劉 棟，段立鳴，郝 哲，張建幫，屈 俊，王麗軍，李明春

蘇氏傷痛寧軟膏（曾用名：蘇氏傷復(fù)寧軟膏）是由當(dāng)歸、黃連、三七、冰片等九味藥材加工制成的中藥非標(biāo)準(zhǔn)制劑，具有活血化瘀、消炎鎮(zhèn)痛、去腐生肌之功效，適用于灼燙傷創(chuàng)面、久治不愈性潰瘍性創(chuàng)面、蜂窩組織炎、帶狀皰疹等［1］病癥，療效確切。

該制劑已在臨床使用三十多年，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定年代久遠(yuǎn)，只有軟膏常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目，不能全面控制其質(zhì)量。 為了“提高藥品標(biāo)準(zhǔn)和藥品質(zhì)量”［2-4］，該研究采用薄層色譜法 （thin layer chromatography，TLC）定性鑒別黃連、當(dāng)歸、冰片三味藥材，并采用高效液相色譜法（high performance liquid hromatography，HPLC）測定黃連中的有效成分鹽酸小檗堿的含量，以期為制劑標(biāo)準(zhǔn)的提高提供參考。 現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 儀器與材料

LC-10A 型高效液相色譜儀（SPD-10A 紫外檢測器、手動進(jìn)樣器、LCsolutionLite 色譜工作站，日本Shimadzu 公司）；pHS-3C 型酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠）；BT125D 型十萬分之一電子分析天平 （賽多利斯有限公司）；ZF-2 型紫外儀 （上海安亭儀器廠）；電熱恒溫水浴鍋（華北實(shí)驗(yàn)儀器公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠）；層析用硅膠G 薄層板（青島海洋化工有限公司）。

對照品：鹽酸小檗堿（批號為110713-201613）、冰片（批號為111688-201603），對照藥材：黃連（批號 為120913-201310）、 當(dāng) 歸 （批 號 為120927-201315）購自中國食品藥品檢定研究院，均為檢驗(yàn)鑒定合格品； 蘇氏傷痛寧軟膏 （批號：180509、180516、180523） 和陰性樣品均為解放軍第988 醫(yī)院自制；色譜乙腈（天津四友），超純水為重蒸法自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 黃連［5］供試 品溶液：取本 品5 g，加乙醇30 ml，加熱回流1 h，在冰浴中冷卻20 min，取出，濾過，回收溶劑至干，再用2 ml 甲醇溶解，取上層溶液即得。 對照藥材溶液： 取黃連對照藥材0.5 g，加10 ml 甲醇后超聲提取30 min，放冷，過濾，取濾液即得。 對照品溶液：稱取鹽酸小檗堿對照品適量，用甲醇溶解成0.5 mg/ml 的溶液， 即得。 陰性對照溶液：取缺黃連的陰性樣品，同供試品溶液制備方法，即得。 按中國藥典四部通則0502 項(xiàng)下方法試驗(yàn)［6］，對照藥材溶液1 μl、對照品溶液1 μl、供試品溶液3 μl、陰性對照溶液3 μl 分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，展開劑為正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2），展開后晾干，在紫外燈的365 nm 波長下檢視。 結(jié)果顯示：在供試品色譜中，在與對照藥材色譜、對照品色譜相應(yīng)的位置上均有相同顏色的熒光斑點(diǎn)，并且陰性對照無干擾，見圖1。

圖1 黃連TLC 圖

2.1.2 當(dāng)歸和冰片［7］供試品溶液：取“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液即得。 對照藥材溶液：取當(dāng)歸對照藥材0.5 g，用25 ml 甲醇超聲提取30 min，放冷后過濾，濾液蒸至2 ml，取上層溶液即得。 對照品溶液：取冰片對照品適量， 用甲醇溶解成3 mg/ml 的溶液，即得。 陰性對照溶液：缺當(dāng)歸的陰性樣品、缺冰片的陰性樣品均取5 g，同供試品溶液制備方法，即得。 按中國藥典四部通則0502 項(xiàng)下方法試驗(yàn)［6］，上述五種溶液各2 μl 分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，展開劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯（9∶1），展開后晾干，先在紫外燈365 nm 波長下檢視，結(jié)果顯示：在供試品色譜中，與當(dāng)歸對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，可見相同顏色的熒光斑點(diǎn)，并且缺當(dāng)歸陰性對照無干擾；再噴顯色劑：5%香草醛硫酸-乙醇溶液（1∶4）適量，緩慢加熱至105 ℃，烘至斑點(diǎn)顯色清晰，在日光下檢視，結(jié)果顯示：在供試品色譜中，與冰片對照品色譜相應(yīng)的位置上，可見相同顏色的斑點(diǎn)，并且缺冰片陰性對照無干擾。 結(jié)果見圖2。

圖2 當(dāng)歸和冰片TLC 圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Wondasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)pH 值至3.0）（30∶70）；檢測波長349 nm；流速1.0 ml/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μl。

2.2.2 溶液的制備 （1）對照品溶液：取鹽酸小檗堿對照品，用甲醇溶解制得每1 ml 含20.34 μg 的對照品貯備液；精密吸取2 ml 至10 ml 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得4.07 μg/ml 的對照品溶液。（2）供試品溶液：取該品約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加石油醚（60~90 ℃）15 ml，微熱，振搖溶解，再加入鹽酸-90%甲醇（1∶100）混合溶液15 ml，加熱回流1 h，放冷，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，靜置分層后，分取鹽酸-90%甲醇（1∶100）溶液層。 再用鹽酸-90%甲醇（1∶100）混合溶液振搖提取2 次，15 ml/次，合并鹽酸-90%甲醇（1∶100）溶液，用石油醚（60~90 ℃）洗滌2 次，15 ml/次，分取鹽酸-90%甲醇（1∶100）溶液，回收溶劑至干，然后用甲醇將殘?jiān)芙?、轉(zhuǎn)移至10 ml 量瓶中，再用甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。 （3）陰性對照溶液：取缺黃連陰性樣品，同供試品溶液制備方法，即得。

2.2.3 專屬性試驗(yàn) 取 “2.2.2” 項(xiàng)下三種溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖。 見圖3。 由圖可知，蘇氏傷痛寧軟膏中的其他成分對鹽酸小檗堿的含量測定無干擾。

圖3 蘇氏傷痛寧軟膏HPLC 圖

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述對照品貯備液適量， 用甲醇稀釋成一定濃度的對照品溶液。 精密吸取各溶液10 μl，分別進(jìn)樣測定。 以溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的回歸方程為：A=42 670C+2 964（r=0.999 9）。 由此可知，鹽酸小檗堿在1.02~10.17 μg/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 供試品溶液制備好后分別于0、2、4、8、12、24 h 時(shí)各進(jìn)樣1 次，測定峰面積。結(jié)果樣品中鹽酸小檗堿峰面積的RSD 為1.07%，表明供試品溶液在配制24 h 內(nèi)相對穩(wěn)定。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 在上述色譜條件下，將對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6 次。結(jié)果鹽酸小檗堿6 次測定的峰面積RSD 為0.97%，表明所用儀器具有良好的精密度。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取蘇氏傷痛寧軟膏 （批號：180509）內(nèi)容物適量，精密稱取2.0 g，共6 份，按上述方法分別制備供試品溶液，然后進(jìn)樣測定并計(jì)算含量。結(jié)果樣品中鹽酸小檗堿的含量平均值為19.78 μg/g，RSD=1.01%。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱取“2.2.2”項(xiàng)下缺黃連的陰性對照樣品6 份，每份約2.0 g，分別精密加入“2.2.2”項(xiàng)下對照品貯備液2.0 ml，然后按上述方法制備供試品溶液，在上述色譜條件測定，計(jì)算回收率，見表1。

2.2.9 樣品含量測定 取蘇氏傷痛寧軟膏 （批號：180509、180516、180523）內(nèi)容物適量，精密稱定，按上述方法制備供試品溶液， 再分別吸取對照品溶液、供試品溶液各10 μl，進(jìn)樣測定，并按外標(biāo)法計(jì)算樣品中鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果見表2。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表2 樣品含量測定結(jié)果

3 討 論

3.1 定性鑒別

3.1.1 黃連的TLC 鑒別 由于黃連中生物堿含量較高，該研究選擇以鹽酸小檗堿為代表成分進(jìn)行薄層鑒別。 相對于超聲提取來說，在回流狀態(tài)下，軟膏處于液態(tài)，有利于指標(biāo)成分的提取。展開劑中加入冰醋酸，有利于改善斑點(diǎn)拖尾現(xiàn)象，也提高了分離度。3.1.2 當(dāng)歸和冰片的TLC 鑒別 兩味藥材的鑒別采用同一供試品溶液在同一薄層板、同一展開系統(tǒng)下展開、分離，然后在紫外燈下檢出當(dāng)歸；噴顯色劑后在日光下檢出冰片。 方法操作簡單，省時(shí)省力高效。

供試品溶液的制備采用乙醇回流提取，能保護(hù)環(huán)境、 維護(hù)操作者健康； 另外乙醇對基質(zhì)溶解性差，而對指標(biāo)成分提取率高，雜質(zhì)干擾少，方法重現(xiàn)性好。

3.2 含量測定

3.2.1 指標(biāo)成分的選擇 由制備工藝可知，樣品中極性小的成分含量較高，比如冰片中的龍腦、麝香中的麝香酮等，但這些成分需要在氣相色譜條件下檢測，而基層藥檢室往往沒有配置氣相色譜儀。 經(jīng)過比較各藥材中有效成分的含量，最終選用可在液相色譜條件下檢測的鹽酸小檗堿。 黃連中的鹽酸小檗堿具有抗菌、抗炎、抗氧化等作用［8］，適合作為蘇氏傷痛寧軟膏的含量測定指標(biāo)成分。

3.2.2 供試品溶液制備方法的選擇 嘗試三種供試品溶液制備方法：（1）樣品先經(jīng)酸水提取，然后堿化水層，再用有機(jī)溶劑萃取小檗堿。 此方案制備的供試品溶液純度高，干擾少，但是損失較大，提取率低。（2）用甲醇或甲醇-鹽酸溶液的提取液檢測［9］。結(jié)果，提取液中有一定量的油性基質(zhì)（提取液蒸干后可見，冷凍后也不能固化），若注入液相色譜柱，難以洗脫干凈。（3）該研究所用方法。鹽酸小檗堿在鹽酸-90%甲醇（1∶100） 溶液溶解度較大， 在石油醚（60~90 ℃）極微溶解，因而萃取率較高。

3.2.3 流動相的選擇 嘗試三種流動相體系：（1）乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（30∶70）［10］，鹽酸小檗堿峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。 （2）乙腈-0.05mol/L 磷酸二氫鉀溶液（50∶50）（每100 ml 中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH 值為4.0）［11］，鹽酸小檗堿峰分離度好，不拖尾，但流動相配制煩瑣，且試劑相對較貴。 （3）該研究所用流動相，既不拖尾、分離度好，又配制方便，因而選擇該條件。

3.2.4 檢測波長的選擇 取對照品溶液在200~400 nm 范圍內(nèi)掃描，結(jié)果顯示在265 nm、345 nm 處有最大吸收。 但在265 nm 波長下干擾嚴(yán)重，345 nm波長下也有輕微干擾峰出現(xiàn)， 經(jīng)調(diào)節(jié)流動相比例、流速等均不能解決，后將波長設(shè)為349 nm，則能消除干擾。

綜上所述，采用以上方法快速簡便，準(zhǔn)確可靠，能很好地應(yīng)用于蘇氏傷痛寧軟膏的質(zhì)量控制。