韓 昱，張 寧，胡曉悅，肖文同，張立永，張富梅*

(1.河北北方學(xué)院實驗動物中心，河北 張家口 075000；2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北 保定 071000；3.唐山市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河北 唐山 063000；4.河北北方學(xué)院動物科技學(xué)院，河北 張家口 075000)

【研究意義】兔產(chǎn)業(yè)是畜牧業(yè)的重要組成部分，但在養(yǎng)殖過程中，母兔泌乳能力差嚴(yán)重制約了養(yǎng)兔業(yè)的發(fā)展，而乳房炎是導(dǎo)致母兔泌乳能力下降的主要疾病。隨著無抗養(yǎng)殖的實施和人民生活水平的不斷提升，養(yǎng)兔業(yè)面臨綠色、健康等新的挑戰(zhàn)。因此，探討中草藥防治乳房炎是促進(jìn)兔業(yè)生態(tài)健康發(fā)展的重要措施?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】母兔乳房炎是母兔泌乳期最主要的疾病。肖文淵等[1]調(diào)查統(tǒng)計了西昌市的大量繁殖母兔，發(fā)現(xiàn)母兔淘汰率較高，有12.29 %的母兔患有乳房炎，仔兔斷奶后成活率較低。在防治乳房炎的用藥上，傳統(tǒng)方法是使用抗生素。而濫用抗生素會致使細(xì)菌耐藥性及藥物殘留的產(chǎn)生，耐藥菌株和殘留的抗生素通過食物鏈轉(zhuǎn)移給人類，對人類的健康造成危害。中草藥具有無抗藥性、無殘留、加工簡便，成本低廉等特點，而且在抗炎，增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面具有重要作用[2-3]。到目前為止，關(guān)于中草藥防治兔乳房炎及其機(jī)制的研究鮮見報道，尚未引起業(yè)界足夠重視?！颈狙芯壳腥朦c】本研究利用前期篩選確定的具有疏肝解郁、疏經(jīng)通絡(luò)、活血下乳、清熱解毒、活血散瘀的復(fù)方中草藥[4]，進(jìn)一步研究其在預(yù)防母兔乳房炎中的作用，并對其作用機(jī)制進(jìn)行探討。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究結(jié)果以期為廣泛推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗用塞北兔由張家口某養(yǎng)殖場提供。母兔40只，年齡相同(12月齡左右)，胎次(2～3胎)、產(chǎn)奶量接近，窩產(chǎn)活仔數(shù)5～9只；健康公兔6只。中草藥購自河北北方學(xué)院校醫(yī)院。復(fù)方中草藥主要成分為黨參、炒白術(shù)、柴胡、金銀花、王不留行、通草、蒲公英等。將中草藥按照組方用超微粉碎機(jī)粉碎，均勻混合于飼糧中。

1.2 試驗設(shè)計

將選擇的試驗?zāi)竿?0只隨機(jī)分為2組，即對照組和試驗組，每組20只。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組于產(chǎn)前15 d至產(chǎn)后15 d飼喂添加1.5 %復(fù)方中草藥的飼糧，其它時間飼喂基礎(chǔ)飼糧。試驗期從產(chǎn)前15 d至仔兔30 d斷奶，共45 d。在試驗期間，不改變兔原來的基礎(chǔ)飼糧配方、飼喂量、飼喂次數(shù)及時間，飼養(yǎng)環(huán)境及管理方法也不作改善和調(diào)整。按常規(guī)管理方法做好驅(qū)蟲、免疫、消毒工作。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 母兔乳房炎發(fā)病率統(tǒng)計 連續(xù)統(tǒng)計對照組和試驗組中每只母兔各4窩次母兔乳房炎的發(fā)病數(shù)及淘汰母兔數(shù)，計算乳房炎發(fā)病率和母兔淘汰率。

1.3.2 母兔血液免疫指標(biāo)的測定 于母兔產(chǎn)后4、10、20 d，分別從對照組和試驗組隨機(jī)選取10只母兔，采集血液，每次采血固定在上午8：00-10：00進(jìn)行。每只兔無菌耳靜脈采血2份，1份不用抗凝劑(2 mL)，制備血清，分裝于1.5 mL離心管中，-80 ℃保存，用于血清中免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)含量的測定；另外1份用肝素鈉作為抗凝劑(2 mL)，用于分離淋巴細(xì)胞，測定T淋巴細(xì)胞百分率。①母兔血清中IgG、IgM、IL-2和IL-6含量的測定。血清樣品送河北博海生物工程開發(fā)有限公司，IgG、IgM、IL-2和IL-6含量均采用生物素雙抗體夾心ELISA方法進(jìn)行測定。②T淋巴細(xì)胞百分率的測定。應(yīng)用α-醋酸萘酯酶法(ANAE法)測定母兔血液中T淋巴細(xì)胞數(shù)，計算T淋巴細(xì)胞百分率。

1.3.3 母兔初乳IgG含量測定 從對照組和試驗組分別隨機(jī)選擇10只母兔，于分娩后24～48 h采集初乳，分置于1.5 mL離心管中，-80 ℃保存。樣品送北京華英生物技術(shù)研究所，測定初乳中IgG含量(比色法)。

1.3.4 仔兔血清IgG及血清蛋白含量的測定 分別于產(chǎn)后5～6 d隨機(jī)從每組選擇10只母兔，在每只母兔所產(chǎn)仔兔中選擇接近平均體重的仔兔，無菌采集仔兔血液，制備血清，分裝于1.5 mL離心管中，-80 ℃保存。樣品送北京華英生物技術(shù)研究所，采用比色法測定血清IgG以及總蛋白(TP)和白蛋白(ALB)含量，并計算血清球蛋白(GLB)含量。

GLB含量=TP含量-ALB含量

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計

分析采用 SPSS19.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方中草藥對母兔乳房炎發(fā)病率的影響

由表1顯示，在繁殖窩次相同的條件下，對照組乳房炎發(fā)病率為12.5 %，母兔淘汰率為15 %。飼喂復(fù)方中草藥后，試驗組發(fā)病率降低到3.75 %，較對照組降低了8.75 %，母兔淘汰率降低到5 %，降低了10 %。說明本試驗所用復(fù)方中草藥可以明顯降低母兔乳房炎發(fā)病率，減少淘汰率。

表1 乳房炎發(fā)病率和母兔淘汰率統(tǒng)計Table 1 Statistics on incidence of mastitis and elimination rate of female rabbits

2.2 復(fù)方中草藥對母兔血液免疫指標(biāo)的影響

2.2.1 復(fù)方中草藥對母兔血清中IgG、IgM及細(xì)胞因子IL-2和IL-6含量的影響 由表2表明，與對照組相比，分娩后4d試驗組血清中IgG、IL-2及IL-6含量均有一定的增加，但差異不顯著(P>0.05)，IgM含量顯著提高(P<0.05)；分娩后10 d試驗組血清中IgG含量顯著升高(P<0.05)，IgM、IL-2及IL-6含量極顯著增加(P<0.01)；分娩后20 d試驗組血清中IgG、IgM含量顯著升高(P<0.05)，IL-2含量極顯著增加(P<0.01)，IL-6含量有升高趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。由此提示，所用復(fù)方中草藥能夠有效提高母兔血清中的免疫指標(biāo)水平，對母兔的免疫機(jī)能具有顯著的增強(qiáng)作用。

表2 母兔血清中IgG、IgM、IL-2和IL-6含量測定Table 2 Results of determination of IgG,IgM,IL-2 and IL-6 in the serum of female rabbits

2.2.2 復(fù)方中草藥對母兔血液T淋巴細(xì)胞百分率的影響 由表3顯示，與對照組相比，分娩后4 和10 d，試驗組血液中T淋巴細(xì)胞百分率均呈現(xiàn)顯著增加(P<0.05)，分娩后20 d T淋巴細(xì)胞百分率具有升高趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。該項結(jié)果表明，復(fù)方中草藥能夠有效提升母兔的細(xì)胞免疫水平，進(jìn)而也可促進(jìn)機(jī)體免疫性能的提高。

表3 母兔血液T淋巴細(xì)胞百分率測定Table 3 Results of determination of blood T lymphocyte percentage in female rabbits

2.3 復(fù)方中草藥對母兔初乳IgG含量的影響

由表4顯示，試驗組母兔初乳中IgG含量較對照組顯著提高，提高了6.45個百分點(P<0.05)。由此可見，飼糧中添加復(fù)方中草藥可以顯著提高母兔初乳中IgG含量，從而對增強(qiáng)初生仔兔的被動免疫發(fā)揮了重要作用。

表4 母兔初乳IgG含量測定結(jié)果Table 4 Result of determination of IgG content in female colostrum

2.4 復(fù)方中草藥對初生仔兔血清IgG及血清蛋白含量的影響

由表5顯示，試驗組初生仔兔血清中IgG水平明顯升高，較對照組差異顯著(P<0.05)；TP、GLB含量顯著增加(P<0.05)，ALB含量也有所提高，但差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明，分娩前后母兔飼糧中添加復(fù)方中草藥可以有效提高初生仔兔免疫水平，有助于促進(jìn)其健康生長。

表5 仔兔血清IgG及血清蛋白含量的測定Table 5 Determination of serum IgG and serum protein in young rabbits

3 討 論

3.1 復(fù)方中草藥對母兔乳房炎的預(yù)防作用

傳統(tǒng)方法中，防治兔乳房炎普遍采用抗生素[5-6]。

成栓之[7]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方環(huán)丙沙星等能夠有效治療母兔乳房炎。但另有研究發(fā)現(xiàn)，在預(yù)防兔乳房炎上，磺胺嘧啶西藥配方效果不佳，可能菌株對該藥品產(chǎn)生耐藥性所致[1]?？股貫E用導(dǎo)致的藥物殘留和病原菌耐藥性增強(qiáng)等問題亟待解決。因此，在生態(tài)健康養(yǎng)殖大環(huán)境下，應(yīng)用中草藥防治兔乳房炎是發(fā)展趨勢。

目前，關(guān)于中草藥對動物乳房炎的影響研究，主要集中在牛乳房炎的防治上，并取得了較好成效。沃野千里等[8]研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用黃芪多糖替代抗生素來預(yù)防和控制奶牛乳房炎有較好的前景；凌丁等[9]對奶牛飼喂黃芪、黨參等中草藥添加劑，發(fā)現(xiàn)能夠防治奶牛隱性乳房炎，可有效降低隱性乳房炎的發(fā)病率，提高產(chǎn)奶量；另外，有學(xué)者在植物提取物對奶牛乳房炎的作用及其機(jī)制方面進(jìn)行了綜述，認(rèn)為其能夠作為部分抗生素的替代物，成為奶牛乳房炎的新型防治手段[10-11]。有關(guān)中草藥預(yù)防母兔乳房炎，我國學(xué)者也進(jìn)行了初步探索，但缺乏系統(tǒng)深入的研究。肖文淵等[1]利用蒲公英復(fù)方進(jìn)行齊卡白兔母兔乳房炎預(yù)防試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能夠有效預(yù)防乳房炎，發(fā)病率由12.82 %降為5.13 %，母兔淘汰率由15.38 %降為7.69 %。本試驗在分娩前后母兔的飼糧中添加復(fù)方中草藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，母兔乳房炎發(fā)病率降低為3.75 %，較對照組降低了8.75個百分點，母兔淘汰率試驗組僅為5 %，而對照組達(dá)到15 %。由此可見所用復(fù)方中草藥對預(yù)防母兔乳房炎具有明顯作用，這與上述肖文淵以及中草藥預(yù)防牛乳房炎的研究結(jié)論一致。同時，課題組前期試驗發(fā)現(xiàn)，該復(fù)方中草藥可以顯著提高母兔泌乳力，改善乳成分，提高斷奶仔兔成活率且促進(jìn)仔兔生長[4]，本試驗為上述結(jié)論提供了進(jìn)一步的佐證。

3.2 復(fù)方中草藥預(yù)防母兔乳房炎作用機(jī)制探討

關(guān)于中草藥預(yù)防乳房炎的作用機(jī)制，國內(nèi)學(xué)者開展了一些研究，主要集中在如何提高機(jī)體免疫性能方面[2-3]。反應(yīng)機(jī)體免疫性能的指標(biāo)除了參與非特異性免疫的吞噬細(xì)胞外，主要還有免疫球蛋白以及一些細(xì)胞因子等。免疫球蛋白Ig在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著特異性免疫作用，其中IgG可以調(diào)理、凝聚和沉淀抗原，發(fā)揮抗菌、抗病毒、抗毒素等免疫學(xué)活性，因而在機(jī)體免疫保護(hù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用；IgM在機(jī)體對感染的免疫應(yīng)答過程中較先發(fā)揮作用，具有較強(qiáng)的殺菌、溶菌、促吞噬、中和毒素和抗病毒等免疫活性[12]；T淋巴細(xì)胞作為重要的免疫細(xì)胞，若出現(xiàn)免疫缺陷或低活性，機(jī)體免疫功能會降低[13]；IL-2和IL-6均是細(xì)胞因子。IL-2具有廣泛的生物學(xué)活性，最顯著的作用是影響T淋巴細(xì)胞的生長，并可促進(jìn)活化B細(xì)胞增殖，使抗體分泌增多，故為調(diào)控免疫應(yīng)答的重要因子，IL-6能夠刺激參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞增生、分化，并提高其功能[14-15]。

目前，關(guān)于中草藥防治兔乳房炎的作用機(jī)制，尚缺乏深入的探究，限制了中草藥防治兔乳房炎的推廣應(yīng)用。本試驗在這方面開展了研究。選用的復(fù)方中草藥主要由蒲公英、金銀花、黨參、柴胡、王不留行、通草等組成。蒲公英和金銀花具有清熱解毒、活血散瘀、消除炎癥的作用。易瓊等[16]研究發(fā)現(xiàn)，治療奶牛隱性乳房炎的復(fù)方中草藥(蒲公英、金銀花、連翹等)提取液可使小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)以及外周血中性粒細(xì)胞吞噬金黃色葡萄球菌、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)較對照組顯著提高；周秀萍等[17]發(fā)現(xiàn)，服用金銀花后能顯著提高大鼠巨噬細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)，使機(jī)體的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率增加，同時強(qiáng)化Th1細(xì)胞分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ，提示金銀花對機(jī)體的免疫功能具有提升作用；黨參具有補(bǔ)中益氣、生津之功效，柴胡具有疏肝解郁、理氣瀉火的作用。近年來許多醫(yī)學(xué)研究人員發(fā)現(xiàn)運(yùn)用柴胡皂苷能夠在體液以及細(xì)胞免疫反應(yīng)中發(fā)揮巨噬細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞功能的調(diào)整，并且可以借助激活機(jī)體巨噬細(xì)胞的方式來活躍其體內(nèi)的免疫淋巴細(xì)胞功能，從而取得反應(yīng)時免疫激活的效果[18]。通草、王不留行主要具有活血通絡(luò)、消腫下乳的作用。有學(xué)者報道王不留行具有活血通經(jīng)、消腫、催乳等功效，從而減少乳房炎的發(fā)生，提高奶牛泌乳機(jī)能、產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)[19]。本試驗在母兔分娩前后15 d日糧中添加了復(fù)方中草藥，測定了分娩后母兔4、10、20 d血液中相關(guān)免疫指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所用復(fù)方中草藥可以明顯提高分娩后母兔血清中IgG、IgM以及細(xì)胞因子IL-2、IL-6的含量，使母兔血液中T淋巴細(xì)胞百分率增加，即可增強(qiáng)和調(diào)節(jié)母兔的免疫機(jī)能，表現(xiàn)出與上述文獻(xiàn)報道相一致的結(jié)論。所選用復(fù)方中草藥整體具有疏肝解郁、疏經(jīng)通絡(luò)、活血下乳、清熱解毒、活血散瘀的功效，可以提高母兔的免疫力和抗病能力，從而降低了乳房炎發(fā)生率和淘汰率，這充分顯示出所用復(fù)方中草藥能有效預(yù)防母兔乳房炎的重要機(jī)制之一就是增強(qiáng)機(jī)體抵抗力。

眾所周知，初乳對于初生動物獲得被動免疫非常重要。由于許多母畜的抗體不能通過胎盤傳遞給胎兒，所以在胎兒階段以及剛出生的幼畜血液中，一般都不含兔疫球蛋白或其含量很低，因此幼畜易感染多種病原微生物。幼畜得不到足夠的母源抗體往往是造成其患病或死亡的重要原因。IgG作為初乳中主要的免疫球蛋白，具有溶解有害菌、活化補(bǔ)體等作用，能夠?qū)μ簜鲗?dǎo)免疫力，從而提升其抗感染能力[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，對出生12 h內(nèi)犢牛飼喂初乳，其結(jié)腸中與粘膜和消化道相關(guān)的總細(xì)菌的豐度更高，病原性大腸桿菌和大腸桿菌-志賀氏菌屬減少[20]；另有報道稱，母源抗體水平是被動免疫和防止?fàn)倥８篂a的重要因素，通過初乳被動獲得的抗體能夠使?fàn)倥Ｃ馐芨篂a的侵害[21]。本試驗結(jié)果顯示，分娩前后母兔飼糧中添加復(fù)方中草藥可以明顯提高初乳中IgG含量，而且測定產(chǎn)后5～6 d仔兔血清中IgG及總蛋白和球蛋白含量顯示，均較對照組顯著提高。這說明仔兔通過初乳抗病能力得到相應(yīng)提高，這也是前期試驗中所用復(fù)方中草藥提高斷奶仔兔成活率，進(jìn)而促進(jìn)仔兔健康生長的又一個重要原因[4]。

4 結(jié) 論

分娩前后母兔飼糧中添加適量復(fù)方中草藥，可以有效降低乳房炎發(fā)病率和母兔淘汰率，其作用機(jī)制是應(yīng)用復(fù)方中草藥能顯著提高分娩后母兔免疫球蛋白IgG、IgM和細(xì)胞因子IL-2、IL-6的水平，以及T淋巴細(xì)胞百分率，進(jìn)而增強(qiáng)了母兔免疫能力，提高抗病能力；母兔飼糧中添加復(fù)方中草藥，可以顯著提高初乳中IgG含量，使仔兔免疫力和抗病力增強(qiáng)，有利于促進(jìn)仔兔健康生長。本研究為促進(jìn)所選復(fù)方中草藥的廣泛推廣應(yīng)用提供了充分的理論依據(jù)，為促進(jìn)養(yǎng)兔業(yè)生態(tài)健康發(fā)展探索出有效路徑。