付 琳，孫曉燕，任航行，李 杰，蔣 婧，王高富*

(1.重慶市畜牧科學(xué)院,重慶 榮昌 402460；2重慶市山羊工程技術(shù)研究中心,重慶 榮昌 402460)

【研究意義】膚色是一些哺乳動物(或品種)區(qū)分的標(biāo)志之一[1]，可能與生產(chǎn)性能有直接的關(guān)系[2]，因此膚色在分子水平上成了動物的一個重要的育種性狀，然而色素的表型具有高度多態(tài)性及不易于統(tǒng)計區(qū)分性，給其調(diào)控毛色的分子機(jī)制研究帶來了困難[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】ASIP(Agouti signaling protein，ASIP) 基因在哺乳動物的色素由真黑色素向棕黑色素轉(zhuǎn)變過程中起著重要的作用，是研究動物群體或個體毛發(fā)、膚色表型差異的主要候選基因之一[4]，其突變對多種哺乳動物(小鼠、人、馬、豬、牛、狗、貓、兔、兔、綿羊、山羊)毛色表型變化具有重要的影響[5-14]。ASIP基因包含多個等位基因位點(diǎn)，使動物皮膚與毛色呈現(xiàn)出廣泛的表型。研究表明，ASIPmRNA在人、豬、綿羊、山羊、牛等哺乳動物的多個組織里廣泛表達(dá)，推測在人和家畜中具有復(fù)雜且多樣性的功能[15]，除了影響哺乳動物毛發(fā)與皮膚的色素沉積性狀，ASIP基因同時可能也參與脂肪能量代謝、癌癥等活動[16-17]。同時，對毛色與疾病的相關(guān)性研究，也可為診斷和治療相關(guān)色素類疾病提供有益參考。在多種哺乳中已經(jīng)獲得了全部或者部分ASIP基因序列，山羊ASIP基因已定位于13q22[18]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】對ASIP基因調(diào)控機(jī)制充分探索可為哺乳動物品種資源的保存與利用提供有益參考[19]。酉州烏羊是我國珍貴的地方特色遺傳資源，是一種全身具烏皮表型的哺乳動物，不但具有良好的食、藥兼用性[20]，也有望作為研究皮膚黑色素沉積的良好素材，發(fā)揮更多的作用。本研究采用RACE技術(shù)擴(kuò)增酉州烏羊ASIP基因mRNA，通過預(yù)測分析其編碼蛋白的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，初步揭示酉州烏羊ASIP基因的序列結(jié)構(gòu)特征。【擬解決的關(guān)鍵問題】為ASIP基因影響酉州烏羊皮膚色素沉積的分子機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)，也為后續(xù)深入開展ASIP基因?qū)ζつw色素沉積與機(jī)體脂肪、能量代謝之間的互作機(jī)制探索提供理論參考。同時還對酉州烏羊肉質(zhì)性狀分子標(biāo)記的開發(fā)具有潛在的應(yīng)用價值，從而加快這一特色品種的選育進(jìn)程，最終提高社會、生態(tài)與經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 酉州烏羊ASIP基因RACE克隆

1.1.1 樣品采集、RNA提取、純化及反轉(zhuǎn)錄 在重慶市酉陽縣酉州烏羊資源保護(hù)場采集9只酉州烏羊的皮膚組織，迅速裝入做好標(biāo)記的采樣管中，立即投于液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80 ℃冰箱保存樣品。按TaKaRaRNAiso Plus試劑盒說明提取總RNA，NANODROP 2000超微量分光光度計測定其濃度和純度測定后，取3 μl待檢測的RNA與l μl的上樣緩沖液混勻，經(jīng)1.0 %瓊脂糖凝膠160 V，150 mA電泳12 min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察檢測結(jié)果，并進(jìn)行拍照保存，將28S和18S條帶的亮度和寬度比例均為 2∶1 的 RNA按SMARTer RACE 5′3′cDNA Amplification Kit說明書反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 RACE引物設(shè)計 以山羊ASIP基因的mRNA序列(登錄號NW_005100804)為模板，SMARTer RACE 5′3′ cDNA Synthesis Kit中10×Universal Primer A Mix (UPM)和Nested Universal Primer Short為上游引物(表1)，設(shè)計5′ RACE下游引物與3′ RACE 上游引物作為試驗(yàn)的引物(表1)。

表1 5′和3′ RACE引物Table 1 Primers for 5′ and 3′ RACE

1.1.3 RACE反應(yīng)條件和克隆測序 按照SMARTer RACE 5′3′cDNA Amplification Kit說明書進(jìn)行Outer RCR 和 Inner PCR，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，高亮的條帶進(jìn)行切膠回收。將Inner PCR產(chǎn)物通過TA克隆鏈接到pMD19-T載體上，過夜培養(yǎng)，挑取白色且形狀圓潤的單菌落至含有Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床振蕩過夜培養(yǎng)，菌液PCR鑒定重組子，陽性克隆送往上海生工生物技術(shù)公司測序。

1.2 蛋白質(zhì)序列的生物信息學(xué)分析

以NCBI數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的山羊序列為基礎(chǔ)，使用DNAStar軟件包對酉州烏羊ASIP基因序列進(jìn)行編輯；使用Editseq軟件查找開放閱讀框，確定其CDS的范圍；采用NCBI在線同源搜索工具BLAST，確定所獲序列是否為目的基因序列；利用Mega 6.0進(jìn)行多序列比對并構(gòu)建進(jìn)化樹，分析酉州烏羊與其他物種ASIP的進(jìn)化關(guān)系。酉州烏羊ASIP蛋白的理化性質(zhì)的分析采用ExPASy在線工具(http://web.expasy.org/protparam/)，信號肽預(yù)測采用SignalP5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，保守結(jié)構(gòu)域分析采用NCBI在線工具CD-Search(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。二級結(jié)構(gòu)用在線軟件SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa)預(yù)測。三級結(jié)構(gòu)利用在線同源建模SWISS-MODEL(http://www.expasy.org/swissmod/SWISSMODEL.html)進(jìn)行預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取結(jié)果

按照RNAisoPlusRNA試劑的說明提取酉州烏羊皮膚組織樣品總RNA，并用2 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。圖1中3條清晰的條帶從上到下依次為28S、18S和5S，且2S條帶亮度是18S的2倍。經(jīng)核酸蛋白測定儀檢測其純度和濃度后，總RNA的A260/A280的范圍均在1.8～2.1，符合實(shí)驗(yàn)質(zhì)量要求。

2.2 山羊ASIP mRNA序列克隆結(jié)果

OuterPCR的擴(kuò)增產(chǎn)物均無特異帶，整個電泳條帶呈現(xiàn)彌散狀，故將outerPCR產(chǎn)物稀釋后進(jìn)行InnerPCR。InnerPCR擴(kuò)增產(chǎn)物中出現(xiàn)的條帶分別切膠回收后連接至載體。經(jīng)電泳檢測，2個酉州烏羊樣品5′RACE結(jié)果顯示2種帶型，其余樣品為1種帶型，所有3′RACE結(jié)果顯示只有1種帶型(圖2)。

2.3 目的基因的鑒定

將測序結(jié)果使用BioEdit7.0軟件比對拼接后，得到一段787 bp的序列，標(biāo)為P1，包括209 bp的5′UTR區(qū)，402 bp的CDS區(qū)以及176 bp的3′UTR區(qū)，預(yù)測編碼133個氨基酸(圖3)，在編碼區(qū)存在異義替換c.496G>T，其編碼的氨基酸在第96位由谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸(p.Ala96Val)。在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST搜索比對，其與?？莆锓NASIPmRNA序列相似度達(dá)96 %以上，與山羊的相似度高達(dá)99 %以上，證明該序列確為酉州烏羊的ASIPmRNA序列。與NCBI中山羊ASIPmRNA(NW_005100804)比對顯示，P1無法與Exon1、Exon2匹配，在Exon3最末處缺失一個堿基G，與Exon4相似度為100 %，Exon5末端缺失5個堿基GAAAA。

5′RACE測序結(jié)果出現(xiàn)2條不同的序列，分別標(biāo)為P2(341 bp)和P3(497 bp)。P2片段為所有酉州烏羊共有的轉(zhuǎn)錄本，P3片段只出現(xiàn)在1個酉州烏羊樣品中。經(jīng)BLAST比對，P2片段與?？莆锓NIIIA3基因相似度達(dá)94 %，P3片段與?？莆锓NTNNI2基因相似度達(dá)96 %(圖4～5)。

2.4 物種間氨基酸序列相似性

采用在線工具Blastx對P1片段翻譯得出其編碼133個氨基酸，與NCBI中山羊ASIP(XP_017913224.1)氨基酸的相似性為99 %。采用基于遺傳距離的鄰近法對10個物種(酉州烏羊、山羊、綿羊、普通牛、水牛、駱駝、鹿、野豬、馬、人類)的ASIP氨基酸序列進(jìn)行聚類分析(圖6)。山羊最先與分類學(xué)上同屬羊亞科的綿羊聚為一類，接著與?？苿游锞蹫橐活?，然后與同是反芻動物的鹿聚成一類，再依次是駱駝、豬、馬和人類，這一結(jié)果與動物進(jìn)化規(guī)律較為一致。在第96位處氨基酸，其他物種為丙氨酸A，酉州烏羊表現(xiàn)為纈氨酸V(p.Ala96Val)，如紅色方框位置所示(圖7)。

2.5 酉州烏羊ASIP蛋白分析

2.5.1 酉州烏羊ASIP蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測 從表2可知，該蛋白質(zhì)的分子式為 C635H1055N193O182S15，原子總數(shù)為2080，蛋白分子質(zhì)量為14 786.45 Da，理論等電點(diǎn)為9.63，其氨基酸組成中，脯氨酸數(shù)量(Pro，P)最多，總數(shù)為14個，占10.5 %；亮氨酸(Leu，L)與賴氨酸(Lys，K)其次，總數(shù)均為13個，占9.8 %；谷氨酰胺(Gln，Q)、甘氨酸(Gly，G)、組氨酸(His，H)、酪氨酸(Tyr，Y)數(shù)量最少，為1個，占0.8 %?？偟膸ж?fù)電殘基(Asp + Glu)為10，總的帶正電殘基(Arg+Lys)為25。在第10、11位氨基酸處具有疏水最大值2.978，在第31位氨基酸處最具有疏水小值-3.556，總平均親水性為-0.401，不穩(wěn)定系數(shù)為54.02，預(yù)測該蛋白為親水性不穩(wěn)定蛋白(圖8)。SignalP 5.0預(yù)測其有一個22長度的信號肽，剪切部位在22～23氨基酸處。與山羊ASIP(XP_017913224.1 )相比，蛋白分子式、原子總數(shù)、蛋白分子量、平均親水性、不穩(wěn)定系數(shù)有一定差異。

表2 酉州烏羊ASIP理化性質(zhì)預(yù)測Table 2 The prediction of YZD ASIP physical and chemical properties

2.5.2 酉州烏羊ASIP蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測 蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示，酉州烏羊ASIP蛋白在16～129位為Agouti信號蛋白家族保守結(jié)構(gòu)域。Agouti結(jié)構(gòu)域是富含半胱氨酸的C末端模塊，其負(fù)責(zé)體外黑皮質(zhì)素受體的結(jié)合活性(圖8)。

2.5.3 酉州烏羊ASIP蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 從圖9可知，其中構(gòu)建α螺旋的氨基酸為42AA(31.58 %)，構(gòu)建延伸鏈的氨基酸為15AA(11.28 %)，構(gòu)建β轉(zhuǎn)角的氨基酸為7AA(5.26 %)，無規(guī)則卷曲為69AA(51.88 %)。NCBI山羊ASIP(XP_017913224.1)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的相對應(yīng)數(shù)據(jù)分別為α螺旋42AA(31.58 %)，延伸鏈7AA(5.26 %)，β轉(zhuǎn)角3AA(2.26 %)，無規(guī)則卷曲81AA(60.90 %)，與之相比，酉州烏羊ASIP二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

2.5.4 酉州烏羊ASIP蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 使用在線工具SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測三級結(jié)構(gòu)，如圖10所示，酉州烏羊ASIP第96為纈氨酸(V)，而山羊ASIP第96位為丙氨酸(A)，三級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示在其96位氨基酸的氫鍵構(gòu)成有差異，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

3 討 論

3.1 ASIP基因的結(jié)構(gòu)與功能

本試驗(yàn)采用5′與3′RACE較完整地擴(kuò)增出了酉州烏羊ASIP基因(787 bp)序列，包括209 bp的5′ UTR區(qū)，402 bp的CDS區(qū)，以及176 bp的3′ UTR區(qū)。研究表明動物皮膚組織中ASIP基因非編碼區(qū)的變異可能影響毛色的變化[21]，5′ UTR區(qū)序列的獲得為以后深入研究山羊ASIP非翻譯區(qū)的功能提供了基礎(chǔ)。生物信息學(xué)預(yù)測酉州烏羊ASIP蛋白有一個長度為22個氨基酸的信號肽，切割位點(diǎn)位于22～23氨基酸處，在16～129位為Agouti信號蛋白家族保守結(jié)構(gòu)域，與景炅婕等[22]對太行山羊的研究報道一致。ASIP蛋白可與α-MSH競爭性結(jié)合MC1R，調(diào)節(jié)真黑色素和褐黑色素生成的數(shù)量與比例，從而使動物表現(xiàn)出不同的毛色或膚色。該研究中發(fā)現(xiàn)的酉州烏羊ASIP基因編碼區(qū)異義替換c.496 G>T，預(yù)測其導(dǎo)致編碼的氨基酸由丙氨酸替換為纈氨酸(p.Ala96Val)，正位于Agouti信號蛋白家族保守結(jié)構(gòu)域上，而該結(jié)構(gòu)域是富含半胱氨酸的C末端模塊，負(fù)責(zé)MC1R的結(jié)合活性，這一異義替換還造成了酉州烏羊ASIP二級結(jié)構(gòu)域和空間構(gòu)象的差異，結(jié)合蛋白質(zhì)理化性質(zhì)比較分析，推測其可能對ASIP蛋白的功能產(chǎn)生影響。

此外，5′ RACE結(jié)果中所有酉州烏羊個體中都出現(xiàn)了1條共有序列P2，其中1只出現(xiàn)了特有的序列P3，但無法與山羊ASIPmRNA序列匹配，P2與?？莆锓NIIIA3基因相似度達(dá)94 %，P3與?？莆锓NTNNI2基因相似度達(dá)96 %以上，這2個序列可能以融合基因的形式發(fā)揮作用，這一現(xiàn)象與酉州烏羊這一特色品種的基因組異常復(fù)雜有關(guān)，因此有待于獲取酉州烏羊全基因組序列并進(jìn)一步分析，從而進(jìn)一步探索ASIP基因在山羊體內(nèi)的調(diào)控途徑。

3.2 ASIP基因的變異與山羊毛發(fā)、皮膚顏色的關(guān)系

國內(nèi)外已有報道表明ASIP是影響綿羊與山羊毛色的一個重要候選基因。綿羊ASIP基因突變對各類毛色模式的分布有重要影響[23-24]。大量山羊ASIP位點(diǎn)的等位基因被報道，但ASIP等位基因與毛色、膚色相關(guān)研究所得結(jié)果與綿羊有差異[25-26]。Tang等[27]發(fā)現(xiàn)山羊ASIP基因外顯子4的一個片段中的423G>T的顛轉(zhuǎn)替換可能是與山羊黑色皮毛表型有關(guān)，并且ASIP基因第1內(nèi)含子的T128缺失可能也在山羊毛色形成過程中發(fā)揮一定作用[21]。Henkel等[28]揭示了幾種瑞士山羊品種ASIP等位基因不同的CNV，其導(dǎo)致了ASIP在山羊皮膚上黑色素區(qū)域和棕黑色素區(qū)域之間的不同表達(dá)。Fontanesi等[25]在6個山羊品種的ASIP基因的編碼區(qū)鑒定出5個單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，與山羊的毛色沒有聯(lián)系或沒有完全聯(lián)系。Badaoui等[29]在12個西班牙和意大利山羊品種中鑒定了兩個錯義突變和兩個內(nèi)含子SNPs，其中一個錯義突變(Cys126Gly)可能通過破壞高度保守的二硫鍵引起結(jié)構(gòu)變化，然而未觀察到其與毛色有明顯聯(lián)系。Adefenwa等[30]在不同地區(qū)的6個山羊品種ASIP基因的包括部分外顯子2和部分內(nèi)含子2區(qū)域發(fā)現(xiàn)兩個突變位點(diǎn)，均與山羊被毛顏色無明顯的聯(lián)系。張?zhí)斓萚31]研究發(fā)現(xiàn)ASIP基因表達(dá)量與山羊毛色無相關(guān)性，提示其在不同毛色山羊皮膚組織中可能存在不同調(diào)控機(jī)制。綜上所述，不同山羊品種中ASIP基因?qū)γ绊懙淖饔貌⒉灰恢拢珹SIP基因編碼區(qū)的變異不能完全解釋山羊不同毛色的表型，關(guān)于ASIP對山羊毛色及膚色的影響機(jī)制仍未解析。上述研究同樣顯示了山羊皮毛顏色的遺傳復(fù)雜性，除了受遺傳因素的影響，還受環(huán)境因素的修飾。因此，需要對山羊ASIP基因啟動子序列、整個編碼區(qū)及非編碼區(qū)進(jìn)行全面的分析，并與其他調(diào)控毛色、膚色的候選基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以確認(rèn)表型的因果，及與其他基因的潛在的上位關(guān)系[32]，明確其對毛色的調(diào)控作用機(jī)制。關(guān)于本研究中酉州烏羊ASIP基因編碼區(qū)的異義替換是否影響酉州烏羊的烏色皮膚表型，還有待于擴(kuò)大種群數(shù)量、增加比較的品種種類，進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

獲得酉州烏羊皮膚組織ASIP基因mRNA全序列(787 bp)，包括209 bp的5′ UTR區(qū)，402 bp的CDS區(qū)，以及176 bp的5′ UTR區(qū)，其編碼133個氨基酸。酉州烏羊ASIP基因編碼區(qū)發(fā)生異義替換c.496G>T，其編碼的氨基酸由丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸(p.Ala96Val)，可能對酉州烏羊皮膚色素沉積性狀產(chǎn)生影響。本研究為ASIP基因影響酉州烏羊皮膚色素沉積的分子機(jī)制研究提供了理論數(shù)據(jù)。