張北紅，肖祖飛，張海燕，侯杰希，王顏波，李 鳳，呂雄偉，金志農(nóng)，①

〔1.南昌工程學(xué)院水利與生態(tài)工程學(xué)院 江西省樟樹繁育與開發(fā)利用工程研究中心，江西 南昌 330099；2.國(guó)家林業(yè)和草原局木本香料(華東)工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330045〕

檸檬醛是食品、香料和醫(yī)藥等領(lǐng)域的重要原料[1-3]，極具市場(chǎng)價(jià)值和開發(fā)潛力。國(guó)內(nèi)的天然檸檬醛主要來源于山雞椒〔Litseacubeba(Lour.)Pers.〕的花、葉和果皮[4-5]，而天然檸檬醛長(zhǎng)期存在市場(chǎng)供應(yīng)不足的問題，因此，亟需拓展來源植物資源。

迄今為止已發(fā)現(xiàn)十余種富含檸檬醛的植物，其中樟屬(CinnamomumSchaeff.)樟組〔Sect.Camphora(Trew)Meissn.〕植物占近一半[6]。研究表明：樟組植物不同種群及個(gè)體間葉片的精油得率和主要化學(xué)成分相對(duì)含量均存在差異[7]，因此，有必要對(duì)各化學(xué)型樟組植物進(jìn)行優(yōu)良單株篩選。目前關(guān)于芳樟醇型、異橙花叔醇型、桉葉油素型和腦樟型等香樟〔C.camphora(Linn.)Presl〕常見化學(xué)型的優(yōu)良單株篩選及等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)已有報(bào)道[8-9]，但未見關(guān)于檸檬醛型香樟及其他樟組植物優(yōu)良單株篩選的報(bào)道。

自然界中，檸檬醛型樟組植物的分布概率很低，如檸檬醛型香樟的分布概率不足萬分之一，檸檬醛型猴樟(C.bodinieriLévl.)和黃樟〔C.parthenoxylon(Jack)Meisn.〕的分布概率約30%，檸檬醛型沉水樟〔C.micranthum(Hay.)Hay.〕和細(xì)毛樟(C.tenuipilumKosterm.)的分布概率低于10%[10]，篩選檸檬醛型樟組植物優(yōu)良單株對(duì)于滿足檸檬醛市場(chǎng)需求具有重要意義。為此，以廣西、江西、廣東、云南、湖北和四川的48株野生檸檬醛型香樟、黃樟、細(xì)毛樟和猴樟為研究對(duì)象，對(duì)供試樣株葉片精油得率及精油中檸檬醛相對(duì)含量進(jìn)行了比較，在此基礎(chǔ)上篩選優(yōu)良單株，以期為檸檬醛型樟組植物的開發(fā)利用及優(yōu)良單株等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

采用聞香法[10]對(duì)廣西、江西、廣東、云南、湖北和四川的野生香樟、黃樟、細(xì)毛樟和猴樟進(jìn)行化學(xué)型初判，確定檸檬醛型植株并編號(hào)，采集地和樣株信息見表1。樣株種類和化學(xué)型均由江西省樟樹繁育與開發(fā)利用工程研究中心金志農(nóng)研究員鑒定。

表1 供試檸檬醛型樟組植物的采集地和樣株信息

主要儀器：自主研發(fā)的便攜式水蒸氣精油蒸餾提取設(shè)備(專利授權(quán)號(hào)：ZL201720260199.0)；MA150快速水分測(cè)定儀(德國(guó)Sartorius公司)；BSA4202S-CW精密電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；7890B-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Aglient公司)。

1.2 方法

1.2.1 采樣方法 在2017年至2019年每年的5月中旬晴天日9：00至11：00，采用全株采樣法[11]采集健康、無病蟲害的當(dāng)年生葉片。采樣時(shí)，將樹冠分成上、中、下3層，在各層的東、南、西、北向采集葉片，同株葉片充分混勻，4 ℃保存、備用。

1.2.2 葉片含水率測(cè)定 每株樣株隨機(jī)選3份葉片，每份6枚；沿葉中脈切開，切成面積約1 cm×1 cm的小塊；使用快速水分測(cè)定儀測(cè)定葉片含水率。

1.2.3 精油提取及檢測(cè)分析 每株樣株稱取3份葉片，每份200 g；采用水蒸氣蒸餾法[12]提取精油，稱量精油質(zhì)量，4 ℃避光保存。將同一樣株的3份精油樣品等體積混勻，使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)分析，進(jìn)樣量1.0 μL，檢測(cè)條件與文獻(xiàn)[12]一致。

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算葉片精油得率，計(jì)算公式為葉片精油得率=(精油質(zhì)量/葉片鮮質(zhì)量)×(100%-葉片含水率)。采用文獻(xiàn)檢索法[13-14]，通過NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索，采用保留指數(shù)進(jìn)行定性分析，利用峰面積歸一化法[15]計(jì)算精油中檸檬醛的相對(duì)含量。

1.2.4 優(yōu)株篩選 參照相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]的篩選方法，以各樣株葉片精油得率和檸檬醛相對(duì)含量的平均值(X0)為基準(zhǔn)、標(biāo)準(zhǔn)差(SD)為疊加值，將供試樣株分成4個(gè)等級(jí)，各等級(jí)葉片精油得率和檸檬醛相對(duì)含量(X)如下：一級(jí)，X≥X0+2.0SD；二級(jí)，X0+1.5SD≤X

根據(jù)樣株選優(yōu)指標(biāo)(λ)篩選優(yōu)良單株，λ的計(jì)算公式為λ=葉片精油得率×檸檬醛相對(duì)含量×10 000。將所有初選優(yōu)株的λ均值作為平均選優(yōu)指標(biāo)(λ0)。初選優(yōu)株也分成4個(gè)等級(jí)，各等級(jí)的λ值如下：一級(jí)，λ≥λ0+2.0SD；二級(jí)，λ0+1.5SD≤λ<λ0+2.0SD；三級(jí)，λ0+SD≤λ<λ0+1.5SD；四級(jí)，λ0≤λ<λ0+SD。λ<λ0，不定級(jí)。λ值在一至四級(jí)的樣株為最終的優(yōu)良單株。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 22.0軟件對(duì)葉片精油得率和檸檬醛相對(duì)含量進(jìn)行單因素方差分析，使用EXCEL 2017軟件計(jì)算均值和變異系數(shù)等指標(biāo)[16]。

2 結(jié)果和分析

2.1 檸檬醛型樟組植物葉片精油得率及精油中檸檬醛相對(duì)含量的比較分析

檸檬醛型樟組植物葉片精油得率及精油中檸檬醛相對(duì)含量的比較結(jié)果見表2。由表2可以看出：編號(hào)NM-22的樣株葉片精油得率最高，達(dá)3.64%；編號(hào)NM-45的樣株葉片精油得率最低，僅0.15%；并且，前者為后者的24.3倍。編號(hào)NM-42的樣株檸檬醛相對(duì)含量最高，達(dá)77.13%，編號(hào)NM-32的樣株檸檬醛相對(duì)含量最低，僅13.65%；并且，前者為后者的5.7倍。方差分析結(jié)果表明：樣株間的葉片精油得率存在極顯著(P<0.01)差異。供試樣株葉片精油得率的均值為1.35%，變異系數(shù)為58.78%；檸檬醛相對(duì)含量的均值為47.62%，變異系數(shù)為30.38%。

表2 檸檬醛型樟組植物葉片精油得率及精油中檸檬醛相對(duì)含量的比較

由表2還可以看出：不同種類葉片精油得率和檸檬醛相對(duì)含量的均值存在差異。從各種類葉片精油得率的均值看，香樟最高(1.79%)、黃樟次之(1.64%)、猴樟較低(1.04%)、細(xì)毛樟最低(0.66%)。從各種類檸檬醛相對(duì)含量的均值看，細(xì)毛樟最高(56.56%)、黃樟次之(51.76%)、猴樟較低(45.10%)、香樟最低(43.37%)。

由表2還可以看出：不同省(自治區(qū))葉片精油得率和檸檬醛相對(duì)含量的均值也存在差異。各省(自治區(qū))葉片精油得率均值從高到低依次為廣東、廣西、江西、四川、湖北、云南，檸檬醛相對(duì)含量均值從高到低依次為廣東、云南、江西、湖北、廣西、四川。值得注意的是，不同省(自治區(qū))同種類葉片精油得率和檸檬醛相對(duì)含量的均值存在差異，如采自廣西的香樟葉片精油得率均值為1.82%，檸檬醛相對(duì)含量均值為46.73%，而采自江西的香樟葉片精油得率均值為1.76%，檸檬醛相對(duì)含量均值為40.00%。同省(自治區(qū))不同種類葉片精油得率和檸檬醛相對(duì)含量的均值也存在差異，以采自江西的香樟和黃樟為例，黃樟葉片精油得率均值(1.44%)低于香樟，其檸檬醛相對(duì)含量均值(50.23%)高于香樟。

2.2 檸檬醛型樟組植物初選優(yōu)株的確定

分別對(duì)供試48株檸檬醛型樟組植物的葉片精油得率和檸檬醛相對(duì)含量進(jìn)行分級(jí)，獲得初選優(yōu)株，結(jié)果見表3。

由表3可以看出：葉片精油得率在一至四級(jí)的樣株有22株，包括4株香樟(占香樟樣株總數(shù)的66.7%)、11株黃樟(占黃樟樣株總數(shù)的61.1%)和7株猴樟(占猴樟樣株總數(shù)的30.4%)；檸檬醛相對(duì)含量在一至四級(jí)的樣株有27株，包括3株香樟(占香樟樣株總數(shù)的50.0%)、12株黃樟(占黃樟樣株總數(shù)的66.7%)、1株細(xì)毛樟(占細(xì)毛樟樣株總數(shù)的100.0%)和11株猴樟(占猴樟樣株總數(shù)的47.8%)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：葉片精油得率和檸檬醛相對(duì)含量均在一至四級(jí)的樣株有14株，編號(hào)分別為NM-2、NM-4、NM-8、NM-9、NM-11、NM-14、NM-16、NM-19、NM-21、NM-22、NM-24、NM-26、NM-29和NM-33，這些樣株均為初選優(yōu)株。

表3 檸檬醛型樟組植物初選優(yōu)株的篩選結(jié)果1)

2.3 檸檬醛型樟組植物優(yōu)良單株的選擇

計(jì)算上述初選優(yōu)株的選優(yōu)指標(biāo)(λ)，并依據(jù)平均選優(yōu)指標(biāo)(λ0)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)對(duì)初選優(yōu)株進(jìn)行分級(jí)，在此基礎(chǔ)上選出優(yōu)良單株，結(jié)果見表4。

表4 檸檬醛型樟組植物優(yōu)良單株的篩選結(jié)果

由表4可以看出：一級(jí)優(yōu)良單株僅1株，編號(hào)為NM-46；二級(jí)優(yōu)良單株無入選樣株；三級(jí)優(yōu)良單株也只有1株，編號(hào)為NM-8；四級(jí)優(yōu)良單株有6株，編號(hào)分別為NM-2、NM-4、NM-9、NM-11、NM-16和NM-24；不定級(jí)的樣株有6株，編號(hào)分別為NM-14、NM-19、NM-21、NM-26、NM-29和NM-33。

3 討論和結(jié)論

研究結(jié)果表明：供試檸檬醛型樟組植物的葉片精油得率和檸檬醛相對(duì)含量在不同種類、個(gè)體及產(chǎn)地間均存在差異，這與各樣株的內(nèi)在遺傳因子和外界環(huán)境因子(坡位、坡向、土壤等)均有關(guān)[11，17-18]。猴樟和細(xì)毛樟的葉片精油得率普遍低于黃樟和香樟，這是因?yàn)楹镎梁图?xì)毛樟葉片相對(duì)大而厚且革質(zhì)化程度高，葉片中精油的游離釋放難度大，精油不能被充分提取。細(xì)毛樟和黃樟葉片精油中檸檬醛相對(duì)含量較香樟和猴樟更高，這可能與細(xì)毛樟和黃樟分布地地理環(huán)境有關(guān)，相對(duì)較高的氣溫有利于次生代謝產(chǎn)物的形成和積累。不同省(自治區(qū))檸檬醛型樟組植物葉精油得率和檸檬醛相對(duì)含量受植物自身與環(huán)境條件的綜合影響，如四川廣元的猴樟，由于受該種類葉片特性影響，葉片精油得率普遍偏低，受高海拔和低氣溫等因子影響，次生代謝產(chǎn)物的合成受限，檸檬醛相對(duì)含量普遍偏低。同省(自治區(qū))同種類不同個(gè)體間的精油得率和檸檬醛相對(duì)含量也存在差異，這可能是因?yàn)椴煌N類的樹齡[17]、坡向[18]和坡位[19]等因子直接影響次生代謝產(chǎn)物的合成，也可能是因?yàn)橥寥馈⒎柿土址置芏萚20-23]等影響植株長(zhǎng)勢(shì)及光照強(qiáng)度[24]等，導(dǎo)致精油合成及檸檬醛積累受到間接影響。

本研究將葉片精油得率高于1.35%和檸檬醛相對(duì)含量高于47.62%的樣株確定為初選優(yōu)株，共選出14株初選優(yōu)株；在此基礎(chǔ)上，根據(jù)選優(yōu)指標(biāo)(λ)大于121.01進(jìn)行二次篩選，最終選出8株優(yōu)良單株，包括1株一級(jí)優(yōu)良單株、1株三級(jí)優(yōu)良單株和6株四級(jí)優(yōu)良單株，其中，一級(jí)優(yōu)良單株的精油得率為3.64%，檸檬醛相對(duì)含量為51.12%。篩選的8株優(yōu)良單株包括2株香樟和6株黃樟，各占相應(yīng)種類樣株數(shù)的三分之一。就目前的提取工藝而言，香樟和黃樟是檸檬醛型樟組植物優(yōu)良單株篩選的理想種類。猴樟中編號(hào)NM-36和NM-42的樣株檸檬醛相對(duì)含量分別高達(dá)77.00%和77.13%，明顯高于其余樣株，但二者的葉片精油得率均低于葉片精油得率的均值，不滿足初選優(yōu)株葉片精油得率和檸檬醛相對(duì)含量均高于均值的標(biāo)準(zhǔn)，因此，這2株樣株未能入選初選優(yōu)株。

為了排除外界環(huán)境因子的影響，建議在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將精油得率及檸檬醛相對(duì)含量在一至三級(jí)的樣株在相同立地條件下進(jìn)行比較分析。