高 攀，潘汝翀，張發(fā)斌*，胡春暉，高瑞雪，甘雪輝

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001；2.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶 404120)

目前包蟲(chóng)病的治療以外科手術(shù)切除為主，化學(xué)藥物治療為輔。世界衛(wèi)生組織推薦治療肝泡型棘球蚴病的藥物主要以苯并咪唑類為主[1]。但苯并咪唑類藥物的溶解度低[2]，且長(zhǎng)期使用會(huì)引起一系列不良反應(yīng)，如脫發(fā)、中毒性肝炎等[3-5]。因此，尋找并開(kāi)發(fā)新的低毒性、抗耐藥的抗棘球蚴藥物迫在眉睫。

砂生槐屬豆科槐族槐屬，生長(zhǎng)于青藏高原地區(qū)，可消炎解毒，主要用于治療濕熱黃疸、痢疾、赤巴病、寄生蟲(chóng)病等。我課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，從砂生槐子中提取的總生物堿不僅可以有效治療小鼠繼發(fā)性肝包蟲(chóng)病，還可提高小鼠免疫力[6，7]。本研究擬使用以砂生槐子總生物堿為模型藥物制備的砂生槐子總生物堿生物粘附片，聯(lián)合阿苯達(dá)唑治療小鼠繼發(fā)性泡球蚴病。

1.材料與方法

1.1 材料

用于多房棘球蚴保種的蒙古長(zhǎng)爪沙鼠由青海省包蟲(chóng)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。昆明雌性小鼠(Kunming mice，KM小鼠)，體重20±2 g，購(gòu)自甘肅省中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SYXK(甘)2011-0001，合格證號(hào)：62001000000133。0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液(Trypan Blue)由Coolaber公司提供；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒由Solarbio公司提供；砂生槐子總生物堿生物粘附片[8]由本課題組制備；阿苯達(dá)唑由麥克林公司提供。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立方法

動(dòng)物模型參照程時(shí)磊[9]及潘汝翀[10]的方法，在腹腔接種原頭節(jié)建立小鼠模型(40只)，3個(gè)月后隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)組小鼠對(duì)肝臟病灶進(jìn)行病理學(xué)檢驗(yàn)，判斷造模是否成功。

1.2.2 藥物治療方法

將模型組分為4組：砂生槐子總生物堿生物粘附片組、阿苯達(dá)唑組、聯(lián)合用藥組(砂生槐子總生物堿生物粘附片+阿苯達(dá)唑)、模型對(duì)照組，每組10只。每日使用特制給藥灌胃針經(jīng)口給砂生槐子總生物堿生物粘附片，其余藥物灌胃給藥，給藥劑量見(jiàn)表1，時(shí)長(zhǎng)1個(gè)月。

表1 實(shí)驗(yàn)分組與給藥劑量表

1.2.3 相關(guān)指標(biāo)測(cè)定方法

給藥1個(gè)月后麻醉、解剖小鼠，從肝臟及腹腔分離病灶包塊稱重計(jì)算囊濕重與抑囊率[(模型組囊濕重-用藥組囊濕重)/模型組囊濕重×100%]。分離脾臟稱重，計(jì)算脾臟指數(shù)。分離肝臟與病灶包塊、切片、染色(HE)。對(duì)原頭節(jié)進(jìn)行Trypan Blue染色并觀察形態(tài)，使用Image Pro Plus 6.0軟件在1024×768像素條件下對(duì)小鼠病灶包塊中的原頭節(jié)進(jìn)行直徑與面積的統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

2.結(jié)果

2.1 治療后小鼠臟器指數(shù)與抑囊率

給藥1個(gè)月后，各組脾臟指數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)，其中各治療組的脾臟指數(shù)均明顯低于模型對(duì)照組，其中聯(lián)合用藥組最低，稍高于空白組。組間比較結(jié)果顯示：與模型對(duì)照組比較，砂生槐子總生物堿生物粘附片組(P=0.017)、阿苯達(dá)唑組(P=0.008)、聯(lián)合用藥組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)，藥物治療有效。與空白對(duì)照組比較，砂生槐子總生物堿生物粘附片組(P=0.015)、阿苯達(dá)唑組(P=0.032)、模型對(duì)照組均有差異(P<0.001)，動(dòng)物造模對(duì)脾臟指數(shù)有影響。模型小鼠經(jīng)過(guò)治療后，各治療組的囊濕重有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)，模型對(duì)照組的囊濕重最大，聯(lián)合用藥組最小(圖2)。組間比較結(jié)果顯示：與模型對(duì)照組比較，砂生槐子總生物堿生物粘附片組、阿苯達(dá)唑組、聯(lián)合用藥組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)，各組的囊濕重均明顯低于模型組，藥物治療有效。三組間抑囊率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)，聯(lián)合組抑囊效果最好：聯(lián)合組(68.7%±10.5%)>砂生槐子生物緩釋粘附片組(44.1%±24.2%)>阿苯達(dá)唑組(41.3%±20.1%)。與聯(lián)合用藥組比較，砂生槐子總生物堿生物粘附片組、阿苯達(dá)唑組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001，表2)。

表2 治療后小鼠脾臟指數(shù)和囊濕重比較表

2.2 治療后小鼠肝臟病理變化

肝臟病理切片HE染色結(jié)果顯示，砂生槐子生物緩釋粘附片組可見(jiàn)肝組織結(jié)構(gòu)不清，肝索排列紊亂，中央靜脈周圍與遠(yuǎn)端的少部分細(xì)胞出現(xiàn)水腫；阿苯達(dá)唑組見(jiàn)肝組織結(jié)構(gòu)不清，中央靜脈周圍細(xì)胞出現(xiàn)水性樣變，細(xì)胞水腫伴細(xì)胞質(zhì)疏松，遠(yuǎn)端細(xì)胞水腫較輕，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肝血竇受壓變窄；聯(lián)合用藥組可見(jiàn)肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列有序，肝血竇明顯，只有中央靜脈部分細(xì)胞出現(xiàn)輕微水腫，其余細(xì)胞正常；模型對(duì)照組可見(jiàn)肝組織結(jié)構(gòu)不清，中央靜脈的遠(yuǎn)端與周圍細(xì)胞均出現(xiàn)水性樣變，肝血竇狹窄，肝細(xì)胞明顯水腫，細(xì)胞核萎縮，出現(xiàn)大量空泡，細(xì)胞質(zhì)呈網(wǎng)狀；空白對(duì)照組可見(jiàn)肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝索排列有序整齊，肝血竇明顯，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常無(wú)水性樣變與腫大(圖1)。

A：砂生槐子生物緩釋粘附片組；B：阿苯達(dá)唑組；C：聯(lián)合用藥組；D：模型對(duì)照組；E：空白對(duì)照組

2.3 治療后原頭節(jié)HE染色圖

原頭節(jié)HE染色結(jié)果顯示，砂生槐子生物緩釋粘附片組生發(fā)層變薄，其中細(xì)胞核出現(xiàn)萎縮，細(xì)胞邊界模糊，原頭蚴變小萎縮、空泡化；阿苯達(dá)唑組原頭蚴結(jié)構(gòu)殘缺，生發(fā)層明顯變??；聯(lián)合用藥組原頭蚴變形、萎縮，發(fā)育受到抑制，多見(jiàn)于被抑制小原頭蚴，生發(fā)層變薄，出現(xiàn)斷裂，部分細(xì)胞出現(xiàn)缺失。模型對(duì)照組原頭蚴形態(tài)完整，生發(fā)層結(jié)構(gòu)清楚形狀規(guī)則(圖2)。

A：砂生槐子生物緩釋粘附片組；B：阿苯達(dá)唑組；C：聯(lián)合用藥組；D：模型對(duì)照組

2.4 治療后原頭節(jié)形態(tài)變化與抑制率

將小鼠肝臟處病灶Trypan Blue染色、涂片后在顯微鏡下觀察：砂生槐子總生物堿生物粘附片組和阿苯達(dá)唑組病灶內(nèi)可見(jiàn)多數(shù)被抑制的小原頭節(jié)，偶爾可見(jiàn)正常大小原頭節(jié)，也為外翻型；聯(lián)合用藥組病灶內(nèi)基本均為被抑制的小原頭節(jié)，少見(jiàn)正常原頭節(jié)；模型對(duì)照組病灶內(nèi)大部分為正常原頭節(jié)，體型較大且形態(tài)多為凹陷型(圖3)。

A：砂生槐子生物緩釋粘附片組；B：阿苯達(dá)唑組；C：聯(lián)合用藥組；D：模型對(duì)照組

2.5 治療后原頭節(jié)直徑與面積

各組經(jīng)過(guò)治療后，原頭節(jié)直徑比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)，原頭節(jié)平均面積比較也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)；各個(gè)治療組的原頭節(jié)直徑與面積均小于模型組；各治療組與模型組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，原頭節(jié)平均直徑均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于模型組，聯(lián)合治療組平均直徑最??；原頭節(jié)面積比較：聯(lián)合組<阿苯達(dá)唑組<砂生槐子總生物堿生物粘附片組(表3)。

表3 治療組原頭節(jié)直徑和面積比較表

3.討論

長(zhǎng)期使用阿苯達(dá)唑類藥物會(huì)引起一系列不良反應(yīng)，如脫發(fā)、中毒性肝炎等[3-5]。藏藥砂生槐治療肝包蟲(chóng)病，具有毒性低，多靶點(diǎn)等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)，課題組前期研究[9，10]已證實(shí)砂生槐子總生物堿對(duì)于小鼠繼發(fā)性泡球蚴病有治療效果。

本研究發(fā)現(xiàn)造模后小鼠的脾臟指數(shù)較正常小鼠明顯升高，經(jīng)藥物治療后，給藥組脾臟指數(shù)會(huì)出現(xiàn)不同程度下降。這是由于感染細(xì)粒棘球蚴后，因小鼠自身免疫反應(yīng)加劇，導(dǎo)致脾臟代償性增大，經(jīng)藥物治療后，小鼠癥狀緩解，脾臟指數(shù)下降。其中以聯(lián)合用藥組下降最為明顯，說(shuō)明兩種藥物聯(lián)合治療對(duì)小鼠的脾臟功能恢復(fù)與改善更為有效。各給藥組的囊濕重與模型組相比下降，聯(lián)合用藥組的囊濕重下降最為明顯。肝臟切片HE染色結(jié)果顯示，感染肝泡球蚴病后，小鼠的肝臟組織受到嚴(yán)重?fù)p壞，結(jié)構(gòu)破損伴有肝細(xì)胞腫大，經(jīng)藥物治療后肝臟損壞都有所好轉(zhuǎn)。以上結(jié)果表明3個(gè)給藥組均對(duì)肝功能的恢復(fù)產(chǎn)生了積極影響，其中聯(lián)合用藥組恢復(fù)肝功能效果最為顯著。同時(shí)，觀察各實(shí)驗(yàn)組包囊內(nèi)原頭節(jié)形態(tài)，同時(shí)通過(guò)對(duì)病理結(jié)果的分析研究，判斷聯(lián)合用藥組的治療效果高于其他用藥組。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)結(jié)果表明，3組給藥組均對(duì)小鼠繼發(fā)性肝泡球蚴病的病程進(jìn)展產(chǎn)生抑制作用，效果以聯(lián)合用藥組最好。

為了深入研究各給藥組對(duì)小鼠繼發(fā)性肝泡球蚴病的療效，對(duì)各實(shí)驗(yàn)組小鼠包囊液內(nèi)的原頭節(jié)面積與直徑進(jìn)行了測(cè)量，發(fā)現(xiàn)給藥后各組小鼠包囊液內(nèi)原頭節(jié)的平均面積與平均直徑均顯著降低，且聯(lián)合用藥組的降低效果最為明顯。進(jìn)而從微觀層面進(jìn)一步證實(shí)了砂生槐子生物緩釋粘附片與阿苯達(dá)唑聯(lián)合用藥治療小鼠繼發(fā)性肝泡球蚴病療效顯著。

本研究結(jié)果顯示，砂生槐子總生物堿生物粘附片與阿苯達(dá)唑聯(lián)合用藥的治療效果好于各自單一用藥，可能原因是泡球蚴極易產(chǎn)生耐藥性[11，12]：阿苯達(dá)唑作為長(zhǎng)期以來(lái)治療包蟲(chóng)病的主要藥物，由于化學(xué)藥物靶點(diǎn)單一，更容易使泡球蚴對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，而藏藥砂生槐具有多組分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，因此兩種藥物相互協(xié)同，解決了耐藥性問(wèn)題；阿苯達(dá)唑不溶于水的物理性質(zhì)導(dǎo)致胃腸道對(duì)其吸收較差[13]，雒艷萍的研究顯示[14]，砂生槐子總生物堿中抗蟲(chóng)活性較強(qiáng)的是水溶性的苦參堿和槐果堿，推斷兩種藥物聯(lián)合用藥時(shí)，水溶性的生物堿可促進(jìn)阿苯達(dá)唑在胃腸道中的吸收，而本次研究所用的砂生槐子總生物堿生物粘附片增加了生物堿在小鼠胃腸道的滯留時(shí)間[8]，可促進(jìn)阿苯達(dá)唑的吸收。

綜上所述，砂生槐子總生物堿生物粘附片與阿苯達(dá)唑聯(lián)合用藥具有提高脾臟指數(shù)與抑囊率的效果。同時(shí)可降低包蟲(chóng)囊重、抑制囊腫增生、恢復(fù)肝功能，以此有效治療繼發(fā)性小鼠泡球蚴病。