張 雪，宋 倫，付 杰，王 昆，劉 印，劉蘇萱

( 1.遼寧省自然資源事務(wù)服務(wù)中心，遼寧 沈陽 110001； 2.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧 大連 116023； 3.大連海洋大學(xué)，遼寧 大連 116023 )

黃海北部海域是菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)、蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)、長牡蠣(Crassostreagigas)等濾食性貝類主要增養(yǎng)殖區(qū)，近些年增養(yǎng)殖貝類普遍出現(xiàn)滯長、肥滿度下降、死亡率升高等現(xiàn)象，嚴(yán)重制約海洋漁業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1-2]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，濾食性貝類對餌料微藻具有選擇性策略，大粒級微藻更利于濾食性貝類的營養(yǎng)儲備和健康生長[3-4]。然而受技術(shù)局限，微藻粒級結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展緩慢，目前常用的葉綠素a分級法由于大孔徑濾膜較高的截留率嚴(yán)重低估了小粒徑微藻的生物量[5-7]。以往研究貝類餌料生物量大多利用葉綠素a含量表征餌料微藻生物量[8-10]，可能會高估濾食性貝類的有效餌料量，進(jìn)而可能會高估貝類養(yǎng)殖容量。因此，研究濾食性貝類餌料微藻供應(yīng)能力(即供餌力)對揭示貝類營養(yǎng)能量及免疫水平至關(guān)重要。對于濾食性貝類，有效餌料微藻(大粒級藻類)的比例和總量及存在周期可反映增養(yǎng)殖區(qū)濾食性貝類的供餌力水平，筆者采用高通量測序—分子鑒定分級技術(shù)對黃海北部海域進(jìn)行餌料微藻供餌力區(qū)劃，并測算貝類養(yǎng)殖容量，以期為黃海北部海域?yàn)V食性貝類增養(yǎng)殖提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)海域與采樣站位

2019年，在黃海北部海域設(shè)置53個站位(圖1)，分別于春季(5月)、夏季(8月)、秋季(10月)采

圖1 黃海北部海域采樣站位示意Fig.1 Sampling site innorthern Yellow Sea

集真核微藻分子鑒定樣品和葉綠素a樣品。每個站位采集表層海水1 L，現(xiàn)場用0.22 μm微孔濾膜收集全部微藻，然后將濾膜轉(zhuǎn)移至1.5 mL無菌離心管中，置于-20 ℃或-80 ℃冷凍保存、運(yùn)輸，用于真核微藻分子鑒定。

1.2 分析方法

1.2.1 餌料微藻分子鑒定

餌料微藻DNA提取采用CTAB法(十六烷基三甲基溴化銨)，PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增引物利用自行開發(fā)的真核微藻18S rDNA V4區(qū)基因擴(kuò)增引物，具體參考文獻(xiàn)[2]。

1.2.2 葉綠素a含量檢測

葉綠素a樣品調(diào)查、檢測方法參照GB/T 12763—2007《海洋調(diào)查規(guī)范》[11]和GB 17378—2007《海洋監(jiān)測規(guī)范》[12]執(zhí)行。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

分子測序利用解析軟件(http:∥drive5.com/uparse/)對有效數(shù)據(jù)進(jìn)行運(yùn)算分類單元(OTUs)聚類和物種分類，采用樸素貝葉斯分類方法與數(shù)據(jù)庫(https:∥www. arb-silva.de/,Version 108)對運(yùn)算分類單元代表序列進(jìn)行物種注釋[13]。根據(jù)相關(guān)研究，不同粒徑的真核微藻序列數(shù)比例更接近于生物量比例[14-16]，將各個站位所獲得的優(yōu)勢度超過0.1%的種類均作為整體優(yōu)勢種參與粒級生物量統(tǒng)計，參考文獻(xiàn)[14-20]將篩查出的優(yōu)勢種粒徑進(jìn)行篩檢分級，即將優(yōu)勢種按粒徑大小劃分為大粒級(>10 μm)和小粒級(<10 μm)兩組，球狀藻類以直徑統(tǒng)計粒徑大小，桿狀藻類以長寬換算為球徑統(tǒng)計粒徑大小，根據(jù)各粒徑微藻序列占比統(tǒng)計其粒級結(jié)構(gòu)，同時利用序列數(shù)占比和總?cè)~綠素a含量測算某種粒級微藻的葉綠素a含量，相關(guān)公式[5]：

式中,ρBi為某粒級微藻的葉綠素a質(zhì)量濃度(μg/L)；ρi為總?cè)~綠素a質(zhì)量濃度(μg/L)；DC為某粒級微藻的序列數(shù)；NC為所有微藻的序列數(shù)。

物種生物量優(yōu)勢度(Y)表示微藻群落中某一物種質(zhì)量所占的優(yōu)勢程度[5]：

式中,nx為第x種微藻種類的運(yùn)算分類單元數(shù)，N為運(yùn)算分類單元總數(shù)，fx為第x種微藻種類在各樣品中出現(xiàn)的頻率。

由于大部分濾食性貝類對大粒級(>10 μm)餌料微藻截留效率較高[4]，根據(jù)供餌力含義，即有效餌料微藻(大粒級藻類)供應(yīng)能力，本試驗(yàn)供餌力指數(shù)(Ai)專指大粒級微藻生物量與其占比乘積：

Ai=Bi×Ci%

式中，Bi為第i站位大粒級微藻生物量，Ci%為第i站位大粒級微藻占比。

貝類養(yǎng)殖容量參照Parsons-Takahashii營養(yǎng)動態(tài)模型，根據(jù)海域初級生產(chǎn)者微藻的生產(chǎn)量和生態(tài)效率，估算各濾食性貝類的現(xiàn)存生物量[21-22]。

上述公式計算、數(shù)據(jù)分析、分布餅圖繪制均通過WPS Office、SPSS 19.0、ARGIS 10.2等軟件完成。

2 結(jié) 果

2.1 大粒級微藻優(yōu)勢種

黃海北部海域主要以小粒級(<10 μm)微藻為主，春季、夏季、秋季大粒級(>10 μm)微藻生物量占比分別為(39±10)%、(35±14)%、(38±11)%(圖2)。大粒級微藻優(yōu)勢種在各季節(jié)演替明顯，分別由不同種類占據(jù)主要生態(tài)位。但大部分微藻都是有毒甲藻，對海域貝類增養(yǎng)殖貝毒累積風(fēng)險較高。細(xì)小微胞藻(Micromonaspusilla)和金牛微球藻(Ostreococcustauri)在小粒級微藻群落中占有絕對優(yōu)勢，春季、夏季、秋季演替規(guī)律由細(xì)小微胞藻占優(yōu)勢轉(zhuǎn)為金牛微球藻控制生態(tài)位(表1)。還有部分未獲注釋的類群優(yōu)勢度也較高，如共甲藻目。

表1 春、夏、秋季各粒級生物量優(yōu)勢種Tab.1 Dominant species of biomass at various grain grades in spring, summer and autumn

圖2 大粒級微藻生物量占比Fig.2 Proportion of biomass of large microalgae

2.2 貝類供餌力區(qū)劃

黃海北部海域各站位微藻平均供餌力指數(shù)分布見圖3，將53個站位按供餌力指數(shù)高低大致平均分為3組，其中高供餌力組平均指數(shù)>0.51，中供餌力組平均指數(shù)為0.23～0.51，低供餌力組平均指數(shù)<0.23。春季供餌力最高，平均為0.86；秋季次之，平均為0.41；夏季最少，平均為0.30。其中，20號站位最高，14號站位次之。

黃海北部海域春、夏、秋季及平均供餌力區(qū)劃見圖4，春季高供餌力主要集中在莊河近岸、鴨綠江口海域，夏季高供餌力主要集中在旅順、莊河、東港近岸海域，秋季高供餌力主要集中在旅順、莊河近岸海域，總體而言旅順、莊河、鴨綠江口海域?yàn)V食性貝類供餌力相對較高，長?？h及外海相對較低。

圖3 各站位平均供餌力指數(shù)Fig.3 Average diet contribution index at each station

圖4 黃海北部海域供餌力區(qū)劃Fig.4 Diet contribution zoning map in northern Yellow Sea

2.3 貝類養(yǎng)殖容量估算

由于大部分濾食性貝類對10 μm以上餌料微藻截留效率較高[4,23]，參照Parsons-Takahashii營養(yǎng)動態(tài)模型，分別利用總?cè)~綠素a和10 μm以上粒級微藻生物量估算總貝類和菲律賓蛤仔養(yǎng)殖容量。對比結(jié)果(圖5、圖6)顯示，目前利用總?cè)~綠素a作為濾食性貝類餌料基礎(chǔ)會高估養(yǎng)殖容量，總貝類養(yǎng)殖容量高估約4倍，菲律賓蛤仔養(yǎng)殖容量平均高估2.6倍，黃海北部全海域?qū)嶋H可承載貝類容量春季為151 g/m2、夏季為51 g/m2、秋季為96 g/m2，可承載菲律賓蛤仔養(yǎng)殖容量春季為100 g/m2、夏季為34 g/m2、秋季為63 g/m2，黃海北部海域貝類養(yǎng)殖容量主要為春、秋季貢獻(xiàn)。

圖5 黃海北部海域貝類養(yǎng)殖容量估算Fig.5 Estimation of shellfish culture capacity in northern Yellow Sea 測算.利用總?cè)~綠素a估算養(yǎng)殖容量；修正.利用大粒級微藻生物量估算養(yǎng)殖容量；下同. Measure.total chl-a is used to estimate culture capacity； correction. the biomass of microalgae of large grain size is used to estimate the culture capacity； et sequentia.

圖6 黃海北部海域菲律賓蛤仔養(yǎng)殖容量估算Fig.6 Estimation of culture capacity of Manila clam R. philippinarum in northern Yellow Sea

各站位基于大粒級微藻生物量估算的總貝類和菲律賓蛤仔養(yǎng)殖容量見圖7。黃海北部貝類養(yǎng)殖容量分布基本與供餌力站位分布一致，個別站位由于透明度較低，餌料總供應(yīng)量較少，導(dǎo)致貝類養(yǎng)殖容量估算較低。

3 討 論

3.1 黃海北部海域微藻粒級特點(diǎn)

濾食性貝類攝食機(jī)制有兩種：一是靠黏液纖毛作用主動篩選適口餌料，二是靠水動力作用被動吸收適口餌料。研究發(fā)現(xiàn)，貽貝等主要依靠黏液纖毛作用，扇貝主要依靠水動力作用，牡蠣兩種攝食機(jī)制同時利用；濾食性貝類的攝食效率隨著餌料粒徑的減小而降低，大部分貝類對10 μm以上餌料微藻截留效率較高，對3 μm以下餌料微藻截留效率最低[4,23]。

黃海北部海域主要增養(yǎng)殖對象為菲律賓蛤仔、蝦夷扇貝、長牡蠣等濾食性貝類，對天然餌料微藻需求量較大。2019年黃海北部海域菲律賓蛤仔產(chǎn)量7.3×105t、扇貝3.3×105t、牡蠣2.7×105t(數(shù)據(jù)來源于遼寧省2019年漁業(yè)統(tǒng)計年報)。雖然鴨綠江、大洋河等每年攜帶陸源氮磷等營養(yǎng)鹽入海，但隨著入海河流污染整治，氮、磷消減力度加大，海域無機(jī)營養(yǎng)鹽已呈下降趨勢，對微藻生物量及粒級結(jié)構(gòu)影響較大[7,24-25]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，黃海北部海域微藻群落主要以小粒級微藻(<10 μm)為主，對貝類增養(yǎng)殖業(yè)潛在影響較大[4]。2018年大長山島臨近海域小粒徑(<3 μm)真核微藻生物量組成春季為86%、夏季為52%、秋季為20%，春季優(yōu)勢種抑食金球藻生物量占41%，夏季優(yōu)勢種金牛微球藻生物量占21%，這兩種微微型藻類會嚴(yán)重影響濾食性貝類正常攝食生長，養(yǎng)殖風(fēng)險較高[25-26]。因此應(yīng)高度關(guān)注小粒級微藻對貝類增養(yǎng)殖業(yè)的不利影響，加強(qiáng)養(yǎng)殖海域供餌力研究。

圖7 基于大粒級微藻生物量估算的貝類養(yǎng)殖容量Fig.7 Estimation of shellfish culture capacity based on microalgae biomass of large grain size

3.2 黃海北部貝類餌料微藻供餌力區(qū)劃

有關(guān)貝類餌料微藻供餌力研究進(jìn)展緩慢，主要受限于微藻粒級測定技術(shù)。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，突破了微微型藻類的鑒定壁壘，然而不同真核生物中rDNA的拷貝數(shù)差異較大，因此擴(kuò)增序列數(shù)并不能表征微藻的豐度，但微藻rDNA的拷貝數(shù)可表征其生物量，解決了微藻粒級結(jié)構(gòu)研究的理論基礎(chǔ)[14-16]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，黃海北部貝類餌料供餌力和養(yǎng)殖容量主要由春、秋季貢獻(xiàn)，旅順、莊河、鴨綠江口海域相對較高，長?？h及外海相對較低。以往研究貝類養(yǎng)殖容量常用總?cè)~綠素a含量表征海區(qū)的供餌能力，但濾食性貝類對小粒級微藻利用率極低，筆者發(fā)現(xiàn)高估養(yǎng)殖容量約4倍。當(dāng)然，濾食性貝類也并不單純攝食微藻，也會被動濾食有機(jī)碎屑、鞭毛蟲、纖毛蟲等，隨著研究的深入，供餌力指數(shù)也需要進(jìn)一步優(yōu)化。餌料微藻的生物量和種類是決定濾食性貝類養(yǎng)殖容量的主要因素，筆者測算的養(yǎng)殖容量偏低，主要由于測算初級生產(chǎn)力時剔除了小粒級微藻所致，更能反映該海域養(yǎng)殖容量實(shí)際情況。

4 結(jié) 論

(1)黃海北部海域春、夏、秋季主要以小粒級(<10 μm)微藻為主，細(xì)小微胞藻和金牛微球藻在小粒級微藻群落中占有絕對優(yōu)勢，春、夏、秋季演替規(guī)律由細(xì)小微胞藻占優(yōu)勢轉(zhuǎn)為金牛微球藻控制生態(tài)位。

(2)黃海北部海域春季高供餌力主要集中在莊河近岸、鴨綠江口海域，夏季高供餌力主要集中在旅順、莊河、東港近岸海域，秋季高供餌力主要集中在旅順、莊河近岸海域，總體而言，旅順、莊河、鴨綠江口海域?yàn)V食性貝類供餌力相對較高，長?？h及外海相對較低。

(3)黃海北部全海域?qū)嶋H可承載貝類容量春季為151 g/m2、夏季為51 g/m2、秋季為96 g/m2，可承載菲律賓蛤仔養(yǎng)殖容量春季為100 g/m2、夏季為34 g/m2、秋季為63 g/m2，黃海北部貝類養(yǎng)殖容量主要為春季、秋季貢獻(xiàn)。