馬倩倩，張 昱，申香群，朱沁芳，杜忠蕾，Muhammad Shoaib Tahir，周義玲，袁周陽(yáng)，劉 杰，汪曉洲，張 偉*

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001；2.青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810001；3.青海大學(xué)附屬醫(yī)院，青海 西寧 810001；4.四川大學(xué)華西醫(yī)院，四川 成都 610041)

低壓低氧對(duì)人體各系統(tǒng)有顯著的損害性影響，尤以中樞神經(jīng)系統(tǒng)為重。研究表明，Claudin-5、Occludin和ZO-1是目前公認(rèn)的緊密連接相關(guān)蛋白，這些蛋白的改變直接影響血腦屏障的結(jié)構(gòu)和功能。Tetsuhiro等人[1]在小鼠腦創(chuàng)傷的模型中發(fā)現(xiàn)，腦組織中的HIF-1α表達(dá)上調(diào)可引起AQP4的表達(dá)上調(diào)致BBB通透性的增加。本研究通過(guò)研究急性低壓低氧對(duì)大鼠腦組織的HIF-1α、AQP4和緊密連接蛋白Claudin-5、Occludin、ZO-1的表達(dá)和形態(tài)學(xué)變化，探討急性低壓低氧對(duì)大鼠血腦屏障相關(guān)連接蛋白和通透性的影響。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡健康雄性SD大鼠48只，體重200±20 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(陜)2018-001。動(dòng)物的使用和處理經(jīng)青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。大鼠飼養(yǎng)在青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房，飼養(yǎng)環(huán)境：海拔2 260 m(574mmHg，PO2120.1mmHg)，清潔級(jí)，溫度為(20±2)℃，相對(duì)濕度為(40±5)%；晝/夜交替(12：12)；自由攝取標(biāo)準(zhǔn)維持顆粒飼料(北京科澳協(xié)力飼料有限公司)和水。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和7000m低壓低氧24、48、72h組，對(duì)照組大鼠不做任何處理，其余3組大鼠放入低壓艙(模擬海拔7000m，305mmHg，PO263.7mmHg)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

Evens Blue(Sigma，貨號(hào)：E2129)，甲酰胺(Sigma，貨號(hào)：V900064)，H.E.染色試劑盒(Solarbio，貨號(hào)：G1120)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，貨號(hào)：RR047A)，TB GreenTMPremix EX TaqTMⅡ(Takara，貨號(hào)：RR820A)，Anti-beta Actin antibody(Abcam，貨號(hào)：ab115777)，Anti-Aquaporin 4 antibody(Abcam，貨號(hào)：ab46182)，Anti-Occludin antibody(Abcam，貨號(hào)：ab167161)，ZO-1 Polyclonal Antibody(Invitrogen，貨號(hào)：61-7300)，BCA蛋白測(cè)試盒(Thermo Fisher Scientific，貨號(hào)：A53225)，12-230 kDa Wes Separation Module(PorteinSimple，貨號(hào)：SM-W004)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物低壓模擬艙(西安富康空氣凈化設(shè)備工程有限公司，型號(hào)：HCPⅢ D800)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(帝肯上海貿(mào)易有限公司，型號(hào)：infinite M200 PRO)、石蠟切片機(jī)(德國(guó)萊卡儀器有限公司，型號(hào)：LEICA RM2235)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-rad，型號(hào)：CFX96)、全自動(dòng)蛋白質(zhì)表達(dá)定量分析系統(tǒng)(PorteinSimple，型號(hào)：WesTM)。

1.3 PCR 引物序列

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢大鼠(Rattus norvegicus)mRNA相應(yīng)的基因號(hào)[AQP4(NM_001142366.2)；Claudin-5(NM_001106266.1)；Occludin(NM_031329.2)；ZO-1(NM_031701.2)；HIF-1α(NM_024359.1)；actin(NM_031144.2)]，委托TAKARA公司合成，引物序列如表 1所示。

表1 PCR 引物序列

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 血腦屏障通透性測(cè)定

每組取大鼠6只，在解剖前24h于腹腔注射2% EB溶液(2mL/kg體重)。24h后麻醉，迅速取出全腦用濾紙吸凈血液，然后從中間切成兩半。稱取100 mg右側(cè)半腦，加入3 mL甲酰胺，剪碎、孵育(60℃，24h)、離心取上清液。用酶標(biāo)儀測(cè)定620 nm波長(zhǎng)處已知不同濃度EB上清液的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組大鼠腦組織中的EB含量。

1.4.2 相關(guān)基因mRNA表達(dá)量檢測(cè)

取大鼠腦組織100 mg ，按Trizol試劑說(shuō)明提取組織總RNA。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒合成cDNA。嚴(yán)格按照TB GreenTMPremix EX TaqTMⅡ試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行兩步法擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析，以管家基因actin的Ct值標(biāo)準(zhǔn)化目的基因Ct值，檢測(cè)HIF-1α、AQP4和緊密連接Claudin-5、Occludin、ZO-1 mRNA的表達(dá)量。

1.4.3 AQP4、Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

在冰上稱取腦組織約50 mg，加適當(dāng)比例RIPA蛋白裂解液用全自動(dòng)研磨儀勻漿，靜置(4℃，30min)裂解、離心(4℃，12000r/min，20min)，取上清液測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)Wes Separation Modul說(shuō)明書要求制備蛋白樣品并加樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以目的條帶灰度值/β-actin灰度值表示。

1.4.4 病理學(xué)觀察

每組取大鼠2只，麻醉，迅速解剖，完整取出大腦，立即用0.9%生理鹽水清洗、10%中性甲醛溶液固定，固定2天后，切取腦片做樣品，并繼續(xù)固定，用常規(guī)方法制片于光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.結(jié)果

2.1 腦含水量測(cè)定結(jié)果

與對(duì)照組相比，低壓低氧72h組腦含水量增加，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各處理組間大鼠腦組織含水量無(wú)顯著性差異(P>0.05)，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2 腦含水量測(cè)定結(jié)果

2.2 血腦屏障通透性測(cè)定結(jié)果

與對(duì)照組相比，低壓低氧24h組和72h組EB含量呈升高趨勢(shì)，低壓低氧48h組EB含量降低，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。其中，低壓低氧24h組EB含量顯著增加(P<0.05)，而低壓低氧72h組EB含量增加無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但低壓低氧48h組EB含量顯著下降(P<0.05)。

表3 血腦屏障通透性測(cè)定結(jié)果

2.3 相關(guān)基因mRNA的表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果

大鼠腦組織相關(guān)基因mRNA表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果如表4所示。AQP4 mRNA表達(dá)量在各組間大鼠無(wú)顯著性差異。與對(duì)照組、低壓低氧24h組、72h組相比，低壓低氧48h組Claudin-5 mRNA表達(dá)量明顯增多，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。低壓低氧48h組和72h組，與對(duì)照組、低壓低氧24h組相比，Occludin mRNA和ZO-1 mRNA的表達(dá)量明顯增多(P<0.05)。與對(duì)照組、低壓低氧24h組、48h組比較，低壓低氧72h組HIF-1α mRNA的表達(dá)量明顯增多，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 相關(guān)基因mRNA的表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果

2.4 AQP4、Occludin、ZO-1蛋白的表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組相比，低壓低氧24h組和48h組AQP4蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異，統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)意義(P>0.05)；低壓低氧72h組大鼠腦組織AQP4蛋白表達(dá)明顯上升，差異具有顯著性(P<0.05)，具體情形見(jiàn)圖1。相比于對(duì)照組、低壓低氧24h組和48h組，低壓低氧72h組Occludin蛋白表達(dá)水平明顯上升，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，具體情形見(jiàn)圖2。與對(duì)照組相比，低壓低氧48h組ZO-1蛋白表達(dá)水平明顯上升，差異具有顯著性(P<0.05)，具體情形見(jiàn)圖3。

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與7000m24h組比較，P<0.05；$：與7000m48h組比較，P<0.05

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與7000m24h組比較，P<0.05；$：與7000m48h組比較，P<0.05

*：與對(duì)照組比較，P<0.05

2.5 大鼠腦組織病理學(xué)觀察結(jié)果

對(duì)照組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元形態(tài)正常，血管外周間隙小。經(jīng)過(guò)不同缺氧條件的處理后，低壓低氧各組神經(jīng)元核深染，細(xì)胞周間隙和血管周間隙開(kāi)始增大。與對(duì)照組相比，低壓低氧24h組形態(tài)變化不明顯；低壓低氧48h組偶見(jiàn)細(xì)胞空泡化；低壓低氧72h組大鼠腦組織細(xì)胞空泡化增多、水腫明顯，膠質(zhì)細(xì)胞增生顯著，具體情形見(jiàn)圖4。

A：正常對(duì)照組，B：7000m24h組，C：7000m48h組，D：7000m72h組

3.討論

本研究結(jié)果顯示，急性低壓低氧可使腦組織HIF-1α表達(dá)呈時(shí)間依賴性升高，通過(guò)影響AQP4、Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)水平，增加低壓低氧下血腦屏障的通透性。

本研究通過(guò)對(duì)西寧地區(qū)(海拔2260m)飼養(yǎng)大鼠和經(jīng)模擬低壓艙(海拔7000m)處理的大鼠進(jìn)行研究，探討急性低壓低氧對(duì)大鼠血腦屏障通透性和緊密連接蛋白表達(dá)的影響。研究結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠較為活躍，而各低壓低氧處理組大鼠出現(xiàn)活動(dòng)度降低、進(jìn)食飲水偏少、背毛豎立、體重下降等現(xiàn)象，尤其以低壓低氧48h組最為嚴(yán)重，這種改變與發(fā)生高原反應(yīng)人群的臨床表現(xiàn)(如情緒焦躁、厭食、運(yùn)動(dòng)失調(diào))相吻合[2]。研究發(fā)現(xiàn)[3]，低氧會(huì)引起HIF介導(dǎo)的多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄翻譯改變，引起機(jī)體能量代謝失調(diào)、體液平衡紊亂和氧化應(yīng)激發(fā)生……

開(kāi)展血腦屏障通透性的相關(guān)研究，可以為多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生及發(fā)展機(jī)制和提高臨床治療效果提供理論依據(jù)[4]。濕干重法是基于完全脫水前后的腦組織重量測(cè)定的，將脫水前的重量表示為“濕重”，脫水后的重量表示為“干重”。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組間大鼠腦含水量無(wú)顯著性差異，表明急性低壓低氧暴露未引起腦組織含水量明顯變化。由于顱腔本身容積有限且顱骨彈性很小，其顱內(nèi)容積代償僅為整個(gè)顱腔容積的10%。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，濕干重法是一種較為粗略的評(píng)估方式，存在一定的實(shí)驗(yàn)誤差[5]。在正常生理?xiàng)l件下，血腦屏障(blood brain barrier，BBB)結(jié)構(gòu)的完整性保證了蛋白質(zhì)及其他的大分子物質(zhì)不能透過(guò)BBB，當(dāng)腦組織受到損傷時(shí)，由于白蛋白是血液中分子量最小的蛋白，因此可最先通過(guò)BBB，注射EB后，EB可與白蛋白結(jié)合進(jìn)入腦組織，作為檢測(cè)BBB是否被破壞的示蹤劑[6]。血腦屏障通透性測(cè)定結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，低壓低氧24h組EB含量顯著增多，表明7000m24h組大鼠腦組織已經(jīng)受損，BBB遭到破壞，導(dǎo)致通透性增強(qiáng)，蛋白質(zhì)及其他大分子物質(zhì)便可通過(guò)BBB。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Schoch等人的研究結(jié)果相吻合，他們發(fā)現(xiàn)低氧小鼠BBB通透性增加導(dǎo)致熒光素染料滲漏增多[7]。EB在腦組織中的含量增加，表明BBB細(xì)胞旁通路開(kāi)放，該“裂隙”通常被緊密連接蛋白調(diào)控。

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接是血腦屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是具有調(diào)節(jié)作用的復(fù)雜細(xì)胞系統(tǒng)。現(xiàn)有研究表明，Claudin-5、Occludin、ZO-1是目前公認(rèn)的緊密連接相關(guān)蛋白，這些蛋白的改變直接影響血腦屏障的結(jié)構(gòu)和功能。本實(shí)驗(yàn)評(píng)估了緊密連接蛋白Claudin-5、Occludin、ZO-1 mRNA的表達(dá)量以及Occludin、ZO-1蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，低壓低氧48h組Claudin-5 mRNA的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組、低壓低氧24h組和72h組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Claudin-5是血腦屏障上表達(dá)最豐富的緊密連接蛋白[8]，對(duì)小分子物質(zhì)細(xì)胞旁路通透性的調(diào)節(jié)起著重要作用。研究表明[9]，缺氧預(yù)處理可在創(chuàng)傷性腦損傷早期上調(diào)Claudin-5的表達(dá)，從而增強(qiáng)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的功能，進(jìn)而保護(hù)血腦屏障的完整性，減輕創(chuàng)傷性腦損傷內(nèi)片后腦水腫的發(fā)生。某些藥物可增加claudin-5的表達(dá)，通過(guò)增加跨內(nèi)皮阻抗(transepithelial electrical resistance，TEER)減少BBB的通透性[10]。與正常對(duì)照組和低壓低氧24h組相比，低壓低氧48h和72h組大鼠Occludin、ZO-1 mRNA的表達(dá)量明顯增多，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組、低壓低氧24h組和48h組，低壓低氧72h組大鼠腦組織Occludin的表達(dá)明顯上升。與對(duì)照組相比，低壓低氧48h組大鼠腦組織ZO-1的表達(dá)明顯上升，且差異具有顯著性。BBB的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定與緊密連接蛋白的表達(dá)、翻譯后修飾、亞細(xì)胞定位和蛋白-蛋白的交互作用有關(guān)。EK等[11]研究了新生兒缺氧缺血性腦病模型中血腦屏障和局部腦血流的變化，發(fā)現(xiàn)缺氧數(shù)小時(shí)后血腦屏障通透性增加，這種屏障的開(kāi)放與緊密連接蛋白基因表達(dá)上調(diào)有關(guān)。當(dāng)ATP缺乏時(shí)，緊密連接的胞質(zhì)附著蛋白7H6能可逆地與緊密連接蛋白分離，而細(xì)胞間的ZO仍保持連接致細(xì)胞間通透性增高[12]。在缺氧早期，緊密連接蛋白的表達(dá)和定位均無(wú)變化，隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，它們才開(kāi)始重新分布。Wachtel等[13]認(rèn)為BBB緊密連接蛋白對(duì)缺氧有一定耐受性，缺氧僅使緊密連接“門”的功能受到影響，但是其“柵欄”功能仍可保留一段時(shí)間。

水通道蛋白是一類促進(jìn)水分子和其他小分子被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的跨膜蛋白。AQP4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起主導(dǎo)性作用的水通道蛋白。動(dòng)物學(xué)研究提示[14]，缺氧后AQP4的表達(dá)具有一定的時(shí)間依賴性。星形膠質(zhì)細(xì)胞主要通過(guò)活性物的分泌、基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的合成協(xié)同作用參與BBB的維持與形成。目前認(rèn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)其足突上高表達(dá)的AQP4調(diào)控腦的水平衡[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，7000m72h組大鼠腦組織AQP4的表達(dá)明顯上升，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HIF-1α在細(xì)胞低氧應(yīng)答反應(yīng)中起核心作用，當(dāng)組織器官出現(xiàn)缺血缺氧表現(xiàn)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)普遍出現(xiàn)HIF-1的聚集，加強(qiáng)糖酵解反應(yīng)，為細(xì)胞提供能量，從而改善細(xì)胞的物質(zhì)代謝水平，緩解高原低氧對(duì)人體的影響[16]。正常條件下，HIF-1α很少表達(dá)，但在缺氧情況下其表達(dá)明顯上調(diào)。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，低壓低氧組大鼠腦組織HIF-1α mRNA表達(dá)量均呈時(shí)間依賴性升高(P<0.05)。Tetsuhiro等人[1]在小鼠腦創(chuàng)傷模型中發(fā)現(xiàn)，腦組織中HIF-1α表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而可以使AQP4以及MMP9的表達(dá)上調(diào)而致BBB通透性增加。研究表明[17]，在低氧血癥基礎(chǔ)上，高碳酸血癥可以通過(guò)調(diào)控HIF-1α-AQP4-MMP9信號(hào)通路，最終增加血腦屏障的通透性。

綜上所述，急性低壓低氧狀態(tài)下，HIF-1α表達(dá)呈時(shí)間依賴性升高，通過(guò)影響AQP4、Claudin-5、Occludin和ZO-1的表達(dá)，提高血腦屏障通透性致血腦屏障破壞。