何 濤，樊小莉，魯 璐，黃田鈁

(中國科學院成都生物研究所，四川 成都 610041)

石斛(DendrobiumnobileLindl.)又名金釵石斛，為多年生草本植物，生于林中樹干或山谷巖石上；在中國主要分布于四川南部、貴州西南部至北部、云南東南部至西北部、湖北、廣西、海南和臺灣等地[1]。石斛具有極高的藥用、生態(tài)和科研價值，目前，有關石斛的研究主要集中于化學成分[2-4]、藥理作用[5-6]、分子標記[7-11]、基因克隆[12-13]、組織培養(yǎng)[14]、遺傳轉化[15-16]以及人工栽培[17-18]等方面。對石斛分子遺傳多樣性的研究結果[19-23]表明：在分子水平上，不同種源石斛存在高度變異，種源間的變異大于種源內，且種源間存在較高水平的遺傳分化。而在形態(tài)特征上，不同產地石斛的莖直徑存在顯著差異[24]，表明石斛的遺傳和表型均存在不同程度的變異。

表型多樣性是遺傳多樣性的主要研究內容之一，在適應和進化上具有重要意義，有助于了解其遺傳穩(wěn)定性和選擇潛力。表型性狀具有直觀、測量簡單、經濟方便的特點，可以快捷、有效地檢測群體的變異和分化。目前，雖然已有研究者對石斛表型性狀進行了初步的觀察和統(tǒng)計[24]，但不同產地石斛表型性狀多樣性及其與地理因子的關系尚不清晰，不利于石斛資源的可持續(xù)利用和保護。

鑒于此，作者從四川、貴州和云南的不同產地收集了10個石斛種源，對其營養(yǎng)器官和花器官的18個表型性狀進行了測定，采用變異系數(shù)、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和表型分化系數(shù)以及方差分析、相關性分析和聚類分析等指標和方法，對不同種源間各表型性狀的表型分化程度和變異規(guī)律及其影響因子進行分析，以期為石斛的生物多樣性保護和種質資源的可持續(xù)利用提供基礎數(shù)據。

1 材料和方法

1.1 材料

在實地調查的基礎上，在四川、貴州和云南選取10個有代表性的石斛種源地，包括貴州省赤水市的旺隆鎮(zhèn)和復興鎮(zhèn)，四川省合江縣的五通鎮(zhèn)、鳳鳴鎮(zhèn)和福寶鎮(zhèn)，四川省宜賓市的思坡鎮(zhèn)和宋家鎮(zhèn)，四川省洪雅縣柳江鎮(zhèn)，四川省夾江縣歇馬鄉(xiāng)以及云南省勐臘縣勐臘鎮(zhèn)，各種源產地的基本概況見表1。對種源地中心位置進行GPS定位，各種源地間隔大于或等于15 km。在生境為林下巖石上的5個種源地分別設置1個面積約2 000 m2的樣地，隨機選擇30叢石斛樣本；在生境為花盆中或樹干上的種源地隨機選擇零散種植的石斛樣本4至20叢。

表1 供試10個石斛種源產地的基本概況

供試石斛樣株為野生轉人工育苗的栽培植株，栽種年限在5 a以上，已穩(wěn)定生長和繁衍，且無明顯病蟲害。所有樣株由作者進行種類鑒定。在4月至5月的盛花期采集50朵帶花梗的完整花以及50條2年生帶葉的完整鮮莖作為測定樣本。

1.2 方法

1.2.1 表型性狀的選擇 依據文獻[25-27]確定表型性狀的選擇標準，選取易于獲取的18個表型性狀，包括8個營養(yǎng)器官性狀(莖節(jié)數(shù)、莖長、莖基部直徑、莖中部直徑、莖上部直徑、葉片長、葉片寬和葉片長寬比)以及10個花器官性狀(花梗長、中萼片長、中萼片寬、中萼片長寬比、側萼片長、側萼片寬、側萼片長寬比、花瓣長、花瓣寬和花瓣長寬比)。

1.2.2 測定方法 單莖的莖節(jié)數(shù)直接目測計數(shù)；采用直尺(精度0.1 cm)分別測量莖長(莖基部至莖尖的長度)、葉片長(伸直狀態(tài)下葉片基部到葉尖的長度)、葉片寬(伸直狀態(tài)下葉片中部最寬處的寬度)、花梗長(連接花朵和莖的短柄長度)、中萼片長(自然狀態(tài)下中萼片基部至尖端的長度)、中萼片寬(自然狀態(tài)下中萼片中部的寬度)、側萼片長(自然狀態(tài)下側萼片基部至尖端的長度)、側萼片寬(自然狀態(tài)下側萼片中部的寬度)、花瓣長(自然狀態(tài)下花瓣基部至尖端的長度)和花瓣寬(自然狀態(tài)下花瓣中部的寬度)；采用游標卡尺(精度0.01 mm)分別測量莖基部直徑(莖基部第1節(jié)間的最大直徑)、莖中部直徑(莖中部節(jié)間的最大直徑)和莖上部直徑(莖最上部節(jié)間的最大直徑)。根據測量結果，分別計算葉片、中萼片、側萼片和花瓣的長寬比。

1.3 數(shù)據處理和分析

采用EXCEL 2010軟件整理數(shù)據。采用DPS 18.10軟件計算變異系數(shù)、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)，并進行Duncan’s多重比較、方差分析、相關性分析和聚類分析(UPGMA法)，分析前對數(shù)據進行標準化處理和轉換。參照文獻[28]計算表型分化系數(shù)。

2 結果和分析

2.1 不同種源石斛表型性狀的比較和變異分析

不同種源石斛營養(yǎng)器官和花器官性狀的測定結果及變異系數(shù)分別見表2和表3。

表2 不同種源石斛營養(yǎng)器官和花器官18個表型性狀的比較

表3 不同種源石斛營養(yǎng)器官和花器官18個表型性狀的變異系數(shù)

2.1.1 營養(yǎng)器官性狀比較 由表2可見：供試10個石斛種源的莖節(jié)數(shù)、莖長、莖基部直徑、莖中部直徑、莖上部直徑、葉片長、葉片寬和葉片長寬比的均值分別為9.6、30.08 cm、3.67 mm、9.80 mm、5.06 mm、8.98 cm、2.02 cm和4.59。其中，云南省勐臘縣勐臘鎮(zhèn)(P10)種源的莖節(jié)數(shù)、莖基部直徑、莖中部直徑、莖上部直徑、葉片長和葉片寬均最大，且總體上與其他種源差異顯著(P<0.05)；貴州省赤水市旺隆鎮(zhèn)(P1)種源的莖長最大，且與其他種源差異顯著；四川省宜賓市宋家鎮(zhèn)(P7)種源的葉片長寬比最大，但其莖基部直徑和莖上部直徑均最小，且總體上與其他種源差異顯著；四川省合江縣福寶鎮(zhèn)(P5)種源的葉片長和葉片寬均最小，且與多數(shù)種源差異顯著；四川省洪雅縣柳江鎮(zhèn)(P8)種源的莖節(jié)數(shù)和莖中部直徑均最小，且與多數(shù)種源差異顯著；四川省夾江縣歇馬鄉(xiāng)(P9)種源的莖長和葉片長寬比均最小，且與多數(shù)種源差異顯著?？傮w上看，8個營養(yǎng)器官性狀在多數(shù)種源間存在顯著差異。

2.1.2 花器官性狀比較 由表2還可見：供試10個石斛種源的花梗長、中萼片長、中萼片寬、中萼片長寬比、側萼片長、側萼片寬、側萼片長寬比、花瓣長、花瓣寬和花瓣長寬比的均值分別為4.58 cm、3.66 cm、1.29 cm、2.87、3.53 cm、1.21 cm、2.93、3.75 cm、2.19 cm和1.71。其中，四川省宜賓市思坡鎮(zhèn)(P6)種源的中萼片長、中萼片長寬比、側萼片長、側萼片長寬比、花瓣長和花瓣長寬比均最大，且與其他種源差異顯著；P10種源的花梗長、中萼片寬、側萼片寬和花瓣寬均最大，且與多數(shù)種源差異顯著；而P8種源的花梗長、中萼片長、中萼片寬、側萼片長、側萼片寬和花瓣長寬比均最小，且除花瓣長寬比外，其他表型性狀總體上與另9個種源差異顯著；P9種源的花瓣長和花瓣寬均最小，且總體上與其他種源差異顯著；P1種源的中萼片長寬比最小，且與多數(shù)種源差異顯著；P5種源的側萼片長寬比最小，且與多數(shù)種源差異顯著。總體上看，10個花器官性狀在多數(shù)種源間存在顯著差異。

2.1.3 表型性狀變異分析 由表3可見：石斛營養(yǎng)器官和花器官性狀在種源間和種源內均存在不同程度的變異。在8個營養(yǎng)器官性狀中，莖長的變異系數(shù)最大，為16.29%～34.79%，均值為24.38%；莖基部直徑的變異系數(shù)最小，為7.91%～20.28%，均值為13.40%，表明在種源內個體間莖長的差異較大，而莖基部直徑的差異較小。在10個花器官性狀中，中萼片寬的變異系數(shù)最大，為7.97%～17.26%，均值為12.27%；花瓣長寬比的變異系數(shù)最小，為4.03%～15.66%，均值為8.24%，說明在種源內個體間中萼片寬的差異較大，而花瓣長寬比的差異較小?？傮w上看，8個營養(yǎng)器官性狀的變異系數(shù)均值均大于13%，而10個花器官性狀的變異系數(shù)均值均小于13%，表明石斛營養(yǎng)器官性狀的變異水平高于花器官性狀。

在10個種源中，P9種源的變異系數(shù)均值最大(19.02%)，P1種源的變異系數(shù)均值最小(12.08%)。變異系數(shù)總均值為14.36%，表明石斛各種源間表型性狀的變異較豐富。

2.2 不同種源石斛表型性狀的多樣性和表型分化分析

不同種源石斛營養(yǎng)器官和花器官性狀的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和表型分化系數(shù)分別見表4和表5。

2.2.1 多樣性分析 由表4可見：供試10個石斛種源18個表型性狀的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)均在3.8以上，均值為3.881～3.908，變幅較小。在18個表型性狀中，莖長的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)最小，而花瓣長寬比的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)最大?？傮w上看，在不同種源中，石斛的18個表型性狀均存在豐富的多樣性，且多樣性水平相近。

表4 不同種源石斛營養(yǎng)器官和花器官18個表型性狀的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)

2.2.2 表型分化分析 由表5可見：石斛18個表型性狀在種源間均存在極顯著(P<0.01)差異；而在種源內只有莖節(jié)數(shù)、莖長、花瓣長和花瓣寬4個表型性狀存在極顯著差異。種源間各表型性狀的方差分量均大于或等于種源內，種源間的方差分量為0.000 1～0.036 2，種源內方差分量為0.000 1～0.015 1。

表5 不同種源石斛營養(yǎng)器官和花器官18個表型性狀的方差分析結果和表型分化系數(shù)

各表型性狀的表型分化系數(shù)為50.00%～87.50%，其中，僅中萼片寬、中萼片長寬比和花瓣寬3個表型性狀的表型分化系數(shù)為50.00%，其他表型性狀的表型分化系數(shù)均在57%以上；18個表型性狀的表型分化系數(shù)均值為65.80%，表明種源間的變異是石斛表型性狀變異的主要來源。

2.3 不同種源石斛表型性狀與地理因子的相關性分析

對不同種源石斛的18個表型性狀與經度、緯度和海拔的相關性進行分析，結果見表6。

由表6可見：在18個表型性狀中，僅葉片長和葉片寬與經度呈顯著(P<0.05)負相關，相關系數(shù)分別為-0.705和-0.697，其他表型性狀與經度均無顯著相關性，表明石斛葉片生長呈現(xiàn)以經度為主導的變異模式，即隨經度升高，葉片變短、變窄。莖節(jié)數(shù)、莖基部直徑、莖中部直徑、莖上部直徑和花梗長與緯度呈顯著或極顯著(P<0.01)負相關，相關系數(shù)分別為-0.712、-0.905、-0.786、-0.750和-0.660，其他表型性狀與緯度均無顯著相關性，表明這5個指標均呈現(xiàn)以緯度為主導的變異模式，即隨緯度升高，莖節(jié)數(shù)減少、莖直徑變小、花梗變短。18個表型性狀與海拔均無顯著相關性，表明海拔變化對石斛表型性狀變異無明顯的影響效應。

表6 不同種源石斛營養(yǎng)器官和花器官18個表型性狀與地理因子的相關系數(shù)

2.4 不同種源石斛的聚類分析

基于營養(yǎng)器官和花器官的18個表型性狀，采用歐氏距離對不同種源石斛進行聚類分析，結果見圖1。

由圖1可見：在歐氏距離6.5處，可將10個種源分為3組：組Ⅰ包含貴州省赤水市的旺隆鎮(zhèn)和復興鎮(zhèn)，四川省合江縣的五通鎮(zhèn)、鳳鳴鎮(zhèn)和福寶鎮(zhèn)，四川省宜賓市的宋家鎮(zhèn)和思坡鎮(zhèn)的7個種源，緯度均在N28°范圍內，且這7個種源的地理位置相近，均位于四川南部和與四川南部交界的貴州西北部；組Ⅱ包含四川省洪雅縣柳江鎮(zhèn)和夾江縣歇馬鄉(xiāng)的2個種源，緯度均在N29°范圍內，且這2個種源均位于四川西南部；組Ⅲ僅包含云南省勐臘縣勐臘鎮(zhèn)的1個種源，緯度在N21°范圍內，該種源位于云南最南端，與其他9個種源的地理位置最遠。

P1，P2：分別來源于貴州省赤水市的旺隆鎮(zhèn)和復興鎮(zhèn)Collected from Wanglong Town and Fuxing Town in Chishui City of Guizhou Province，respectively；P3，P4，P5：分別來源于四川省合江縣的五通鎮(zhèn)、鳳鳴鎮(zhèn)和福寶鎮(zhèn)Collected from Wutong Town，F(xiàn)engming Town and Fubao Town in Hejiang County of Sichuan Province，respectively；P6，P7：分別來源于四川省宜賓市的思坡鎮(zhèn)和宋家鎮(zhèn)Collected from Sipo Town and Songjia Town in Yibin City of Sichuan Province，respectively；P8：來源于四川省洪雅縣柳江鎮(zhèn)Collected from Liujiang Town in Hongya County of Sichuan Province；P9：來源于四川省夾江縣歇馬鄉(xiāng)Collected from Xiema Township in Jiajiang County of Sichuan Province；P10：來源于云南省勐臘縣勐臘鎮(zhèn)Collected from Mengla Town in Mengla County of Yunnan Province.

在歐氏距離3.5處，組Ⅰ又可分為4個亞組：貴州省赤水市的旺隆鎮(zhèn)和復興鎮(zhèn)2個種源以及四川省合江縣的五通鎮(zhèn)和鳳鳴鎮(zhèn)的2個種源聚為亞組Ⅰ1，經度均在E105°范圍內；四川省合江縣福寶鎮(zhèn)的1個種源單獨組成亞組Ⅰ2，經度在E106°范圍內；四川省宜賓市的宋家鎮(zhèn)和思坡鎮(zhèn)的2個種源各自單獨成組，分別為亞組Ⅰ3和Ⅰ4，經度均在E104°范圍內。

總體上看，供試10個種源的分組與其地理位置和緯度有關，而亞組內種源的聚類則與經度相關，聚類結果表現(xiàn)出與經度和緯度相關的連續(xù)變異模式。

3 討論和結論

上述研究結果表明：在10個石斛種源的18個表型性狀中，有16個表型性狀的變異系數(shù)均值大于10%，占表型性狀總數(shù)的88.9%，僅側萼片長寬比和花瓣長寬比2個表型性狀的變異系數(shù)均值小于10%，僅占表型性狀總數(shù)的11.1%；10個種源的變異系數(shù)均值為12.08%～19.02%，均大于10%。變異系數(shù)越大，表型性狀差異越明顯，遺傳變異可能性越大，表明不同種源石斛的營養(yǎng)器官和花器官存在豐富的變異，可為石斛的遺傳改良和生物多樣性保護提供物質基礎。變異系數(shù)的差異還反映了不同表型性狀對環(huán)境的不同適應能力[27]，同一種源內也可能存在多種變異類型[29]。在本研究中，石斛的8個營養(yǎng)器官性狀的變異系數(shù)均值均大于13%，而10個花器官性狀的變異系數(shù)均值均小于13%，表明石斛莖和葉性狀的變異水平高于花器官性狀，花器官受環(huán)境的影響較小，更趨于穩(wěn)定[30]。

10個石斛種源18個表型性狀的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)均在3.8以上，說明不同種源石斛的表型性狀變異較大，多樣性豐富。但Shannon-Wiener多樣性指數(shù)與變異系數(shù)的變化規(guī)律并不一致，例如：莖長的變異系數(shù)均值最大(24.38%)，花瓣長寬比的變異系數(shù)均值最小(8.24%)，而莖長的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)均值最小(3.881)，花瓣長寬比的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)均值卻最大(3.908)。雖然變異系數(shù)和Shannon-Wiener多樣性指數(shù)都是反映生物多樣性的重要指標，但這2個指標變化規(guī)律的不一致揭示了其內涵的不同。表型性狀的變異系數(shù)反映的是表型性狀的離散程度，數(shù)值越大，說明表型性狀的變異程度越大；Shannon-Wiener多樣性指數(shù)反映的是表型性狀的多樣性，數(shù)值越大，說明表型性狀多樣性越豐富。但二者之間不存在關聯(lián)性[31]。

種源間變異是種內生物多樣性的重要組成部分[32-33]。方差分析結果表明：石斛18個表型性狀種源間的F值為10.399～80.399，種源間差異均極顯著(P<0.01)，而種源內的F值僅為0.670～1.981，顯示各表型性狀在種源間的F值明顯大于種源內。石斛所有表型性狀的表型分化系數(shù)均大于或等于50.00%，表型分化系數(shù)均值為65.80%，顯示種源間表型性狀的分化程度明顯大于種源內。表明不同種源石斛的表型性狀變異豐富，在種源水平上未表現(xiàn)出表型多樣性水平下降，且種源間變異是石斛種源表型性狀變異的主要來源。

已有的相關研究結果[33-35]顯示：環(huán)境條件(如經度、緯度和海拔等主要地理因子)變化是種源間變異形成的主要因子，并因植物種類的不同而異。本研究結果顯示：石斛表型性狀變異豐富的原因與所選擇的種源產地范圍較廣有關，10個種源的產地分別位于四川、貴州和云南，跨越了3個省份，經緯度的跨度較大(分別達到6°和9°)，氣候類型變化多樣，為了適應不同區(qū)域環(huán)境的異質性，石斛的表型性狀隨之發(fā)生了變化。

在不同的環(huán)境中，石斛通過形態(tài)變化和表型性狀分化調整自身的生長發(fā)育及其與環(huán)境之間的關系，從而適應環(huán)境的變化。相關性分析結果表明：石斛的莖節(jié)數(shù)、莖基部直徑、莖中部直徑、莖上部直徑和花梗長與緯度均呈顯著(P<0.05)或極顯著負相關；葉片長和葉片寬與經度呈顯著負相關；其他表型性狀與經度和緯度均無顯著相關性。表明隨緯度的升高，莖節(jié)數(shù)減少、莖直徑變小、花梗變短；隨地理位置的西移，葉片變得更為寬大。緯度的變化，意味著氣候的變化，緯度越低，氣溫越高，而較高的氣溫有利于石斛的營養(yǎng)生長，使植株變得高大。這也說明營養(yǎng)器官性狀更容易受到環(huán)境因子中水分、養(yǎng)分和光照的影響，如云南省勐臘縣勐臘鎮(zhèn)種源的產地緯度只有N21°，但該種源石斛的莖葉粗大，這也符合石斛為熱帶亞熱帶植物、喜高溫高濕環(huán)境的特點。此外，石斛的所有表型性狀與海拔均無顯著相關性，說明海拔對石斛表型性狀無明顯的影響效應。

石斛為蘭科(Orchidaceae)附生植物，可附生在巖石上，也可附生在樹干上。貴州省赤水市的旺隆鎮(zhèn)和復興鎮(zhèn)以及四川省合江縣的五通鎮(zhèn)、鳳鳴鎮(zhèn)和福寶鎮(zhèn)的5個種源的石斛均生長在林下巖石上；而其他5個種源的石斛均附生在不同樹種的樹干上。從表型性狀的變異系數(shù)看，附生在林下巖石上的石斛種源各表型性狀的變異程度總體上小于附生在樹干上的種源，表明不同的附生模式也是造成石斛表型性狀變異的原因之一。

聚類分析結果表明：在歐氏距離6.5處，可將10個種源分為3組，總體上表現(xiàn)出地理位置和緯度相近的種源聚在一起的規(guī)律。組Ⅰ包含的7個種源，緯度均在N28°范圍內，均位于四川南部和與四川南部交界的貴州西北部；組Ⅱ包含的2個種源，緯度均在N29°范圍內，均位于四川西南部；組Ⅲ僅包含1個種源，緯度在N21°范圍內，位于云南最南端，該種源與其他9個種源的距離最遠。表明石斛的表型變異與其產地的地理位置有關，表現(xiàn)出按地理位置而聚類的特征[36-38]。在歐氏距離3.5處，可將組Ⅰ再進一步分為4個亞組，亞組內種源聚類主要與經度有關，其中，貴州省赤水市復興鎮(zhèn)和四川省合江縣五通鎮(zhèn)的2個種源先聚在一起，并與貴州省赤水市旺隆鎮(zhèn)和四川省合江縣鳳鳴鎮(zhèn)的2個種源聚在一起，這4個種源的來源地經度均在E106°范圍內；而經度在E104°范圍內的四川省宜賓市的思坡鎮(zhèn)和宋家鎮(zhèn)的2個種源各自獨立成組。亞組的聚類結果說明在地理因子相近的條件下，遺傳因子在表型性狀變異中具有主要作用，杜會聰?shù)萚39]的研究結果也佐證了這一觀點，即在所選研究對象的分布范圍較小時，遺傳因子是導致表型性狀出現(xiàn)差異的主要原因。另外，根據亞組Ⅰ1的聚類結果，推測貴州省赤水市復興鎮(zhèn)與四川省合江縣五通鎮(zhèn)的種源的原產地可能相同，而與同一個市的旺隆鎮(zhèn)的種源的原產地可能不同。

綜上所述，不同石斛種源的營養(yǎng)器官和花器官性狀的多樣性豐富，種源間變異是其表型性狀變異的主要來源，不同石斛種源的表型性狀呈現(xiàn)以經緯度主導的地理變異模式。在本研究中，并沒有對石斛的表型質量性狀(植株莖、葉和花的形態(tài)和顏色)以及種實性狀(種子質量和果實質量等)等進行考察，缺乏表型性狀變異與氣候因子的相關性分析，且對不同石斛種源的表型性狀變異與其遺傳變異的一致性也缺乏深度研究，因此，后續(xù)將進一步對這些科學問題進行研究和探討。