疏肝解郁法聯(lián)合針刺對(duì)糖尿病合并抑郁大鼠血糖、胰島素受體及ERK1/2、CaMK 信號(hào)通路表達(dá)的影響

房 丹

（聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八三醫(yī)院和平院區(qū)內(nèi)四科，天津 300020）

糖尿病是由胰島素分泌缺陷或胰島素抵抗引起的慢性代謝性疾病，其主要特征是慢性高血糖[1]。抑郁癥是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，隨著生活節(jié)奏的加快和社會(huì)壓力的增加，糖尿病并發(fā)抑郁癥的發(fā)生率逐年增高[2]。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，超過3 成糖尿病患者伴有不同程度的抑郁癥狀[3]。糖尿病合并抑郁癥作為一種內(nèi)分泌和神經(jīng)系統(tǒng)復(fù)合疾病，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，且致殘和自殺風(fēng)險(xiǎn)高，常規(guī)西醫(yī)治療一般采取控制?和抗抑郁等對(duì)癥治療，對(duì)改善相關(guān)癥狀有明顯的作用，但存在病情易復(fù)發(fā)、不良反應(yīng)大等不足[4]。目前對(duì)于糖尿病并發(fā)抑郁癥的作用機(jī)制尚未完全明確，研究能夠有效治療糖尿病合并抑郁癥的方法意義重大。

1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF級(jí)雄性大鼠48只，5周齡，體質(zhì)量 160～200 g，由省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。干凈、清潔環(huán)境下，每只大鼠置于隔離單元內(nèi)籠中飼養(yǎng)，含直徑14 cm 轉(zhuǎn)輪；溫度22～26 ℃，相對(duì)濕度55%～65%，隔音通風(fēng)且避光，無外界干擾情況下自由攝食、飲水及轉(zhuǎn)輪活動(dòng)，光暗同步下飼養(yǎng)1 周。鏈脲佐菌素STZ、β-actin 抗體（Sigma-Aldrich 中國公司）；血糖、胰島素和糖化血紅蛋白試劑盒（北京卓爾恒信科技有限公司）；高脂高糖乳劑：10%膽固醇、20%豬油、30%蔗糖、2%膽酸鈉、38%普通標(biāo)準(zhǔn)飼料；ERK1/2 抗體、CaM 抗體、CaMK Ⅱ抗體（美國Abacm 公司）；PⅤDF 膜（美國Milipore 公司）；蛋白分析試劑盒（美國Bio-Rad 公司）；RT-PCR 引物（深圳市瑞賽生物技術(shù)有限公司）；TRIZOL 試劑、一步法RT-PCR 試劑盒（上海一基實(shí)業(yè)有限公司）；檸檬酸緩沖液、M-MuLⅤ逆轉(zhuǎn)錄酶（北京百奧萊博科技有限公司）；瓊脂糖（美國Amresco公司）。血糖儀（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）；Catalyst One? 全自動(dòng)生化分析儀（美國IDEXX 公司）；MyCycler PCR 擴(kuò)增儀、Mini-PROTEAN 小型垂直電泳槽、PowerPac Basic 基礎(chǔ)電泳儀、iQ5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）；SpectroArt 200 紫外分光光度儀（美國WEALTEC 公司）；DK-8B 電熱恒溫水浴箱（上海中庸檢驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SpectraMax i3x 多功能酶標(biāo)儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]；H1650R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；華佗牌一次性針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。疏肝解郁方：柴胡6 g，陳皮6 g，川芎6 g，黨參8 g，白術(shù)8 g，茯苓8 g，香附5 g，白芍5 g，甘草3 g。藥材由醫(yī)院中藥房提供，冷水浸泡2 h 后兩煎，分別取濾液后合并，水浴蒸發(fā)制備成濃縮藥物，含生藥0.35 g/mL。

2 方法

2.1 模型制備與分組 所有大鼠普通飼養(yǎng)1 周，監(jiān)測(cè)血糖，確保其在正常范圍內(nèi)。隨機(jī)選取8 只作為空白組（A 組），給予標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)；其余40 只則為造模組，給予高糖高脂飼料飼養(yǎng)。4 周后對(duì)大鼠進(jìn)行稱重，采集血液檢測(cè)空腹血糖（FBG）、胰島素（FINS）及相關(guān)血生化指標(biāo)，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），確認(rèn)是否形成胰島素抵抗。造模組所有大鼠禁食12 h后，腹腔內(nèi)注射STZ 溶液，注射劑量以35 mg/kg為標(biāo)準(zhǔn)。STZ 溶液必須現(xiàn)用現(xiàn)配，注射前將STZ溶解于0.1 mol/L、pH 值4.5 無菌檸檬酸緩沖液中，配制成12 mg/mL 的STZ 溶液。A 組大鼠以同樣標(biāo)準(zhǔn)注射等劑量檸檬酸緩沖液。72 h后采集血液及測(cè)量血糖，取3 次測(cè)量平均值作為最終結(jié)果，F(xiàn)BG ≥16.7 mmol/L則認(rèn)為糖尿病大鼠造模成功。糖尿病造模成功大鼠均繼續(xù)給予慢性孤養(yǎng)和不可預(yù)見性中等刺激，具體包括4 ℃冰水浴5 min、45 ℃熱水浴5 min、束縛15 min、噪音8 h、晝夜顛倒24 h、傾籠45°24 h、夾尾1 min 等，每天隨機(jī)選取一種刺激，同種刺激不連續(xù)出現(xiàn)，形成不可預(yù)測(cè)的溫和刺激，共刺激4 周，以曠場實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，以大鼠水平運(yùn)動(dòng)格數(shù)和垂直豎立次數(shù)下降與造模前有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異作為造模成功的判定標(biāo)準(zhǔn)，差異性越大，抑郁程度越高。

2.2 治療方法 造模組40例大鼠隨機(jī)分為5 組，分別為模型組（B組）、陽性對(duì)照組（C組）、針刺組（D組）、疏肝解郁方組（E組）和疏肝解郁方聯(lián)合針刺組（F組）。C 組給予臨床等效劑量二甲雙胍（0.18 g/kg）加百憂解（1.8 mg/kg）灌胃治療；D 組統(tǒng)一于每天早上10 點(diǎn)進(jìn)行針刺治療，取穴：百會(huì)（頂骨正中）、后三里（膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm）、三陰交（后肢內(nèi)踝尖上10 mm），百會(huì)穴斜刺2～3 mm，后三里、三陰交直刺2～3 mm，每日1 次；E 組給予疏肝解郁方臨床等效劑量3.5 g/kg 標(biāo)準(zhǔn)灌胃；F 組治療方法為針刺加疏肝解郁方，方法同D 組與E 組。A 組與B 組給予等劑量生理鹽水灌胃。治療7 d 后觀察結(jié)果。

2.3 觀察及檢測(cè)方法 1）血糖：麻醉后腹主動(dòng)脈取血，促凝管收集，3 000 r/min 離心分離10 min，取上清液-80 ℃保存待檢，使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)FBG、糖化血紅蛋白（HbA1c）及FINS，計(jì)算HOMA-IR，所有操作均嚴(yán)格執(zhí)行試劑盒所示要求。2）RT-PCR法檢測(cè)胰島素受體（IR）、胰島素底物-1（IRS-1）mRNA 表達(dá)：取肝組織50 mg，Trizol 一步法取肺臟組織總RNA，蛋白核酸分析儀檢測(cè)RNA 濃度，M-MuLⅤ逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR 擴(kuò)增檢測(cè)IR、IRS-1 mRNA 表達(dá)，反應(yīng)條件：95 ℃、30 s，94 ℃、5 min，55 ℃、30 s，70 ℃、1 min，35 個(gè)循環(huán)；引物序列如下：IR 上游5’-GCTGGACTGTGGTGGATA-3’，IR 下游5’-GTCAGA CTCAAAAGGTGGG-3’，長度419 bp；IRS-1 上 游5’-CCTGGAGTATTATGAGAACGA-3’，IRS-1 下 游5’-TTGGAGCAACTGGATGAA-3’，長度609 bp；取5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)灰度掃描。3）Western-bloting 法檢測(cè)大鼠海馬組織CaM、CaMK Ⅱ、ERK1/2 含量：大鼠末次治療后斷頭，取新鮮海馬組織，1.5 mL LFP 管中生理鹽水沖洗，充分剪碎后2 500 r/min 離心10 min，去上清；加4 ℃裂解液1 mL，剪碎混勻后低溫超聲勻漿，14 000 r/min，離心5 min 后取上清液；5 μL 上清液加入3 μL 考馬斯亮藍(lán)、95 μL 去離子水，測(cè)量595 nm 處OD 值，并根據(jù)OD 值調(diào)整蛋白濃度；待檢測(cè)蛋白樣品上樣量：50 μg/孔；電泳條件：12%濃縮膠，90 Ⅴ，30 min；10%分離膠，120 Ⅴ，120 min；NC 膜轉(zhuǎn)印，轉(zhuǎn)膜條件：300 mA 恒流，90 min；完全浸沒于5%的的脫脂奶粉TBST 溶液中，搖床2 h,TBS 漂洗5 min，3 次；一抗孵育，4 ℃過夜；二抗孵育，37 ℃1 h；掃描分析結(jié)果，曝光時(shí)間2 min，CCD 自動(dòng)獲取圖像，以1:1 000 稀釋的小鼠抗大鼠β-actin 單克隆抗體作為內(nèi)參，各蛋白相對(duì)表達(dá)量以條帶與相應(yīng)蛋白β-actin 灰度值的比值半定量表示。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用方差分析。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠FBG、HbA1c、HOMA-IR 水平比較 見表1。

表1 各組大鼠FBG、HbA1c、HOMA-IR 水平比較（，n =8）

表1 各組大鼠FBG、HbA1c、HOMA-IR 水平比較（，n =8）

注：與A 組比較，# P ＜0.05；與B 組比較，△P ＜0.05；與F 組比較，▲P ＜0.05

3.2 各組大鼠肝組織IR、IRS-1 mRNA 表達(dá)比較 見表2。

表2 各組大鼠肝組織IR、IRS-1 mRNA 表達(dá)比較（n =8）

3.3 各組大鼠海馬組織CaM、CaMKⅡ平均灰度值及ERK1/2 平均光密度值比較 見表3。

表3 各組大鼠海馬組織CaM、CaMK Ⅱ平均灰度值及ERK1/2平均光密度值比較（，n =8）

表3 各組大鼠海馬組織CaM、CaMK Ⅱ平均灰度值及ERK1/2平均光密度值比較（，n =8）

注：與A 組比較，# P ＜0.05；與B 組比較，△P ＜0.05；與F 組比較，▲P ＜0.05

4 討論

糖尿病作為一種慢性代謝性疾病，可累及多器官、組織，其中對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響越來越受到重視[5]。長期血糖控制不良會(huì)影響其他物質(zhì)代謝，并影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能[6]，導(dǎo)致抑郁的發(fā)生。抑郁是糖尿病患者常見并發(fā)癥，糖尿病合并抑郁癥患者具有高血糖、高血紅蛋白、胰島素抵抗等特征[7]，且上述特征會(huì)相互影響，惡化病情。臨床研究顯示，F(xiàn)BG 和HbA1c 與糖尿病患者抑郁發(fā)病率關(guān)系密切[8]。胰島素抵抗會(huì)影響腦組織葡萄糖利用效果，下調(diào)神經(jīng)元興奮性，導(dǎo)致傳輸速度減緩，在糖尿病并發(fā)抑郁癥的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用[9]，改善FBG、HbA1c、HOMA-IR水平是糖尿病合并抑郁患者治療的重要步驟。本次研究顯示，糖尿病合并抑郁大鼠模型經(jīng)疏肝解郁法聯(lián)合針刺治療后，F(xiàn)BG、HbA1c、HOMA-IR 水平顯著降低（P＜0.05），與陽性對(duì)照組效果相當(dāng)，表明疏肝解郁法聯(lián)合針刺可有效控制大鼠的高血糖，改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，下丘腦-垂體-腎上腺軸功能活動(dòng)亢進(jìn)，皮質(zhì)酮（CorT）、促腎上腺皮質(zhì)激素等水平提高是糖尿病合并抑郁的主要病理生理改變[10]。CorT長期保持高水平會(huì)刺激FINS 分泌，加重糖尿病病情。肝臟是葡萄糖產(chǎn)生和利用的主要器官，也是FINS 作用的靶器官[11]，F(xiàn)INS 能和靶細(xì)胞表面IR 結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致一系列的磷酸化活級(jí)聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生FINS的生物效應(yīng)。任意FINS 信號(hào)傳導(dǎo)環(huán)節(jié)受損均可導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生[12]，因此，研究胰島素受體對(duì)糖尿病合并抑郁大鼠的療效意義重大，本次研究中主要對(duì)大鼠肝組織IR、IRS-1 mRNA 表達(dá)變化進(jìn)行研究。本研究結(jié)果顯示，大鼠經(jīng)治療后IR、IRS-1 mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.05），其中F 組和C 組改善效果最為明顯，表明疏肝解郁法聯(lián)合針刺能夠提高肝組織 IR、IRS-1 的基因表達(dá)，改善FINS 信號(hào)傳導(dǎo)。

海馬組織是參與學(xué)習(xí)記憶、調(diào)控情緒的重要部位[13]，也是糖尿病合并抑郁癥發(fā)生的重要靶點(diǎn)?！昂ｑR神經(jīng)元損傷減少”假說是抑郁發(fā)病的重要機(jī)制之一，海馬神經(jīng)元損傷及可塑性失調(diào)是導(dǎo)致抑郁發(fā)生的重要因素[14]。環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）是調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的關(guān)鍵分子之一[15]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，抑郁癥的發(fā)病機(jī)制逐漸由細(xì)胞外單胺遞質(zhì)途徑轉(zhuǎn)向細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。研究顯示，CREB的表達(dá)與神經(jīng)元可塑性直接相關(guān)，而CREB 的表達(dá)受到多種信號(hào)通路的影響[16]，CaMK 信號(hào)通路是其中重要途徑之一。CaM 是鈣離子重要的受體蛋白，直接參與神經(jīng)元的修復(fù)，其與鈣離子結(jié)合后形成的復(fù)合物能夠激活CaMK Ⅱ。CaMK Ⅱ在海馬區(qū)內(nèi)高度表達(dá)，對(duì)傳遞信息、調(diào)節(jié)神經(jīng)可塑性具有重要作用[17]。絲裂原活化蛋白激酶（MARK）通路能調(diào)節(jié)神經(jīng)元的增長、凋亡及突觸可塑性，ERK1/2 是其中與抑郁癥關(guān)系最為密切的信號(hào)通路[18]。本次研究顯示，B 組海馬組織CaM、CaMKⅡ、ERK1/2表達(dá)顯著低于A組（P＜0.05），表明糖尿病合并抑郁癥會(huì)損傷大鼠海馬神經(jīng)元，提示下調(diào)ERK1/2、CaMK 通路可能是抑郁癥的發(fā)病機(jī)制之一。C 組和F 組CaM、CaMK Ⅱ、ERK1/2 表達(dá)顯著升高（P＜0.05），且與D、E 組有顯著差異（P＜0.05），提示疏肝解郁法聯(lián)合針刺能夠影響CaMK、ERK1/2 信號(hào)通路，調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元再生，發(fā)揮抗抑郁作用。

從上述研究發(fā)現(xiàn)，疏肝解郁法聯(lián)合針刺效果顯著，與陽性藥物一致，表明中醫(yī)在糖尿病合并抑郁的治療中具有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)。在中醫(yī)理論中，糖尿病屬于“消渴”的范疇，歷代醫(yī)家認(rèn)為其發(fā)生與發(fā)展與情志關(guān)系密切。抑郁癥屬于“郁證”的范疇，消渴遷延難愈，情志內(nèi)傷，則肝氣不舒、郁結(jié)于內(nèi)，郁久化熱，熱灼傷津，耗傷陰津，加重消渴之癥。消渴與郁證共存，二者相互影響，加重疾病的進(jìn)展。本研究中采用疏肝解郁法聯(lián)合針刺治療糖尿病合并抑郁。肝氣郁結(jié)是該病早期顯著特點(diǎn)，故采用疏肝解郁之法，方中柴胡疏肝解郁為君藥，臣以川芎行氣活血止痛，香附理氣疏肝，二者合用，助君藥解肝經(jīng)之郁滯；陳皮理氣行滯，黨參補(bǔ)中益氣、止渴生津，白術(shù)、茯苓健脾益氣、燥濕利水，白芍養(yǎng)血柔肝，為佐藥；甘草調(diào)和諸藥，為使藥。諸藥同用，共奏疏肝行氣，活血止痛之功。郁證病位在腦，與心肝脾密切相關(guān)，本次研究中針刺選擇百會(huì)、后三里、三陰交。從心論治，醒腦開竅，心主神，百會(huì)位于頭部巔頂，乃諸脈匯聚之處，針刺可調(diào)神通督；從肝論治，調(diào)節(jié)疏泄?fàn)顟B(tài)，三陰交乃肝脾腎匯集之處，針刺可調(diào)肝、運(yùn)脾、健腎；從脾論治，運(yùn)脾化濕，調(diào)暢氣機(jī)，后三里可調(diào)節(jié)脾土。

綜上所述，疏肝解郁法聯(lián)合針刺治療糖尿病合并抑郁大鼠的機(jī)制可能與改善血糖異常，提高肝組織IR、IRS-1 的基因表達(dá)從而改善胰島素的信號(hào)傳導(dǎo)，激活ERK1/2、CaMK 信號(hào)通路調(diào)節(jié)大鼠海馬神經(jīng)元再生有關(guān)。