楊 芳 李鵬程 劉 薇 周艷剛 王曉燕 任 濤

1.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤科，四川成都 610500；2.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，四川成都 610500

美國癌癥協(xié)會(huì)2020 年1 月發(fā)布的癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，不管男性還是女性，死亡人數(shù)最多的均為肺癌[1]。而非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌最常見的病理類型，占80%～85%。雖然近年來靶向藥物及免疫治療的使用提高了NSCLC 的生存率，但其5 年生存率僅約16%[2]。因此，探索新的生物標(biāo)志物與NSCLC 臨床病理特征及預(yù)后之間關(guān)系具有重要意義。既往研究結(jié)果顯示，卵巢癌[3]、乳腺癌[4]及頭頸部鱗癌[5]等腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移均受SOX2 影響。故本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)法檢測SOX2蛋白在NSCLC 組織和癌旁組織中的表達(dá)情況，探討SOX2 蛋白與NSCLC 臨床病理特征和預(yù)后之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017 年1 月—2019 年5 月成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）行手術(shù)切除并經(jīng)病理科確診的NSCLC 標(biāo)本74 例。所有病例術(shù)前未接受任何治療，且臨床數(shù)據(jù)齊全。其中男40 例，女34 例；年齡39～83 歲，平均（63.8±10.6）歲；≤60 歲23 例，>60 歲51 例。腺癌43 例，鱗癌31 例；Ⅰ期39 例，Ⅱ期+Ⅲ期35 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44 例。本研究納入患者均知情同意，通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

兔抗人SOX2 多克隆抗體（美國Abcam 公司，貨號(hào)：ab97959）為一抗，按MaxVision/HRP 試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，貨號(hào)：1808060014）說明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。步驟如下：石蠟切片脫蠟和水化，修復(fù)，使用3%的過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，加一抗（1∶400），4℃過夜。PBS 洗滌后，加聚合物增強(qiáng)劑，室溫孵育20 min，孵二抗（酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，貨號(hào)：200526S407g）15 min。加新配制的DAB 溶液5 min，水洗，蘇木精復(fù)染，最后脫水干燥，用中性樹膠封片。鏡下觀察并照像。

1.3 觀察指標(biāo)

SOX2 蛋白陽性表達(dá)在鏡下表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒。每張切片選取5 個(gè)高倍鏡（200×）視野。染色強(qiáng)度計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：無著色0 分；淡黃色1 分；黃色或深黃色2 分；褐色或棕褐色3 分。陽性細(xì)胞所占百分比計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：<5%為0 分；5%～25%為1 分；﹥25%～50%為2 分；＞50%～75%為3 分；＞75%為4 分。總分=陽性細(xì)胞得分×染色強(qiáng)度得分，0 分為陰性（-）；1～4 分為弱陽性（+）；5～8 分為陽性（++）；9～12 分為強(qiáng)陽性（+++）。為便于統(tǒng)計(jì)，人為將陰性和弱陽性定義為陰性（-），陽性和強(qiáng)陽性定義為陽性（+）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；預(yù)后分析使用Kaplan-Meier 曲線和Log-rank test 分子檢驗(yàn)，最后使用COX 模型對(duì)預(yù)后因素行多因素回歸分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC 組織及癌旁組織中SOX2 的表達(dá)情況

NSCLC 組織SOX2 陽性表達(dá)率為47.3%（35/74），高于癌旁組織的9.5%（7/74），差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=26.063，P <0.01）。陽性染色主要在細(xì)胞核，偶有細(xì)胞質(zhì)同時(shí)染色，見圖1。

圖1 NSCLC 組織及癌旁組織中SOX2 的表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)染色，200×)

2.2 SOX2 表達(dá)與NSCLC 患者臨床病理特征間的關(guān)系

不同組織學(xué)類型、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同臨床分期SOX2 陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05 或P <0.01）。見表1。

表1 SOX2 表達(dá)與NSCLC 患者臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

2.3 Kaplan-Meier 生存分析

本研究從2017 年4 月開始隨訪，隨訪截至2020 年4 月，中位隨訪14 個(gè)月。結(jié)果顯示，SOX2 陽性表達(dá)的NSCLC 患者生存期長于SOX2 陰性表達(dá)者，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見圖2。

圖2 Kaplan-Meier 生存分析

2.4 COX 多元回歸分析

具體賦值如下：SOX2 表達(dá)（0=陰性，1=陽性），年齡（0=＞60 歲，1=≤60 歲），性別（0=女性，1=男性），病理類型（0=鱗癌，1=腺癌），臨床分期（0=Ⅱ期+Ⅲ期，1=Ⅰ期），吸煙史（0=無，1=有），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（0=無，1=有）。結(jié)果顯示，SOX2 陽性表達(dá)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是NSCLC 患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素（RR >1，P <0.05）。見表2。

表2 COX 多元回歸分析

3 討論

SOX2 為SOX 基因家族的成員之一，在維持干細(xì)胞的自我更新、多向分化和重編程中發(fā)揮重要作用[6-7]。目前關(guān)于SOX2 表達(dá)與NSCLC 預(yù)后的相關(guān)性缺乏共識(shí)。Sholl 等[8]認(rèn)為SOX2 過表達(dá)是Ⅰ期肺腺癌患者的不良預(yù)后因素。Sasaki 等[9]認(rèn)為SOX2 過表達(dá)與肺鱗癌預(yù)后無明顯相關(guān)性，而Wilbertz 等[10]認(rèn)為SOX2 的表達(dá)與肺鱗癌的預(yù)后改善有關(guān)。Ying 等[11]研究提示SOX2 表達(dá)上調(diào)主要發(fā)生在肺鱗癌中，且SOX2 高表達(dá)者預(yù)后優(yōu)于低表達(dá)者。薈萃分析顯示[12]，無論是SOX2基因DNA 拷貝數(shù)的增加還是SOX2 蛋白的高表達(dá)，都有利于NSCLC 的整體生存。本研究結(jié)果顯示，SOX2 表達(dá)與性別、年齡、是否吸煙無明顯相關(guān)性（P >0.05），癌組織SOX2 陽性表達(dá)率高于癌旁組織（P <0.01），其陽性表達(dá)主要發(fā)生在肺鱗癌中，研究結(jié)果與歐洲和日本學(xué)者的研究一致[9,13]，提示SOX2 可作為診斷肺鱗癌的潛在分子標(biāo)志物[14]。本研究結(jié)果顯示，SOX2 陽性表達(dá)的NSCLC 患者生存期長于SOX2 陰性表達(dá)者；COX 多元回歸分析顯示，SOX2 表達(dá)是NSCLC 患者的獨(dú)立預(yù)后因素，這一結(jié)果與Sholl 等[8]研究結(jié)果相反。分析其原因，考慮本研究中Ⅱ期及Ⅲ期患者約占一半比例，大部分患者術(shù)后接受化療和/或放療，而Sholl 等[8]研究中，納入的為Ⅰ期患者，得出相反的結(jié)論，提示SOX2 陽性表達(dá)導(dǎo)致更好的預(yù)后可能與癌細(xì)胞對(duì)化療和/或放療的敏感性有關(guān)。但本研究為回顧性研究，術(shù)后輔助方案不統(tǒng)一，并且患者驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)情況等信息不完整，不排除治療方案及驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)情況對(duì)預(yù)后的影響。因此，SOX2 陽性表達(dá)與肺癌細(xì)胞對(duì)化療和/或放療的敏感性尚待進(jìn)一步研究。

目前有不少將SOX2 作為治療靶點(diǎn)的研究正在進(jìn)行[15-17]。SOX2 通過其下游信號(hào)傳導(dǎo)介質(zhì)AKT 激酶在NSCLC 疾病進(jìn)展過程中促進(jìn)腫瘤的生長和耐藥，因此，SOX2 可能成為NSCLC 的治療靶點(diǎn)[18-19]。另有研究顯示[20-21]，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向機(jī)體各個(gè)部位擴(kuò)散。Chang[22]觀察到SOX2 下調(diào)增加了腫瘤上皮標(biāo)志物的表達(dá)，而間質(zhì)標(biāo)志物及其相關(guān)基因下調(diào)，提示SOX2 可能促進(jìn)NSCLC 的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。miRNA 參與了細(xì)胞的發(fā)育、增殖、分化及凋亡等多種生物學(xué)過程，包括肺癌在內(nèi)的多種癌癥中也發(fā)現(xiàn)了異常的miRNA 表達(dá)模式[23-24]。有證據(jù)表明，miRNA 可能通過調(diào)控其靶基因在NSCLC 中的表達(dá)來調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，包括上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，而SOX2 表達(dá)受miR-590-5p 調(diào)控。因此，miR-590-5p/SOX2 軸可能作為NSCLC 的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)因子，可作為NSCLC 治療的靶點(diǎn)[22,25]。相信隨著SOX2 基礎(chǔ)研究的不斷深入，其與NSCLC 發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系將會(huì)更加明朗，未來可能成為治療靶點(diǎn)改善患者預(yù)后。