TGAACTTGCCGTGGGTAGAG3-3'。NLRP3序列為F: 5'-ATTACCCGCCCGAGAAAGG-3'；R:5'-CATGAGTGTGGCTAGATCCAAG-3'。Caspase-1序列為F:5'-CCGAGTGGTTCCCTCAAGTT-3'；R:5'-CAAGACGTGTACGAGTGGGT-3'。IL-1β序列為F: 5'-GAGTGTGGATCCCAAGCAAT-3'；R:5'-CTCAGTGCAGGCTATGACCA-3'。以GPHAD為內參，計算2-△△CT作為目的基因 mRNA的相對表達量。

1.9免疫組化染色 耳蝸石蠟切片置于60 ℃烤箱30 min，然后常規(guī)脫蠟和梯度酒精水化，自來水沖洗；切片置于EDTA緩沖液放入高壓鍋高壓堿修復4 min，室溫冷卻后PBS浸洗3次×5 min；將切片移入濕盒中加入阻斷內源性過氧化物酶，室溫孵育10 min，PBS洗3次；正常山羊血清封閉15 min，甩去封閉液，不洗。標本上滴加足量目的蛋白一抗4 ℃濕敷過夜；室溫復溫1 h，PBS沖洗3次×3 min；滴加增強酶標羊抗小鼠/兔IgG聚合物，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次×3 min；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次×3 min；DAB溶液顯微鏡下顯色約5 min，蒸餾水充分沖洗，蘇木素復染1 min，自來水沖洗，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水返藍30 min，晾干，中性樹脂封片、鏡檢。細胞膜和/或細胞質棕黃色顆粒者為陽性表達，無棕黃色顆粒者為陰性表達。每張切片在10×40視野下選取5個互不重疊的視野，采用Image-pro plus6.0圖像分析軟件測定單位面積陽性細胞表達的平均光密度值(average optical densities，AOD)，取平均值作為結果。

2 結果

2.1各組ABR閾值比較 實驗前大鼠的ABR平均反應閾為31.79±4.13 dB SPL，給藥7天后，對照組、APL組、SS組、SS+MCC950組大鼠的ABR反應閾分別為32.5(26.25,35)、32.5(30,35)、50(45,55)、40(35,40)dB SPL。對照組和APL組反應閾與實驗前比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而給藥7天后，SS組大鼠ABR反應閾較對照組和APL組均顯著升高(P<0.001)，說明造模成功，大劑量水楊酸鈉對大鼠聽覺系統(tǒng)造成了一定損傷。給藥后，SS+MCC950組ABR反應閾較SS組降低(P<0.05)，但較對照組與APL組仍有升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義P<0.05。

2.2各組DPOAE比較 造模7天后，在4、6、8 kHz頻率，對照組與APL組DPOAE幅值無顯著差異(P>0.05)，而SS組大鼠DPOAP幅值較對照組及APL組顯著下降(分別為P<0.001，P<0.05，P<0.001)；SS+MCC950組3、4、8、10 kHz頻率DPOAP幅值與SS組差異顯著(均為P<0.001)，與對照組與APL組無明顯差異(P>0.05)(表1、2)。

表1 各組大鼠給藥后各頻率DPOAE幅值

表2 組間各頻率DPOAE幅值比較的P值

2.3HE染色觀察給藥后各組動物SGN損傷情況 對照組和APL組耳蝸結構正常；而SS組和SS+MCC950組則出現(xiàn)不同程度的耳蝸SGN細胞變形、移位、界限不清，部分溶解消失，胞體明顯縮小，胞核染色質邊集、核固縮、核溶解，具有細胞死亡特征(圖1)。對照組、APL組、SS組及SS+MCC950組SGN形態(tài)異常的細胞計數(shù)分別為16.83±6.555、13.83±3.312、39.33±8.618、23±6.573個，可見，與對照組和APL組相比，SS組的SGN損傷更顯著(P<0.001)，SS+MCC950組SGN損傷較SS組明顯改善(P<0.01)，SS+MCC950組、對照組、APL組三組間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1 給藥后HE染色觀察各組耳蝸損傷(×400) a.對照組； b.APL組； c.SS組； d.SS+MCC950組； 箭頭所指為耳蝸SGN細胞

2.4熒光定量PCR檢測結果 熒光定量反應曲線見圖2，可見，NLRP3、Caspase-1和IL-1β的擴增曲線整齊均勻(圖2a、b、c)，溶解曲線均呈特異性單峰(圖2d、e、f)，表明擴增產物特異性良好，無二聚體及非特異性擴增。

圖2 熒光定量PCR反應曲線 (a、b、c分別為NLRP3、Caspase-1、IL-1β的擴增曲線；d、e、f分別為NLRP3、Caspase-1、IL-1β的溶解曲線)

以GPHAD為內參，經過計算得到各組NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA的表達量如表3所示，并進一步計算2-ΔΔCT作為目的基因mRNA的相對表達量，ΔCT值越大表達量越低。單因素方差分析示各組間NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA的表達量有明顯差異，均有統(tǒng)計學意義(表4)。三個炎癥因子均在對照組中表達水平最低，在SS組表達強烈增加、SS+MCC950組的表達均較SS組降低。說明NLRP3是Caspase-1和IL-1β的上游調控基因，在水楊酸鈉誘導聽覺損傷的過程中存在NLRP3炎癥小體信號轉導通路。

表3 各組 NLRP3、Caspase-1和IL-1β mRNA的表達量(n=8只)

表4 組間NLRP3、Caspase-1、IL-1β表達量比較的P值

2.5免疫組化染色結果 運用免疫組化技術檢測各組螺旋神經節(jié)處NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)其主要表達于SGN細胞胞質中，三種蛋白均在對照組和APL組SGN區(qū)域弱陽性表達，SS組呈強陽性表達，SS+MCC950組中呈陽性表達(圖3)；各組平均光密度值見表5，單因素方差分析示SS組SGN內NLRP3、Caspase-1和IL-1β的表達顯著增加，SS+MCC950組NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白的表達較SS組降低，但SS+MCC950組Caspase-1和IL-1β的表達仍較對照組高，差異具有統(tǒng)計學意義(表6)；該蛋白質表達水平與mRNA表達水平變化趨勢一致。

圖3 各組免疫組化染色結果(×400) 紅色箭頭所示為SGN陽性細胞

表5 各組NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白表達AOD值(n=8只)

表6 組間NLRP3、Caspase-1、IL-1β AOD值組間比較的P值

3 討論

內源性免疫炎癥反應是機體的一把雙刃劍[11]，由于內耳自身具有很強的免疫能力，研究發(fā)現(xiàn)炎癥小體的過度免疫反應在多種聽覺損傷中起關鍵作用[7,8,12]。炎性小體的形成過程依賴于模式識別受體NLRP3，NLRP3炎癥小體在收到 “危險”信號時被激活，借助ASC募集并剪切pro-caspase-1為有活性的caspase-1，促使下游的IL-1β和IL-18成熟并釋放，并且誘導它們經由非經典分泌途徑釋放[13]，從而引發(fā)細胞焦亡(pyroptosis)[14]。NLRP3炎癥復合體及其下游因子IL-18、IL-1β還可進一步促進炎癥因子如TNF-α和IL-6分泌，引起神經毒性，TNF-α和IL-6再通過結合TLRs 激活NF-κB 信號通路引發(fā)細胞凋亡、壞死，后者又能繼續(xù)激活NLRP3炎癥復合體[15]，加劇最初的炎癥反應，形成循環(huán)。

本研究結果顯示大劑量水楊酸納注射造成了大鼠聽覺損傷，對照組和APL組中NLRP3 在SGN細胞內的表達量很低，SS組NLRP3、Caspase-1、IL-1β的mRNA轉錄水平在大鼠明顯損傷的SGN區(qū)域顯著升高，而通過抑制NLRP3炎性小體的活化后，SS+MCCP50組Caspase-1和IL-1β的轉錄表達減少，SGN的損傷減輕；各組SGN區(qū)域NLRP3、caspase-1、IL-1β表達差異變化與水楊酸鈉誘導的耳蝸組織細胞損傷死亡情況基本一致，說明在動物模型聽覺損傷過程中，水楊酸鈉可能通過激活SGN聽覺神經元細胞中的NLRP3炎癥小體進而調節(jié)下游Caspase-1、IL-1β的轉錄表達，從而損傷聽覺系統(tǒng)，引起聽力下降。結合本研究結果，推測上述病理途徑可能也與水楊酸鈉誘導的聽覺損傷有關，SS誘導的SGN損傷可能涉及NLRP3相關炎性小體信號傳導途徑，即NLRP3炎性小體的激活導致了下游的Caspase-1活化和下游IL-1β和IL-18等靶標的加工和釋放，這些炎癥因子的過量分泌最終導致聽覺損傷。

NLRP3炎癥小體信號通路可以引發(fā)細胞焦亡，細胞焦亡是一種伴隨炎癥反應的細胞程序性死亡方式，依賴于Gasdermin家族蛋白形成質膜膜孔的可調控的細胞死亡[16]。本研究結果顯示SS組SGN細胞死亡率升高顯著，而本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)SS通過激活Caspase-3誘導豚鼠耳蝸SGN細胞凋亡，但經特異性Caspase-3抑制劑處理后細胞死亡率減少并不明顯，提示可能有其他死亡途徑存在[17]。另有研究發(fā)現(xiàn)停止長期水楊酸鹽應用后14 天耳蝸核中TNF-α 和NR2B的表達水平恢復正常；而在急性注射水楊酸鹽2 小時后IL-1β mRNA 升高，停止水楊酸鹽14 天后仍未恢復正常[18]；而IL-1β與細胞凋亡程序密切相關，因此推測NLRP3炎癥小體激活引發(fā)的細胞焦亡程序可能也參與水楊酸鈉誘導的SGN損傷機制。然而細胞死亡的類型并不由上游切割的蛋白酶決定，而是由下游的效應分子決定，因此是否確實有細胞焦亡參與SGN的損傷過程仍需后續(xù)研究證實。

抑制炎癥小體的活化從而減輕由于持續(xù)的炎癥狀態(tài)而導致的聽覺系統(tǒng)損傷或可提供一種新的治療策略。NLRP3特異性的小分子抑制劑MCC950已被證明是體內和體外治療炎癥相關疾病的潛在方法[19]。本實驗結果顯示MCC950可抑制NLRP3和下游炎癥因子的激活，對SS誘導的SGN損傷有明顯的改善作用，故推測MCC950可能會抑制SS誘導耳蝸SGN炎癥級聯(lián)反應，從而在抗炎和促炎反應之間取得平衡。

綜上所述，水楊酸鈉誘導的SGN損傷與NLRP3炎性小體的持續(xù)活化密切相關，并可能發(fā)生細胞凋亡，NLRP3可能成為預防治療SGN損傷的潛在藥物靶標。