適用于轉(zhuǎn)錄組測序的大麥胚芽鞘保衛(wèi)細(xì)胞分離方法優(yōu)化

張子軒，郭融融，次而甲瑪，王宏鵬，王俊斌，曹高燚，包曙光，謝曉東，陳小強(qiáng)

(天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津300384)

大麥(HordeumvulgareL.)是世界上第四大糧食作物，是啤酒工業(yè)的基礎(chǔ)原料和優(yōu)良的牲畜飼料，因其遺傳多樣性豐富，且具備耐旱、耐鹽堿、耐重金屬、耐缺鉀、耐缺氮等優(yōu)良品質(zhì)，是研究作物抗逆機(jī)理的理想材料[1]。

對(duì)于陸地植物來說，氣孔是植物體與大氣之間交換氣體的主要通道，也是植物體失去自身水分最主要的通道[2]。植物體表面的氣孔一般由兩個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞圍成，是一類高度分化的細(xì)胞，它們對(duì)于多種內(nèi)外刺激非常敏感，在感知到環(huán)境因子的變化后，迅速對(duì)其作出應(yīng)答，并通過調(diào)節(jié)氣孔的開度來準(zhǔn)確而靈敏的作出應(yīng)激反應(yīng)，因此，研究保衛(wèi)細(xì)胞與環(huán)境因素之間的關(guān)系是研究植物對(duì)外界環(huán)境脅迫應(yīng)答良好的模式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)[3]。保衛(wèi)細(xì)胞在逆境脅迫下，發(fā)生膨壓改變，導(dǎo)致氣孔開度變化，從而影響植物的光合作用、蒸騰作用等生物學(xué)過程[4]。分離保衛(wèi)細(xì)胞，對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組等組學(xué)水平的變化進(jìn)行分析，有利于發(fā)現(xiàn)起關(guān)鍵作用的生物學(xué)過程和起節(jié)點(diǎn)作用的信號(hào)組分。

Zeiger等[5]首次對(duì)植物保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體進(jìn)行分離，此后二段酶處理法逐漸完善[5-8]，這為分子機(jī)理的研究提供了材料基礎(chǔ)。Obulareddy等[7]研究表明，酶解時(shí)間不影響保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的純度和產(chǎn)量，但影響RNA的提取量。此后，該方法也在鴨跖草、擬南芥、蠶豆、甜菜、番茄等植物物種中獲得成功，使得保衛(wèi)細(xì)胞的研究漸趨深入[8-12]。

Hetherington等[2]通過對(duì)擬南芥、蠶豆等模式植物的研究, 已經(jīng)掌握了氣孔響應(yīng)環(huán)境變化的一些規(guī)律。但楊 洋等[13]研究表明，禾本科植物的保衛(wèi)細(xì)胞和模式植物擬南芥的保衛(wèi)細(xì)胞有許多不同之處，擬南芥的保衛(wèi)細(xì)胞是腎形的，而禾本科植物的保衛(wèi)細(xì)胞均為啞鈴形。魏 琳等[14]研究也發(fā)現(xiàn)，禾本科小麥氣孔對(duì)生理因子的應(yīng)答幅度明顯大于擬南芥，說明對(duì)于糧食安全具有重大意義的大麥、小麥、水稻、玉米等禾本科植物的啞鈴形保衛(wèi)細(xì)胞可能使氣孔調(diào)控更加精細(xì)和高效。因而，禾本科植物啞鈴形保衛(wèi)細(xì)胞的分離及表達(dá)譜的研究亟待開展起來。但禾本科植物保衛(wèi)細(xì)胞為啞鈴形，且保衛(wèi)細(xì)胞外有大小相近的副衛(wèi)細(xì)胞，表皮中還有表皮毛、硅化細(xì)胞、栓化細(xì)胞、邊刺等特化細(xì)胞，保衛(wèi)細(xì)胞不易從其他細(xì)胞中分離出來。此外，禾本科作物的角質(zhì)層較厚，不利于酶解溶液對(duì)細(xì)胞壁的解離。因此，分離禾本科啞鈴形保衛(wèi)細(xì)胞存在較大困難。其次，就組學(xué)研究而言，需要較大數(shù)量的保衛(wèi)細(xì)胞，因此對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞分離技術(shù)的要求也較高[15]。

隨著新一代高通量測序技術(shù)的發(fā)展，脅迫誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組分析已經(jīng)在一系列禾本科植物中完成，但目前轉(zhuǎn)錄組研究主要集中在整株植物、葉片和根系上[16]，由于禾本科植物保衛(wèi)細(xì)胞不易分離，導(dǎo)致RNA提取工作效率低下，質(zhì)量不高，因此，對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行研究很少。本研究以大麥幼苗胚芽鞘為研究材料，通過優(yōu)化胚芽鞘表皮條撕取方法，利用優(yōu)化的一步酶解法分離保衛(wèi)細(xì)胞，以期為進(jìn)一步提取高質(zhì)量的大麥幼苗胚芽鞘保衛(wèi)細(xì)胞RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組相關(guān)研究奠定 基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 大麥種子

供試大麥品種為Morex，由天津農(nóng)學(xué)院天津-布里斯托環(huán)境變化對(duì)農(nóng)作物影響研究中心提供。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

酶解液配方如下：

酶解基礎(chǔ)液100 mL：D-山梨醇9.838 8 g，嗎啉乙磺酸0.097 6 g，聚乙烯聚吡咯烷酮K40 0.100 0 g、牛血清白蛋白0.250 0 g，100 μL CaCl2(0.5 mmoL·L-1)、100 μL MgCl2(0.5 mmoL·L-1)、10 μL KH2PO4(10 μmoL·L-1)，DEPC處理水90 mL，pH值調(diào)控在5.4～5.8之間，使用KCL與KOH調(diào)節(jié)，配制完畢于-4 ℃保存。

酶解工作液10 mL：酶解基礎(chǔ)液8.5 mL，纖維素酶R-10 0.150 0 g，離析酶R-10 0.050 0 g；1 mL蟲草素-5′-三磷酸鈉(0.1 mg·mL-1)；500 μL放線菌素-D(0.3 mg·mL-1)；20 μL RNA抑制劑。震蕩充分溶解后外覆錫紙隔絕光源，于-20 ℃保存。

熒光素雙醋酸酯(FDA)溶液：將0.050 0 g熒光素雙醋酸酯溶于10 mL丙酮中，配制成5 mg·mL-1母液，4 ℃避光保存，工作濃度為10 μg·mL-1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大麥幼苗培養(yǎng)

挑選籽粒飽滿、大小均勻的大麥Morex種子150粒，水中浸泡10 min后瀝干，剝?nèi)ワぃ冻雠卟亢筠D(zhuǎn)移至小燒杯中，70%的乙醇消毒1 min后，用蒸餾水沖洗3次以上，備用。

將鋪有醫(yī)用紗布的發(fā)芽盒用蒸餾水潤濕，將沖洗過的大麥種子腹溝向下合理密度均勻排列后，半掩盒蓋并轉(zhuǎn)移至大麥生長室(溫度27± 1 ℃，濕度60±2%，光照強(qiáng)度3 000 lx，光周期 12 h)，澆足水，培養(yǎng)60 h，以24 h為一周期補(bǔ)水。60 h后，待全苗有80%的葉尖露出5 mm的胚芽鞘時(shí)，觀察大麥幼苗生長情況。

1.2.2 大麥胚芽鞘表皮條的獲取

在超凈工作臺(tái)中，準(zhǔn)備兩個(gè)一次性小型培養(yǎng)皿，分別裝入DEPC處理水與酶解基礎(chǔ)液。取一片DEPC 處理的無菌潔凈載玻片作為操作板。滴管吸取少量DEPC處理水于載玻片上，剪取一段符合要求的幼苗移至載玻片，刀片于“V字領(lǐng)”(圖1a)起沿愈合線(圖1b)縱切幼苗，用無菌鑷子剝離胚芽鞘內(nèi)包裹的大麥幼葉，得到兩個(gè)半圓柱體空心胚芽鞘段，用無菌刀片去掉3 mm尖端后，外側(cè)向下，使用刀背輕輕“刮壓”胚芽鞘近根端5 mm處位置，刀鋒不完全切斷葉肉層細(xì)胞后翻轉(zhuǎn)胚芽鞘至外側(cè)向上，將“刮壓”區(qū)域向尖端撕去，獲得一段胚芽鞘表皮條。之后用解剖針做穿孔處理(在表皮條上用解剖針扎數(shù)個(gè)小眼)或非穿孔處理并迅速轉(zhuǎn)移至酶解基礎(chǔ)液中。重復(fù)操作獲得足量(≥100)大麥胚芽鞘表皮條。

a：大麥胚芽鞘“V字領(lǐng)”；b：大麥胚芽鞘愈合線。

1.2.3 不同酶解溫度和酶解時(shí)間下大麥胚芽鞘保衛(wèi)細(xì)胞的分離效果測定

取25支潔凈的1.5 mL離心管，每一支加入500 μL酶解液。用解剖針小心挑起表皮條，每支離心管中裝入5片，分別在暗環(huán)境下置于20、25、30、35和40 ℃水浴鍋中，分別水浴處理1、1.25、1.5、1.75和2 h后，用DEPC處理水輕柔漂洗每一片表皮條，于透射顯微鏡下檢測酶解結(jié)果，分析最佳酶解效果。

1.2.4 穿孔處理下大麥胚芽鞘保衛(wèi)細(xì)胞的分離效果測定

將大麥胚芽鞘表皮條做穿孔(在表皮條上用解剖針扎數(shù)個(gè)小眼)和不穿孔兩種處理，比較兩種處理對(duì)大麥胚芽鞘保衛(wèi)細(xì)胞分離的影響。

1.2.5 大麥胚芽鞘保衛(wèi)細(xì)胞活性檢測

取未經(jīng)酶解的大麥胚芽鞘表皮條與酶解徹底的大麥胚芽鞘表皮條，經(jīng)FDA熒光染色劑染色后置于熒光顯微鏡下觀察，驗(yàn)證酶解法對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞活性的影響。

1.2.6 轉(zhuǎn)錄抑制劑作用下大麥胚芽鞘保衛(wèi)細(xì)胞RNA含量的測定

2 結(jié)果及分析

2.1 不同酶解時(shí)間、不同酶解溫度組合對(duì)大麥胚芽鞘保衛(wèi)細(xì)胞分離的影響

從圖2可以看出，纖維素酶與離析酶存在最適酶解溫度，溫度不足導(dǎo)致酶解不徹底(圖2a)；溫度過高則導(dǎo)致酶失活，造成酶解不徹底和保衛(wèi)細(xì)胞失活(圖2b)；工作酶也有一定的活性時(shí)間，酶解時(shí)間過短導(dǎo)致酶解不徹底(圖2c)，酶解時(shí)間過長則導(dǎo)致表皮層的蠟質(zhì)層與角質(zhì)層受損嚴(yán)重，因此，需要篩選出酶解溫度與酶解時(shí)間的最佳組合。為了確定酶解溫度與酶解時(shí)間的最佳搭配，撕取100株大麥胚芽鞘表皮條，酶解溫度分別設(shè)置為20、25、30、35和40 ℃，酶解時(shí)間分別設(shè)置為1、1.25、1.5、1.75和2 h，并兩兩組合，摸索最佳組合，最終確定酶解最佳組合為酶解溫度30 ℃、酶解時(shí)間1.5 h(圖2d)，經(jīng)過三次重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，確定該組合是可行的。

a：酶解溫度過低的酶解效果；b：酶解溫度過高的酶解效果；c：酶解時(shí)間不足的酶解效果；d：最適酶解溫度和酶解時(shí)間(水浴30 ℃，1.5 h)的酶解效果。

2.2 穿孔處理對(duì)大麥胚芽鞘保衛(wèi)細(xì)胞分離的影響

將大麥胚芽鞘表皮條做穿孔處理，使酶解液能夠滲入其中以提高酶解質(zhì)量。從圖3可以看出，在相同酶解時(shí)間(1.5 h)和酶解溫度(30 ℃)下，未經(jīng)穿孔處理的大麥胚芽鞘表皮條(圖3a)酶解不徹底，有殘留表皮細(xì)胞；而經(jīng)穿孔處理的大麥胚芽鞘表皮條(圖3b)酶解徹底，獲得的表皮條僅有保衛(wèi)細(xì)胞，比較純凈。

a:未經(jīng)穿孔處理的大麥胚芽鞘表皮條；b:經(jīng)穿孔處理的大麥胚芽鞘表皮條。

2.3 大麥胚芽鞘保衛(wèi)細(xì)胞活性檢測結(jié)果

以透射顯微鏡觀察酶解前后的胚芽鞘表皮條(圖4a和4b)為對(duì)照，用熒光顯微鏡觀察大麥胚芽鞘表皮條酶解前后的染色結(jié)果，可以看出，F(xiàn)DA染色后，胚芽鞘保衛(wèi)細(xì)胞酶解前后均發(fā)黃綠色熒光(圖4c和4d)，說明本研究酶解法對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞的活性幾乎沒有影響或影響很小，可用于后續(xù)RNA的提取以及進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組測序研究。

a：未經(jīng)酶解的胚芽鞘表皮條；b：酶解后的胚芽鞘表皮條；c：未經(jīng)酶解FDA染色的胚芽鞘表皮條；d：酶解后FDA染色的胚芽鞘表皮條。

2.4 轉(zhuǎn)錄抑制劑對(duì)大麥胚芽鞘保衛(wèi)細(xì)胞RNA含量的影響

從表1可以看出，加入蟲草素和放線菌素-D兩種轉(zhuǎn)錄抑制劑的酶解液和未加入兩種轉(zhuǎn)錄抑制劑的酶解液分別對(duì)大麥胚芽鞘麥皮條酶解后，其大麥胚芽鞘保衛(wèi)細(xì)胞所提取的RNA濃度和純度均相差不大，表明加入轉(zhuǎn)錄抑制劑后，對(duì)大麥胚芽鞘保衛(wèi)細(xì)胞的RNA含量沒有影響。

表1 轉(zhuǎn)錄抑制劑對(duì)大麥胚芽鞘保衛(wèi)細(xì)胞RNA含量的影響

3 討 論

氣孔是植物與外界進(jìn)行氣體交換的通道。保衛(wèi)細(xì)胞是植物表皮的特化細(xì)胞，外界因素通過影響保衛(wèi)細(xì)胞的膨壓，控制氣孔開放與關(guān)閉。目前，已鑒定出與氣孔信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因和氣孔發(fā)育不同階段的轉(zhuǎn)錄因子[17-18]。

隨著科技的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)已在植物抗病、抗逆和遺傳進(jìn)化過程中得到了廣泛的應(yīng)用。

保衛(wèi)細(xì)胞具有功能的異質(zhì)性，因而采用組學(xué)的技術(shù)方法能夠從整體水平上全面系統(tǒng)地解析保衛(wèi)細(xì)胞的功能機(jī)制。對(duì)禾本科植物保衛(wèi)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序及轉(zhuǎn)錄組差異性表達(dá)分析有可能填補(bǔ)禾本科植物研究領(lǐng)域的空白。但采用組學(xué)方法研究保衛(wèi)細(xì)胞功能通常需要大量高質(zhì)量的保衛(wèi)細(xì)胞，對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞分離技術(shù)的要求較高[15]。

保衛(wèi)細(xì)胞分離純化工作在雙子葉植物中已經(jīng)有大量的報(bào)道，如Fischer等[19]和Willmer等[20]對(duì)蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞的獲取技術(shù)都有比較詳細(xì)的敘述[19-20]；項(xiàng) 燕等[21]采用兩步酶解法對(duì)蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞進(jìn)行分離，優(yōu)化撕取環(huán)境使獲取表皮條的成功率大幅提升；梁 蕓等[22]在兩步酶解法的基礎(chǔ)上，采用更加廉價(jià)的纖維素酶，摸索出最佳酶解時(shí)間，成功獲得大量的擬南芥保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體。但是鑒于單子葉植物氣孔的特點(diǎn)，目前有關(guān)單子葉植物保衛(wèi)細(xì)胞分離純化的相關(guān)報(bào)道較少。因此，本研究通過優(yōu)化表皮條撕取方法和利用一步酶解優(yōu)化法分離大麥胚芽鞘保衛(wèi)細(xì)胞，為提取高質(zhì)量的大麥幼苗胚芽鞘保衛(wèi)細(xì)胞RNA，以及進(jìn)一步進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組相關(guān)研究奠定夯實(shí)的基礎(chǔ)。

大麥胚芽鞘的保衛(wèi)細(xì)胞在葉片中含量較低，考慮到發(fā)芽率和撕取大麥胚芽鞘的成功率，大麥幼苗的總需求量較高，大約在150株左右。而且相對(duì)大麥葉片來說，大麥胚芽鞘體積較小，撕取大麥胚芽鞘表皮條的操作難度更高，因此，如何快速獲得大量合格胚芽鞘表皮條成為關(guān)鍵。本研究利用優(yōu)化后的撕取法來獲得高質(zhì)量的大麥胚芽鞘表皮條，效果較好，通過“刮壓”這一物理手段人為制造出表皮條與葉肉細(xì)胞層的分界，形成便于撕取表皮條的斷層。這個(gè)改進(jìn)極大地縮短了大麥胚芽鞘表皮條的獲取速度，解決了保衛(wèi)細(xì)胞因離體時(shí)間過長導(dǎo)致活性下降甚至死亡的問題，有效保障了后續(xù)試驗(yàn)順利進(jìn)行。

與兩步酶解法比較，使用一步酶解法[23-24]縮短試驗(yàn)時(shí)長，從而提高了保衛(wèi)細(xì)胞的存活時(shí)間。本研究表明，表皮條須按一定比例和酶解液混合才能有效地分離保衛(wèi)細(xì)胞，且酶解溫度及酶解時(shí)間對(duì)分離保衛(wèi)細(xì)胞的質(zhì)量和產(chǎn)量影響最大。酶解溫度過低或酶解時(shí)間太短，細(xì)胞壁分解不充分，表皮細(xì)胞不能被徹底酶解掉，表皮細(xì)胞殘留嚴(yán)重，導(dǎo)致保衛(wèi)細(xì)胞RNA不純，不能進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)研究；酶解溫度過高或酶解時(shí)間過長則會(huì)加重對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞的損傷，導(dǎo)致保衛(wèi)細(xì)胞從表皮條上提前脫落，活力降低。本研究對(duì)工作酶的最適溫度與最適時(shí)間設(shè)置了一系列梯度組合進(jìn)行摸索，確定了酶解的最佳溫度與時(shí)間組合(水浴30 ℃、1.5 h)，保證了所獲取保衛(wèi)細(xì)胞的純度和活力。另外，本研究酶解前用解剖針對(duì)胚芽鞘表皮條進(jìn)行穿孔處理，使酶解液很好滲透進(jìn)入胚芽鞘內(nèi)部，更快速地酶解掉表皮細(xì)胞，結(jié)果證實(shí)該方法是行之有效的，效果較好。

因保衛(wèi)細(xì)胞RNA的質(zhì)量會(huì)隨保衛(wèi)細(xì)胞離體時(shí)間的增加而降解，所以在提取RNA時(shí)，保證保衛(wèi)細(xì)胞的活性是一個(gè)極其重要的環(huán)節(jié)。為了檢測利用上述改進(jìn)方法提取的保衛(wèi)細(xì)胞是否具有高活力，本研究利用FDA法對(duì)大麥保衛(wèi)細(xì)胞進(jìn)行染色鑒定。FDA是一種非極性物質(zhì)，本身無熒光，能自由地穿越細(xì)胞質(zhì)膜，在活細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)DA被細(xì)胞內(nèi)的酯酶裂解成有極性且發(fā)綠色熒光的熒光素，由于熒光素不能自由通過質(zhì)膜，因而可以在熒光顯微鏡下通過觀察細(xì)胞是否有熒光來確定細(xì)胞活性[25]。保衛(wèi)細(xì)胞經(jīng)FDA染色后，在488 nm激發(fā)光下，發(fā)黃綠色熒光表示有活力，發(fā)紅色熒光(葉綠素產(chǎn)生)表示死亡，且亮度越高則活力越強(qiáng)。本研究結(jié)果表明，本試驗(yàn)采取的一步酶解法提取的保衛(wèi)細(xì)胞發(fā)黃綠色熒光，且酶解前后亮度差別不大，說明酶解對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞的活性無影響或影響很小，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。同時(shí)，本研究將酶解液基礎(chǔ)液作為表皮條暫存液，因酶解基礎(chǔ)液中包含維持細(xì)胞滲透壓和活性的必要元素，能夠在酶解過程中提供保持其活性的液體環(huán)境，從根本上延長了表皮條保衛(wèi)細(xì)胞的活性，從而為下一步試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

蟲草素被發(fā)現(xiàn)有抑制mRNA翻譯的作用，放線菌素-D則可以抑制RNA的合成特別是mRNA的合成[26]，本研究在酶解液中加入蟲草素和放線菌素-D兩種抑制劑，并與未加入兩種抑制劑的酶解液分別處理大麥胚芽鞘表皮條，對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞RNA含量進(jìn)行比較，結(jié)果表明，兩種抑制劑對(duì)RNA的提取量沒有太大影響，因此，蟲草素與放線菌素-D可作為酶解過程中大麥胚芽鞘保衛(wèi)細(xì)胞RNA的保護(hù)劑。

4 結(jié) 論

本研究優(yōu)化了獲取大麥胚芽鞘表皮條的方法和酶解方法，從而能夠高效提取高活性的大麥胚芽鞘保衛(wèi)細(xì)胞，為進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄組測序提供很好的材料來源。通過“刮壓”人為制造出表皮條與葉肉細(xì)胞層的分界，從而便于撕取表皮條，縮短大麥胚芽鞘表皮條的獲取時(shí)間；將大麥胚芽鞘表皮條做穿孔處理，使酶解液能夠滲入其中以減少酶解時(shí)間，提高酶解質(zhì)量；確定了酶解的最佳溫度與時(shí)間組合為水浴30 ℃、1.5 h，保證了所獲取保衛(wèi)細(xì)胞的純度和生理活性。在酶解液中加入轉(zhuǎn)錄抑制劑(蟲草素與放線菌素-D)，避免酶解過程中高溫和機(jī)械傷害對(duì)細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的誘導(dǎo)，且不影響RNA含量，保證了酶解前后大麥胚芽鞘保衛(wèi)細(xì)胞RNA含量的一致性以及后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測序的嚴(yán)謹(jǐn)性。