徐大釗 林育林 李雁②

鳥苷酸結(jié)合蛋白（guanine nucleotide-binding protein，G protein，G蛋白），是哺乳動物細(xì)胞信號通路的關(guān)鍵調(diào)控因子［1］，哺乳動物細(xì)胞絕大多數(shù)受體通過與G蛋白偶聯(lián)而將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)。G蛋白由α、β、γ 3個(gè)亞基組成異源三聚體，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴于Gα在靜止構(gòu)象（結(jié)合二磷酸鳥苷，guanosine diphosphate，GDP）與活化構(gòu)象（結(jié)合三磷酸鳥苷，guanosine triphosphate，GTP）之間的循環(huán)交替［2］。與β、γ亞基相比，α亞基具有催化和結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)胞外信號分子與G蛋白偶聯(lián)受體（G proteincoupled receptor，GPCR）結(jié)合時(shí)，后者發(fā)生構(gòu)象變化，催化Gα蛋白上GDP置換成GTP，促進(jìn)Gα活化，提高與下游效應(yīng)分子的親和力，同時(shí)減少與Gβ、Gγ的親和力［3］。Gα亞基蛋白（Gα）是G蛋白異源三聚體的結(jié)構(gòu)核心和功能核心，是G蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路的中樞。深入研究Gα基因表達(dá)與調(diào)控，對認(rèn)識該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的表達(dá)和功能機(jī)制，探索該基因突變與疾病的相關(guān)性，尋找臨床治療的新靶點(diǎn)等，均具有重要意義。本文首先簡述Gα蛋白基因表達(dá)，重點(diǎn)綜述Gα蛋白結(jié)構(gòu)和功能變異與腹膜假黏液瘤（pseudomyxoma peritonei，PMP）中的關(guān)系，以期探索腹膜假黏液瘤發(fā)病的分子病理學(xué)機(jī)制。

1 Gα基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)

1.1 GNAS基因生物學(xué)特征

Gα 基因（guanine nucleotide-binding protein alpha-subunit，GNAS）位于染色體20q13.32，又稱GNAS復(fù)合體基因位點(diǎn)（GNAS complex locus），堿基對總長度71 495 bp，包括13 個(gè)外顯子和12 個(gè)內(nèi)含子，主要編碼激動型Gα蛋白（stimulatory G protein α-subunit，Gsα）及其同源異構(gòu)體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族。

1.2 GNAS基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)

GNAS編碼Gα的啟動子位于最下游，呈雙親源性等位基因表達(dá)。外顯子1上游45 kb、35 kb和2.5 kb處有3個(gè)選擇性啟動子，對應(yīng)3個(gè)第一外顯子，分別啟動轉(zhuǎn)錄神經(jīng)內(nèi)分泌蛋白55（neuroendocrine secretory protein 55，NESP55）mRNA、超大α蛋白（extra-large alphas protein，XLαs）mRNA 和外顯子A/B mRNA，其中外顯子A/B mRNA為非翻譯性mRNA；在上游啟動子調(diào)節(jié)下，這3個(gè)第一外顯子與外顯子2～13拼接產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)錄本（圖1），故這些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被稱為同源異構(gòu)體［4］。上述選擇性啟動子表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式：NESP55由母源等位基因?qū)Ｒ恍员磉_(dá)，啟動子在父源等位基因中甲基化；NESP55 下游有一個(gè)反義轉(zhuǎn)錄子（反義NESP，NESPantisense，AS），其和XLαs、外顯子A/B均由父源等位基因?qū)Ｒ恍员磉_(dá)，啟動子在母源等位基因中甲基化（圖1）。

2 Gα蛋白結(jié)構(gòu)與功能

2.1 Gα蛋白結(jié)構(gòu)

GNAS 基因編碼Gα 蛋白，由α 螺旋、β 折疊和無規(guī)卷曲按下列方式連接：β1→α1→αA→αB→αC→αD→αE→αF→β2→β3→α2→β4→α3→β5→αG→α4→β6→α5（圖2A）。包括2 個(gè)結(jié)構(gòu)域（圖2B）：1）GTP/GDP 結(jié)合域（GTP 酶結(jié)合域，GTPase domain），通過由第39～394 位氨基酸折疊成5 個(gè)α 螺旋（α1～α 5）圍繞著6 個(gè)β 折疊（β1～β6）所組成，其中6 個(gè)β 折疊中除了β2 為反向平行排列，其余β 折疊均為正向平行排列，GTP/GDP 結(jié)合域除了具有結(jié)合鳥苷酸位點(diǎn)之外，還具有結(jié)合β、γ亞基以及偶聯(lián)受體和效應(yīng)器的位點(diǎn)；2）螺旋結(jié)構(gòu)域（helical domain），由6個(gè)α螺旋（αA～αF）組成，形似“蓋子”覆蓋在GTP/GDP結(jié)合域上［5］，其功能是阻滯GDP 與非活化狀態(tài)Gα 解聚，對GDP與GTP內(nèi)在轉(zhuǎn)換效率起限速作用［2］。

Gα 蛋白包含5 個(gè)模體（圖2C）：G1（第42～55 位氨基酸），G2（第196～204 位氨基酸），G3（第219～228 位氨基酸），G4（第288～295 位氨基酸），G5（第364～369位氨基酸）。Gα有4個(gè)GTP/GDP結(jié)合域，分別位于第47～55位、第197～204位、第223～227位、第292～295位氨基酸；1個(gè)通過酰胺基結(jié)合GTP的結(jié)合位點(diǎn)，位于第366 位氨基酸。Gα 中4 個(gè)GTP/GDP結(jié)合域和1個(gè)GTP結(jié)合位點(diǎn)，分別對應(yīng)模體G1～G5，故模體是Gα的功能和結(jié)構(gòu)中心。

圖1 GNAS基因復(fù)合體同源等位基因表達(dá)模式

圖2 Gα蛋白三維空間構(gòu)象及5個(gè)模體結(jié)構(gòu)域

2.2 Gα蛋白介導(dǎo)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能

通過7次跨膜的G蛋白循環(huán)，G蛋白偶聯(lián)受體完成細(xì)胞信號傳導(dǎo)，主要過程如下：1）配體激活偶聯(lián)的受體后與Gα蛋白結(jié)合，導(dǎo)致G蛋白的構(gòu)象改變，Gα蛋白與GDP親和力下降，釋放GDP，并隨即與GTP結(jié)合；2）Gα蛋白結(jié)合GTP后，與β、γ亞基解聚，成為活化態(tài)Gα蛋白，激活下游的效應(yīng)分子，介導(dǎo)細(xì)胞信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)；3）由Gα蛋白激活的效應(yīng)分子，反過來同時(shí)激活Gα蛋白自身的GTP酶活性，后者將GTP水解成GDP，導(dǎo)致Gα蛋白與效應(yīng)分子解聚，Gα蛋白恢復(fù)至原來構(gòu)象，重新與β、γ亞基結(jié)合形成三聚體，回到靜止?fàn)顟B(tài)。活化的Gα（Gsα）蛋白通過激活下游的腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase，AC），催化三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）脫去一個(gè)焦磷酸分子而生成第二信使環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP），介導(dǎo)cAMP/PKA細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路［6］。

2.3 Gα蛋白介導(dǎo)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子生物學(xué)機(jī)制

2.3.1 Gα 蛋白介導(dǎo)cAMP-PKA 信號通路 Gα 蛋白介導(dǎo)cAMP-PKA 信號通路活化的Gα 蛋白首先激活A(yù)C，產(chǎn)生第二信使cAMP，并能調(diào)節(jié)cAMP 表達(dá)水平，后者激活cAMP 依賴的蛋白激酶A（protein kinase A，PKA），PKA 再激活cAMP 效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）/轉(zhuǎn)錄激活因子（activating transcription factor，ATF）等基因調(diào)控蛋白，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，構(gòu)成完整的cAMP-PKA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（圖3）。激活的CREB/ATF分子可與胞核內(nèi)的黏蛋白基因的順式作用元件結(jié)合，調(diào)節(jié)黏蛋白分泌。研究證實(shí)PKA抑制劑［7］、異源三聚體G蛋白復(fù)合物抑制劑［8］均可抑制黏蛋白分泌。

2.3.2 Gα蛋白介導(dǎo)磷脂酰肌醇信號通路 Gα蛋白介導(dǎo)磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（圖3），主要過程如下：配體結(jié)合G蛋白偶聯(lián)受體后，導(dǎo)致后者構(gòu)象改變，活化的Gα蛋白激活下游PLC，PLC催化磷脂形成二酰甘油（diacylglycerol，DAG）和三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3），IP3會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高。研究發(fā)現(xiàn)Ca2+依賴性蛋白激酶Cε（PKC-epsilon，PKCε，）可上調(diào)黏蛋白2（mucin2，MUC2）、黏蛋白5AC（mucin5AC，MUC5AC）的表達(dá)［9］；DAG則會直接激活蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），導(dǎo)致PKC磷酸化［10］，PKC可激活Raf-1，發(fā)揮與cAMP-PKA的協(xié)同作用［11］。

2.3.3 Gα 蛋白介導(dǎo)其他信號通路 與磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路和大鼠肉瘤蛋白（RAS）-絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路交叉，通過ATF/CREB、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κb）入核，調(diào)節(jié)黏蛋白基因表達(dá)，間接調(diào)節(jié)黏蛋白的分泌［11］；PI3K-Akt 信號通路激活的磷酸二酯酶4B（phosphodiesterases 4B，PDE4B）可清除cAMP，拮抗cAMP-PKA信號通路［12］。

圖3 Gα蛋白介導(dǎo)細(xì)胞信號通路模式圖

3 GNAS和Gα蛋白突變與PMP的關(guān)系

3.1 GNAS突變與PMP的關(guān)系

PMP是一種以黏蛋白持續(xù)分泌為主要病理特征的惡性腫瘤綜合征。盡管目前無PMP基因突變譜的大樣本數(shù)據(jù)，但多項(xiàng)研究表明，PMP患者中GNAS為高頻基因突變［13］，Sio等［14］研究40例PMP腫瘤組織樣本，通過高通量測序（next generation sequencing，NGS）發(fā)現(xiàn)GNAS突變率為52%；Matson等［15］研究10例PMP患者，檢測了石蠟包埋切片中236個(gè)癌相關(guān)基因，其中4例患者出現(xiàn)GNAS突變（R201H/R201C轉(zhuǎn)換）。有研究發(fā)現(xiàn)PMP中存在BRAF基因突變［16］，通過NGS測序發(fā)現(xiàn)PMP中高頻突變的仍是GNAS和KARS基因，很少有BRAF-V600E、PIK3CA和APC基因突變［17］。因此GNAS基因突變是PMP發(fā)生的重要分子機(jī)制之一［11］。

GNAS基因突變已在多種惡性腫瘤研究中得到證實(shí)［18］，尤其是來源于外分泌和內(nèi)分泌器官的黏液性腫瘤，如結(jié)直腸黏液性癌和闌尾黏液性癌，可高頻出現(xiàn)GNAS基因突變，提示該基因的致癌和致分泌作用［19］。

PMP中GNAS突變位點(diǎn)相對穩(wěn)定，通常為Chr20：57484420（堿基：C-G）和Chr20：57484421（堿基：GC）［11］。PMP 的發(fā)生、發(fā)展與諸多細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)，如PI3K、Akt［20］以及前列腺素EP4 受體（prostaglandin E2 receptor 4，EP4）/cAMP/PKA/CREB等［19］，但PKA 途徑是黏蛋白持續(xù)分泌的主要參與者，是PMP病理特征的主要因素，抑制PKA 途徑會減少大多數(shù)PMP 患者的黏蛋白產(chǎn)生［21］。典型的GNAS 突變導(dǎo)致Gα蛋白GTP酶活性降低，GTP不能水解釋放磷酸，使GTP 與Gα 蛋白持續(xù)結(jié)合，后者激活cAMP-PKACREB 信號傳導(dǎo)通路，CREB 結(jié)合MUC2 啟動子，上調(diào)MUC2 基因表達(dá)，最終導(dǎo)致黏液分泌持續(xù)亢進(jìn)，是PMP發(fā)生、發(fā)展的核心分子病理機(jī)制，該機(jī)制也提供了以cAMP/PKA 信號通路為分子靶點(diǎn)治療PMP 的理論依據(jù)［19］。

3.2 Gα蛋白變異與PMP的關(guān)系

Gα 蛋白變異與PMP 密切相關(guān)，其機(jī)制與Gα 蛋白變異后持續(xù)激活cAMP-PKA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)。PMP 中最常見 的Gα 蛋 白變異位點(diǎn)是R201H 或R201C。Gα蛋白R201變異還可見于胰腺癌、卵巢癌和乳腺黏液腺癌［22］。

GNAS 突變作為PMP 分子病理機(jī)制已得到研究證實(shí)。作為GNAS 突變后的關(guān)鍵蛋白，Gα 形態(tài)與功能將成為今后研究PMP的重要內(nèi)容，包括GNAS-Gα變異與PMP病理特征，預(yù)后生存的相關(guān)性研究。Noguchi 等［23］在18 例PMP 患者中發(fā)現(xiàn)5 例低級別PMP患者存在GNAS突變，而僅在3例高級別PMP中發(fā)現(xiàn)GNAS 突變；Alakus 等［12］也發(fā)現(xiàn)GNAS 在高級別PMP患者中的突變率較低，而在低級別PMP 存在高頻的GNAS突變。預(yù)后方面，一項(xiàng)闌尾腫瘤預(yù)后的研究［24］認(rèn)為GNAS 突變的闌尾腫瘤患者的中位生存期達(dá)到115.5 個(gè)月。但上述報(bào)道均為小樣本的回顧性研究，有待大樣本臨床數(shù)據(jù)的進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.3 PMP中Gα蛋白的突變結(jié)構(gòu)

本研究根據(jù)篩查出的GNAS基因突變后Gα蛋白的突變位點(diǎn)R201H 或R201C，利用化學(xué)分子式構(gòu)建突變前后Gα 蛋白的化學(xué)基團(tuán)。根據(jù)化學(xué)基團(tuán)的化學(xué)特性和化合鍵變化來判斷Gα 蛋白突變的結(jié)構(gòu)和功能。在R201H突變中，第201位的精氨酸突變成組氨酸，組氨酸的分子結(jié)構(gòu)中具有一個(gè)苯環(huán)結(jié)構(gòu)，含有苯環(huán)的化合物具有不易氧化、碳環(huán)異常穩(wěn)定的特性。在R201C突變中，第201位的精氨酸突變成半胱氨酸，其與第200 位的半胱氨酸形成了2 個(gè)毗鄰巰基，兩者構(gòu)成二硫鍵，具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象的功能。因此，不論是R201H 還是R201C，突變后的Gα·GTP復(fù)合體化學(xué)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，使GTP更不易被解聚。

根據(jù)Gα蛋白一級結(jié)構(gòu)（UniProtKB數(shù)據(jù)庫提供）及篩查出的Gα蛋白突變位點(diǎn)R201H或R201C，利用Swiss-PDB Viewer 4.1.0軟件構(gòu)建出突變前后Gα蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)來判斷突變后Gα蛋白的功能變化（圖4）。

模體1～5（G1～G5）為Gα蛋白與GTP結(jié)合的功能結(jié)構(gòu)域，該結(jié)合過程必須有Mg2+螯合參與，Mg2+是Gα酶促結(jié)合反應(yīng)的關(guān)鍵輔基，Mg2+的空間位置和濃度是該結(jié)合反應(yīng)的關(guān)鍵限速因素。正常Gα蛋白三維空間構(gòu)象中，G1～G5空間構(gòu)象為緊密異構(gòu)體，Mg2+完全包埋于G1～G5 模體組成的空間結(jié)構(gòu)中，Mg2+位置限制了Gα 蛋白與GTP的結(jié)合效率（圖4A）；而R201H構(gòu)象中G1～G5空間構(gòu)象特征為疏松異構(gòu)體，Mg2+全暴露于模體G1～G5功能結(jié)構(gòu)域表面，與H201氨基酸形成平面結(jié)構(gòu)，因此Gα蛋白與GTP結(jié)合效率增加，Mg2+能保持Gα·GTP復(fù)合體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，使GTP不易解聚，研究證實(shí)如果不存在Mg2+，則Gα 解聚GTP 效率至少會增加10 倍（圖4B）。在R201C構(gòu)象中G1～G5空間構(gòu)象特征也為疏松異構(gòu)體，Mg2+半暴露于G1～G5模體組成的空間結(jié)構(gòu)中，與C201氨基酸形成近似平面結(jié)構(gòu)，也會促進(jìn)Gα與GTP結(jié)合速率，并保持Gα·GTP復(fù)合體構(gòu)象的穩(wěn)定，使GTP不易解聚（圖4C）。

通過Gα蛋白突變前后不同的的三維構(gòu)象圖譜，Mg2+空間位置對Gα蛋白與GTP結(jié)合效率起重要作用。Mg2+的空間位置若完全包埋于G1～G5空間構(gòu)象中，Gα蛋白與GTP結(jié)合為正常速率，相應(yīng)的cAMP為正常水平；Mg2+半暴露于G1～G5空間構(gòu)象中則有限加速Gα蛋白與GTP的結(jié)合速率，cAMP水平相對升高；Mg2+完全暴露于G1～G5空間構(gòu)象中，無限加速Gα與GTP的結(jié)合速率，cAMP水平大幅升高（表1）。

圖4 Gα突變前后的三維構(gòu)象圖

表1 Gα蛋白突變前后的三維空間構(gòu)象及功能變化

4 結(jié)語

PMP 相關(guān)的Gα 蛋白結(jié)構(gòu)、功能的研究正處于探索起步階段。GNAS-Gα變異的探索有可能帶來PMP診療領(lǐng)域的新突破。明確PMP 中Gα 蛋白突變的關(guān)鍵分子特征，將有助于發(fā)展針對PMP 的治療新靶點(diǎn)［24］。目前通過NGS檢測PMP患者的高頻突變基因的技術(shù)已經(jīng)較為成熟和規(guī)范，下一步的研究重點(diǎn)將集中在GNAS突變后Gα蛋白的定性與定量研究以及Gα蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系研究。確保從GNAS 基因轉(zhuǎn)錄水平、Gα 蛋白翻譯水平以及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能方面形成完整的PMP分子病理機(jī)制的閉環(huán)研究。但PMP中細(xì)胞較少，富含大量黏液，目前缺乏從富含黏液間質(zhì)的PMP腫瘤組織中提取富集突變Gα 蛋白的關(guān)鍵技術(shù)，是在PMP 中研究Gα 蛋白變異的最大挑戰(zhàn)。