田翠翠，周 偉，胡傳明，鄧銀銀，楊立恩，許廣平**

(1.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇南通 226007；2.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)，江蘇南京 210014)

0 引言

條斑紫菜(Pyropiayezoensis)隸屬紅藻門(Rhodophycophyta)、紅藻綱(Rhodophyceae)、紅毛菜亞綱(Bangiophycidae)、紅毛菜目(Bangiales)、紅毛菜科(Bangiacesae)、紫菜屬(Pyropia)[1]，廣泛栽培于我國江蘇、山東沿海地區(qū)，年總產(chǎn)值超50億美元[2]。條斑紫菜生活史包括葉狀體和絲狀體兩個(gè)時(shí)期[3]，絲狀體時(shí)期包括營養(yǎng)藻絲(絲狀藻絲)、孢子囊枝(膨大細(xì)胞)、殼孢子形成與放散[4]，其中營養(yǎng)藻絲粉碎后可鉆入含鈣質(zhì)的基質(zhì)長成貝殼絲狀體，在栽培生產(chǎn)中屬于種苗階段[5]。營養(yǎng)藻絲在無附著基質(zhì)的人工培養(yǎng)條件下可生長發(fā)育成自由絲狀體(游離絲狀體)[6]。目前，隨著我國條斑紫菜新種質(zhì)的不斷開發(fā)和推廣，越來越多的生產(chǎn)單位采用自由絲狀體營養(yǎng)藻絲接種貝殼，用于貝殼絲狀體育苗[7]。因此，對(duì)條斑紫菜自由絲狀體進(jìn)行快速擴(kuò)繁的研究顯得至關(guān)重要。

20世紀(jì)60年代，國內(nèi)外研究學(xué)者對(duì)紫菜絲狀體的生長發(fā)育及其與培養(yǎng)環(huán)境間的關(guān)系進(jìn)行研究。例如，以條斑紫菜貝殼絲狀體為研究對(duì)象的：Iwasaki[8]認(rèn)為紫菜絲狀體的生長對(duì)光照強(qiáng)度有一定的要求；日本藻類學(xué)者黑木宗尚等[9]曾報(bào)道直射光對(duì)紫菜絲狀體有致命傷害；我國研究學(xué)者鄭寶福等[10]、任國忠等[11]分別報(bào)道光照強(qiáng)度、溫度對(duì)條斑紫菜絲狀體生長發(fā)育的影響。以條斑紫菜自由絲狀體為對(duì)象的：駱其君等[12]研究溫度、光照強(qiáng)度、鹽度和營養(yǎng)鹽對(duì)條斑紫菜自由絲狀體生長的影響；朱建一等[13]在懸浮培養(yǎng)條件下，比較光照、光照時(shí)間對(duì)條斑紫菜絲狀體生長的影響；張美如等[14]報(bào)道條斑紫菜絲狀體擴(kuò)增的最適營養(yǎng)鹽濃度；郭文竹[15]系統(tǒng)研究溫度、光照強(qiáng)度、海水比重、光暗周期對(duì)條斑紫菜絲狀藻絲生長的影響；魏家慧等[16]研究條斑紫菜營養(yǎng)藻絲和孢子囊枝階段對(duì)光照、溫度的光合適應(yīng)能力；侯和勝等[17]報(bào)道了高溫脅迫對(duì)條斑紫菜絲狀體的生長和生理影響。然而，光照強(qiáng)度對(duì)條斑紫菜自由絲狀體生理特性的研究較少，因此本研究以光照強(qiáng)度作為單一變量，研究不同光照強(qiáng)度下條斑紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲的生長和生理特性變化，以期篩選出最適宜其生長的光照強(qiáng)度，為豐富條斑紫菜自由絲狀體的快速擴(kuò)繁提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

采用江蘇省海洋水產(chǎn)研究所培育的條斑紫菜新品種“蘇通1號(hào)”自由絲狀體營養(yǎng)藻絲為供試材料。

1.2 方法

1.2.1 藻體培養(yǎng)

試驗(yàn)于光照培養(yǎng)箱(MGZ-120B-3，上海丙林電子)中進(jìn)行。稱取條斑紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲(0.3±0.01) g，分別置于5，15，30，45，60，75 μmol·m-2· s-1光照強(qiáng)度下培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)平行，用PLA-20植物光照分析儀進(jìn)行光照強(qiáng)度測定。其他培養(yǎng)條件為光周期16 L∶8 D，溫度(18±0.5)℃，鹽度26。培養(yǎng)期間每天定時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)瓶2次(10:00，16:00)，每隔5 d更換一次加富海水(PES)營養(yǎng)液[18]，并稱量藻體鮮重，培養(yǎng)時(shí)間為25 d。

1.2.2 藻體特定生長率的測定和顯微觀察

每5 d更換培養(yǎng)液時(shí)，稱量各個(gè)培養(yǎng)瓶內(nèi)條斑紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲的鮮重(Fresh Weight，F(xiàn)W)，具體方法如下：將自由絲狀體營養(yǎng)藻絲經(jīng)150目篩絹過濾后，放于濾紙上吸干水分，置于電子分析天平上稱重記錄。按以下公式計(jì)算各組樣品的特定生長率(Specific Growth Rate,SGR)：SGR(%) = 100×(lnST-lnST-5) /5，其中：ST為第T天藻體鮮重，ST-5代表前一次稱量時(shí)的藻體鮮重。

采用Nikon-Eclipse Ni光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司)對(duì)培養(yǎng)25 d后的自由絲狀體營養(yǎng)藻絲進(jìn)行形態(tài)觀察和顯微拍照。

1.2.3 葉綠素a和類胡蘿卜素含量測定

培養(yǎng)至25 d時(shí)，將條斑紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲按照1.2.2節(jié)方法稱量。稱取0.1 g藻體，暗光條件下置于甲醇(100%)溶液中研磨粉碎；避光過夜后于4℃、10 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液，用紫外可見分光光度計(jì)(UV-2450，日本島津公司)測定上清液的吸光值OD。葉綠素a和類胡蘿卜素含量測定分別參照Porra[19]和Parsons等[20]報(bào)道的方法，具體計(jì)算公式如下：

葉綠素a(μg·mL-1)=16.29×(OD665-OD750)-8.54×(OD652-OD750)，

類胡蘿卜素(μg·mL-1)=7.6×[(OD480-OD750)-8.54×(OD510-OD750)]。

1.2.4 藻膽蛋白含量測定

培養(yǎng)至25 d時(shí)，將條斑紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲按照1.2.2節(jié)方法稱量。稱取0.1 g藻體，置于8 mL 0.1 mol·L-1磷酸緩沖液(pH值為6.8)中研磨，然后放入4℃冰箱中(避光保存)，靜止24 h后于4℃、10 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液，用紫外分光光度計(jì)檢測樣品上清液在455，564，592，618，645 nm波長下的吸光值。按照Beer等[21]報(bào)道的方法計(jì)算藻紅蛋白(PE)和藻藍(lán)蛋白(PC)含量，計(jì)算公式如下：

PE (mg·g-1) =

PC (mg·g-1) =

式中：A表示吸光度，V代表抽提量，F(xiàn)W為藻體鮮重(g)。

1.2.5 最大量子效率測定

采用調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x(PAMⅡ，德國WALZ公司)測定藻體光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)最大量子效率Fv/Fm。測量方法如下：藻體于EP管中進(jìn)行30 min暗適應(yīng)后，打開測量光(約0.3 μmol·m-2· s-1)，測得樣品最小熒光值(Fo)，隨后提供0.8 s約4 000 μmol·m-2· s-1飽和脈沖光，測得最大熒光值(Fm)，依據(jù)公式獲得最大量子效率(Fv/Fm)：

Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Graph Pad Prism 7.0和Origin 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析，用One-Way ANOVA檢驗(yàn)差異顯著水平，設(shè)顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 條斑紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲的特定生長率

由圖1可知，初始培養(yǎng)5 d后，不同光照強(qiáng)度處理下條斑紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲都處于較快的生長狀態(tài)，其中75 μmol·m-2· s-1光照強(qiáng)度培養(yǎng)下的藻體SGR最大，為8.78%，但與其他試驗(yàn)組間無顯著性差異(P>0.05)。培養(yǎng)10 d后，各試驗(yàn)組藻體生長開始出現(xiàn)差異，60 μmol·m-2· s-1光照強(qiáng)度培養(yǎng)下的SGR最大，分別約為5，15 μmol·m-2· s-1組的4.18倍和12.57倍(P<0.05)。15 d后，30-75 μmol·m-2· s-1光照強(qiáng)度培養(yǎng)下的藻體SGR明顯大于5，15 μmol·m-2· s-1組(P<0.05)；而20 d后，15 μmol·m-2· s-1光照強(qiáng)度培養(yǎng)下藻體表現(xiàn)出明顯的生長優(yōu)勢(P<0.05)，5，30，45，60 μmol·m-2· s-1光照強(qiáng)度培養(yǎng)下的藻體生長減緩，75 μmol·m-2· s-1光照強(qiáng)度培養(yǎng)下藻體SGR出現(xiàn)負(fù)增長。培養(yǎng)25 d后，15 μmol·m-2· s-1光照強(qiáng)度培養(yǎng)下藻體SGR最大，生長速率明顯快于60，75 μmol·m-2· s-1組(P<0.05)。

不同字母表示同一時(shí)間內(nèi)組間差異顯著(P<0.05)

2.2 條斑紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲的生長形態(tài)變化

光照強(qiáng)度對(duì)條斑紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲的形態(tài)存在一定影響。初始培養(yǎng)的藻體呈深褐色，細(xì)胞為細(xì)長圓柱形，色素體為側(cè)生帶狀。但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，不同光照強(qiáng)度下藻體色澤、形態(tài)和色素體等細(xì)胞內(nèi)含物的分布逐漸發(fā)生變化。培養(yǎng)25 d后，5 μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度下，藻體呈深褐色，細(xì)胞內(nèi)含物較滿，色素體清晰可見，色素體大且彌散在細(xì)胞四周(圖2a)。15 μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度下，絲狀藻絲顏色暗黑色，藻絲長且粗壯，色素體飽滿，帶狀充盈分布在細(xì)胞四周，藻體處于健康生長狀態(tài)(圖2b)。30 μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度下，藻體色澤略微暗淡，色素體淺黃色且偏于一側(cè)，有些藻絲的側(cè)枝或頂端已形成膨大細(xì)胞(圖2c)。45 μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度下，藻絲顏色趨于淡黃色，細(xì)胞色素體內(nèi)容物外溢呈半中空狀，在藻絲頂端或側(cè)枝細(xì)胞已形成2-10個(gè)單條或不規(guī)則分枝的膨大細(xì)胞(圖2d)。60 μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度下，絲狀體顏色趨于黃色，色素體部分降解，顏色偏淡，營養(yǎng)藻絲頂端及側(cè)枝進(jìn)一步發(fā)育變寬，膨大細(xì)胞比例增大(圖2e)。75 μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度下，藻體色澤灰白，細(xì)胞內(nèi)含物較貧乏，色素體分解，完全呈中空狀態(tài)，且藻絲之間裹著大量硅藻(圖2f)。

2.3 條斑紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲的光合色素及藻膽蛋白含量比較

如圖3所示，不同光照強(qiáng)度下條斑紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲的葉綠素a含量存在差異，呈現(xiàn)出隨光照強(qiáng)度增加先升高再降低的趨勢，其中15 μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度培養(yǎng)下的藻體葉綠素a含量最高，為2 357.18 μg·g-1，較75 μmol·m-2·s-1組增加32.73%(P<0.05)。與葉綠素a含量的測定結(jié)果不同，類胡蘿卜素含量總體上隨光照強(qiáng)度增加而逐漸下降，當(dāng)光照強(qiáng)度增加至75 μmol·m-2·s-1時(shí)，藻體類胡蘿卜素含量最低，為696 μg·g-1，但各組間藻體類胡蘿卜素含量差異不顯著(P>0.05)。

比較不同光照強(qiáng)度條件下藻體的藻膽蛋白含量發(fā)現(xiàn)，15 μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度培養(yǎng)下的藻體藻紅蛋白含量最高，為43.74 mg·g-1；60 μmol·m-2·s-1組含量最低，為28.78 mg·g-1(圖4)。藻體的藻藍(lán)蛋白含量隨光照強(qiáng)度增強(qiáng)呈現(xiàn)先增加再降低的趨勢，藻藍(lán)蛋白含量最低的是75 μmol·m-2·s-1組，為1.58 mg·g-1，約為最高組15 μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度培養(yǎng)下的1/2 (P<0.05)。

圖2 不同光照強(qiáng)度下的條斑紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲形態(tài)

不同字母表示同一時(shí)間內(nèi)組間差異顯著(P<0.05)

不同字母表示同一時(shí)間內(nèi)組間差異顯著(P<0.05)

2.4 條斑紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲的PSⅡ最大量子效率Fv /Fm比較

如圖5所示，條斑紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲Fv/Fm隨光照強(qiáng)度增大呈現(xiàn)先升高再降低趨勢，15 μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度培養(yǎng)下的營養(yǎng)藻絲PSⅡ最大量子效率Fv/Fm最大，約為0.62，顯著高于30-75 μmol·m-2·s-1組(P<0.05)。75 μmol·m-2·s-1組Fv/Fm最小，為0.38，約為15 μmol·m-2·s-1組的0.6倍。

不同字母表示同一時(shí)間內(nèi)組間差異顯著(P<0.05)

3 討論

3.1 光照強(qiáng)度對(duì)條斑紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲生長及形態(tài)的影響

0-15 d，本試驗(yàn)中30-75 μmol·m-2· s-1組SGR大于低光照強(qiáng)度試驗(yàn)組(5-15 μmol·m-2·s-1)，表明光照強(qiáng)度越大，藻絲生長越快，這與條斑紫菜[22]、壇紫菜[23]自由絲狀體的研究結(jié)果一致。但是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，20 d后，5，15 μmol·m-2·s-1組SGR明顯大于30-60 μmol·m-2·s-1組，75 μmol·m-2·s-1組SGR出現(xiàn)負(fù)值，說明光照強(qiáng)度持續(xù)過高，過多的光照會(huì)對(duì)藻體的生長產(chǎn)生一定的抑制作用[24，25]。本文SGR與藻體形態(tài)觀察結(jié)果一致:藻體培養(yǎng)25 d后，5，15 μmol·m-2·s-1組藻絲處于正常生長狀態(tài)；30-60 μmol·m-2·s-1組藻絲色澤偏黃，色素體有所降解，膨大細(xì)胞比例增加；75 μmol·m-2·s-1組藻絲呈中空狀，表明光照強(qiáng)度升高到不利于營養(yǎng)藻絲生長的情況下，會(huì)刺激藻絲進(jìn)一步發(fā)育成膨大細(xì)胞，這與魏家慧等[16]對(duì)條斑紫菜絲狀體觀察的結(jié)果一致。張美如等[26]、薛學(xué)坤等[27]在紫菜絲狀體擴(kuò)增保種中發(fā)現(xiàn)，長時(shí)間的過強(qiáng)光照會(huì)導(dǎo)致喜光性硅藻、綠藻等雜藻污染的發(fā)生。本研究中也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果：75 μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度下藻絲團(tuán)外裹著一層硅藻，因此在條斑紫菜絲狀體長周期擴(kuò)大培養(yǎng)中應(yīng)避免長時(shí)間強(qiáng)光培養(yǎng)。綜上所述，15 μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度適合條斑紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲的生長，這與駱其君等[12]研究認(rèn)為15-60 μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度適合其生長的結(jié)果不同，其原因可能與開展的試驗(yàn)周期不同有關(guān)。

3.2 光照強(qiáng)度對(duì)條斑紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲光合色素含量的影響

葉綠素a是海藻重要的光合色素，藻膽蛋白是紅藻的捕光色素蛋白，兩者含量的高低與光合作用密切相關(guān)[28]。本研究中，條斑紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲在15 μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度下，藻體葉綠素a、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白含量均表現(xiàn)出較高的水平；當(dāng)光照強(qiáng)度為30-75 μmol·m-2·s-1時(shí)，其含量則隨光照強(qiáng)度升高而逐漸下降。類胡蘿卜素含量在75 μmol·m-2·s-1組最低，但與其他各組間差異不顯著。對(duì)壇紫菜[23]、條斑紫菜[29]、龍須菜[30]、細(xì)基江蘺[31]等海藻的研究已經(jīng)證實(shí)，低光照強(qiáng)度下有利于藻體光合色素的積累，有助于藻體對(duì)光能的捕獲和傳導(dǎo)；而當(dāng)光照強(qiáng)度過高時(shí)，光合作用單元和PSⅡ反應(yīng)中心數(shù)量會(huì)減少，藻體的光合色素含量也相應(yīng)降低。

3.3 光照強(qiáng)度對(duì)條斑紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲Fv/Fm的影響

Fv/Fm值反映PSⅡ反應(yīng)中心潛在的最大光能轉(zhuǎn)換效率，而PSⅡ在光合作用的光能吸收和轉(zhuǎn)換中起著重要的作用[32]。本研究中，藻體在15 μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度下的Fv/Fm值最大，表明該光照強(qiáng)度下藻體的潛在光合作用活性最強(qiáng)。隨著光照強(qiáng)度增加，F(xiàn)v/Fm值顯著降低，75 μmol·m-2·s-1組Fv/Fm約為15 μmol·m-2·s-1組的0.6倍，說明過高的光照強(qiáng)度可以損壞光合作用系統(tǒng)，導(dǎo)致PSⅡ的光能利用效率顯著降低。這與野生條斑紫菜[33]、“黃優(yōu)1號(hào)”條斑紫菜[16]研究結(jié)果相似。本研究中，條斑紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲的Fv/Fm值為0.38-0.62，低于壇紫菜自由絲狀體的0.66-0.74[23]，說明條斑紫菜自由絲狀體光能利用效率及通過PSⅡ的電子傳遞速率較壇紫菜低，條斑紫菜自由絲狀體更偏向低光照強(qiáng)度適應(yīng)性，這與張濤等[33]的研究結(jié)果一致。因而在調(diào)控培養(yǎng)紫菜絲狀體擴(kuò)增時(shí)，不同的紫菜物種應(yīng)采用不同的光照強(qiáng)度。本研究認(rèn)為，采用15 μmol·m-2·s-1的光照強(qiáng)度，更有利于條斑紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲的生長擴(kuò)增，達(dá)到最優(yōu)的培養(yǎng)結(jié)果。

4 結(jié)論

本研究采用單因素分析法，研究光照強(qiáng)度對(duì)條斑紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲生長及生理特性的影響，發(fā)現(xiàn)在15 μmol·m-2·s-1光照強(qiáng)度下，藻體生長較好且葉綠素a、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、Fv/Fm值含量最高。因此，建議在條斑紫菜自由絲狀體長周期擴(kuò)增培養(yǎng)中，采用15 μmol·m-2·s-1的較低光照強(qiáng)度，更有利于條斑紫菜絲狀藻絲的快速生長，達(dá)到最優(yōu)的培養(yǎng)結(jié)果。