賈 兵，郭國(guó)凌，余 桃，董煒昱，張舒琴，陳 猛，劉 莉

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，合肥 230036)

中國(guó)是世界上梨栽培面積最大的國(guó)家，2017年梨樹栽培總面積達(dá)96萬hm2左右，總產(chǎn)量約1 653萬t，分別占世界總面積和總產(chǎn)量的69.1%和68.4%[1]?！X山酥梨’具有適應(yīng)性好、抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量高、耐粗放管理等優(yōu)點(diǎn),分布廣泛，成為中國(guó)栽培面積最大的梨品種。黃河故道地區(qū)是中國(guó)梨主產(chǎn)區(qū)之一，其主栽品種‘碭山酥梨’缺鐵黃化現(xiàn)象嚴(yán)重，制約著當(dāng)?shù)乩娈a(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

吲哚乙酸(IAA)合成于植物幼嫩組織，參與包括植物衰老階段的葉片黃化及葉內(nèi)葉綠素的降解等在內(nèi)的多種生理過程調(diào)控[2-3]。研究表明，內(nèi)源IAA含量與葉片黃化密切相關(guān)。葉片內(nèi)軛合態(tài)IAA含量大幅度提升，是早衰突變體psf衰老進(jìn)程加快的一個(gè)重要生理特征[4]。竹子及水稻的相繼研究證實(shí)，IAA在葉片衰老過程中，含量顯著下降，且伴隨著葉綠素的加劇降解，從而造成葉片黃化而脫落[5-6]。細(xì)胞分裂素類似物——N-苯基-N′-(2-氯-4-吡啶基)脲(4PU-30)處理水稻后能顯著抑制葉內(nèi)IAA含量的減少，延緩葉片的衰老[7]；0.4%和0.6%高鹽濃度處理均在導(dǎo)致水紅三角梅多數(shù)葉片黃化而脫落的同時(shí)，也顯著降低了其葉內(nèi)IAA含量，而鹽濃度越高，葉片黃化越嚴(yán)重，IAA含量越少，即IAA對(duì)葉片黃化及葉綠素降解具有抑制作用[8]?！X山酥梨’正常葉內(nèi)IAA含量顯著高于黃化葉，且缺鐵黃化程度越深，其葉片內(nèi)源IAA含量越低[9]。上述結(jié)果均說明，高IAA含量有利于葉片持綠。

IAA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要是通過細(xì)胞核中的TIR1-AUX/IAAs-ARFs通路進(jìn)行。首先，位于細(xì)胞膜上的AUX1共轉(zhuǎn)運(yùn)體負(fù)責(zé)將活性IAA從細(xì)胞外運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)，并進(jìn)一步與F-Box蛋白-TIR1(transport inhibitor response1)偶聯(lián)，F(xiàn)-Box可與Cullin-like蛋白CUL1相互作用形成泛素連接酶(E3)復(fù)合物SCFTIR1，以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄抑制因子Aux/IAA蛋白(auxin/indole-3-acetic acid)的泛素降解，并將ARF(auxin response factors)從AUX/IAA-ARF二聚體中釋放[10]。最后，ARF的轉(zhuǎn)錄激活將間接激活I(lǐng)AA初級(jí)響應(yīng)基因AUX/IAA、GH3(gretchen hagen3)和SAUR(small auxin up RNA)3個(gè)主要家族的表達(dá)。在其共同作用下，植物體內(nèi)IAA水平處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。因此，AUX/IAA蛋白的降解和ARF蛋白的激活可引起強(qiáng)烈的IAA信號(hào)[11]，進(jìn)而影響細(xì)胞增大和植物生長(zhǎng)，生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑如圖1所示。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，葉面噴施一定濃度的FeSO4溶液，可誘導(dǎo)‘碭山酥梨’黃化葉復(fù)綠，其中以濃度0.2%效果最佳。迄今，國(guó)內(nèi)外關(guān)于外源FeSO4誘導(dǎo)梨樹黃化葉復(fù)綠的機(jī)理鮮見系統(tǒng)性研究。本試驗(yàn)以‘碭山酥梨’正常植株和缺鐵黃化植株為試驗(yàn)材料，經(jīng)黃化葉片葉面噴施0.2% FeSO4，觀察其對(duì)黃化葉片的復(fù)綠效應(yīng)，并通過測(cè)定葉片中Fe2+含量、內(nèi)源IAA含量及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的相對(duì)表達(dá)量，試圖揭示施用外源FeSO4對(duì)‘碭山酥梨’黃化葉復(fù)綠的效應(yīng)及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

試驗(yàn)于2020年5月進(jìn)行，以安徽省碭山縣園藝場(chǎng)15年生‘碭山酥梨’缺鐵黃化植株與正常植株為試材，它們立地條件與栽培管理水平一致。于黃化梨樹生長(zhǎng)期全樹葉面噴施濃度為0.2%的FeSO4溶液10 L，對(duì)照為噴施清水的正常植株葉片(CN)和黃化植株葉片(CC)，共計(jì)3個(gè)處理，每個(gè)處理3株樹，重復(fù)3次，共計(jì)27株。分別于FeSO4溶液處理前取對(duì)照正常葉片和黃化葉片葉樣，于處理后第3、6、9 和12天取處理葉片樣品(分別簡(jiǎn)稱為CN、CC、T3 d、T6 d、T9 d、T12 d)，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 內(nèi)源激素含量和Fe2+含量的測(cè)定

采用稀鹽酸浸提法和鄰菲羅啉比色法，測(cè)定葉片中Fe2+含量[12]，采用ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)酶聯(lián)免疫法，測(cè)定葉片中IAA含量[13]。

1.3 總RNA的提取以及cDNA合成

RNA提取使用RN53-EASYspin Plus多糖多酚RNA快速提取試劑盒，合成cDNA采用PC54-TRUEscript RT kit (+gDNA Eraser) 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(試劑盒均購自北京艾德萊生物科技有限公司。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

從梨基因組數(shù)據(jù)庫中以及NCBI查詢、獲得了IAA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的全長(zhǎng)序列，并根據(jù)獲得的序列使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)引物(表1)，擴(kuò)增反應(yīng)于ABI STEP-ONE(Thermal)熒光定量PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)總體系20 μL，包括上海東洋紡生物科技有限公司SYBR?Green Real-time PCR Master Mix 10 μL，模板cDNA 2 μL、正向引物和反向引物各0.8 μL、6.4 μL DEPC。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品3次重復(fù)。以梨GAPDH基因作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCT法求待測(cè)樣品基因相對(duì)表達(dá)量[14]。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 The primers for qRT-PCR

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)運(yùn)用單因素方差分析(ANOVA)的方法，以Duncan多重極差法進(jìn)行各處理的平均值檢驗(yàn)，并以Excel 2019、GraphPad Prism 8和SPSS 23軟件(SPSS Inc.，Chicago,IL,USA)在P<0.05 的水平上計(jì)算最小顯著性差異(LSD)值，分析各處理間的差異顯著性；關(guān)聯(lián)性分析運(yùn)用雙變量分析的方法，以均值與標(biāo)準(zhǔn)差于P<0.05水平上進(jìn)行雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 FeSO4處理對(duì)黃化葉片復(fù)綠的效應(yīng)

‘碭山酥梨’黃化植株葉面噴施FeSO4溶液后，其葉片復(fù)綠情況如圖2所示。其中，處理后第3天(T3 d)，黃化葉出現(xiàn)不規(guī)則的復(fù)綠斑點(diǎn)；處理后第6天(T6 d)，黃化葉復(fù)綠現(xiàn)象明顯，葉面形成較多不規(guī)則復(fù)綠斑塊；處理后第9天(T9 d)，葉面出現(xiàn)大面積復(fù)綠，葉身留有少量沒有復(fù)綠的不規(guī)則黃色斑塊；處理后第12天(T12 d)，黃化葉出現(xiàn)整葉復(fù)綠，但較對(duì)照組正常葉片相比，葉色不夠濃綠并伴有不規(guī)則的黃色斑點(diǎn)。

AUX1.生長(zhǎng)素膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；TIR1.生長(zhǎng)素受體蛋白；AUX/IAA.生長(zhǎng)素/吲哚乙酸蛋白；ARF.生長(zhǎng)素響應(yīng)因子；GH3.生長(zhǎng)素早期響應(yīng)基因家族；SAUR.生長(zhǎng)素早期響應(yīng)基因家族圖1 生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑示意圖AUX1.Auxin influx transporter 1;TIR1.Transport inhibitor response gene 1;AUX/IAA.Auxin/indole-3-acetic acid protein in early auxin-response;ARF.Auxin response factor;GH3.Gretchen Hagen3 in early auxin-response;SAUR.Small auxin up RNA in early auxin-responseFig.1 Diagram of IAA transduction pathway

2.2 FeSO4處理對(duì)葉內(nèi)Fe2+和IAA含量的影響

圖3顯示，對(duì)照組正常葉(CN)Fe2+含量顯著高于黃化葉(CC)，顯著增加33.2%；FeSO4處理黃化葉后第3、6、9、12天，其葉片(T3 d、T6 d、T9 d、T12 d)Fe2+含量表現(xiàn)出逐漸增加趨勢(shì)，且均顯著高于CC和CN，較CC顯著增加49.9%～93.8%(圖3，A)。同時(shí)，葉片的IAA含量也以CC葉最低，CN葉顯著高于CC葉，增幅為26.7%；FeSO4處理黃化葉(T3 d～T12 d)IAA含量均顯著高于CN和CC，較CC顯著增加60.0%～142.9%；在FeSO4處理組，T6 d和T9 d葉內(nèi)IAA含量顯著高于T3 d和T12 d，T6 d又較T9 d顯著升高，而T3 d和T12 d之間無顯著差異(圖3，B)。因此，‘碭山酥梨’正常葉內(nèi)Fe2+、IAA含量均顯著高于黃化葉；較對(duì)照組黃化葉而言，外源FeSO4處理顯著提高了復(fù)綠葉內(nèi)Fe2+及IAA含量，且較正常葉也顯著增加。

CN和CC 分別表示葉面噴施清水的正常葉和黃化葉(對(duì)照)；T3 d、T6 d、T9 d、T12 d 分別表示葉面噴施0.2% FeSO4后第3、6、9和12 天的黃化葉(轉(zhuǎn)綠葉)；下同圖2 ‘碭山酥梨’葉面噴施FeSO4后黃化葉片的復(fù)綠情況CN and CC indicate normal and chlorotic leaves (control) treated with distilled water,respectively;T3 d,T6 d,T9 d and T12 d indicate chlorotic leaves (converting to retrieved green) at the 3rd,6th,9th and 12th day after spraying 0.2% FeSO4,respectively;the same belowFig.2 Retrieved green performance of ‘Dangshansuli’ chlorotic leaves sprayed with FeSO4 solution

圖3 FeSO4處理黃化葉內(nèi)Fe2+和內(nèi)源IAA含量的變化Fig.3 The endogenous IAA and Fe2+ contents in leaves with FeSO4 application

2.3 FeSO4處理對(duì)黃化葉內(nèi)IAA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達(dá)的影響

首先，生長(zhǎng)素膜上轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AUX1.1/1.2/1.3表達(dá)量在對(duì)照組均表現(xiàn)為黃化葉(CC)顯著高于正常葉(CN)。在FeSO4處理組中，轉(zhuǎn)綠葉AUX1.1表達(dá)量表現(xiàn)為逐漸增加趨勢(shì)，其中T3 d、T6 d比CC顯著降低，T9 d比CC稍高，T12 d比CC顯著增加；轉(zhuǎn)綠葉AUX1.2/1.3表達(dá)量表現(xiàn)為先增加后降低趨勢(shì)，并均在T9 d中最高；AUX1.2表達(dá)量表現(xiàn)為T3 d比CC顯著降低，T6 d比CC稍高，T9 d和T12 d均較CC顯著增加；AUX1.3表達(dá)量則為T3 d～T12 d均不同程度地低于CC，但僅T3 d和T6 d降幅達(dá)到顯著水平(圖4，A)。受體蛋白基因TIR1.1/1.2/1.3表達(dá)量在對(duì)照組均表現(xiàn)為CC不同程度低于CN，但TIR1.1/1.2下降顯著。在FeSO4處理組，各基因表達(dá)量均隨著處理時(shí)間先升后降，并均在T6 d中達(dá)到最大值，且均在T3 d～T9 d中高于CC，在T12 d低于CC；其中，僅TIR1.1在T3 d～T9 d，TIR1.2在T6 d、T12 d，以及TIR1.3在T12 d中達(dá)顯著差異性水平，各基因在其他各時(shí)期表達(dá)量均與CC無顯著性差異(圖4，A)。

其次，SAUR1/2/3/4表達(dá)量在對(duì)照組內(nèi)均表現(xiàn)為黃化葉CC顯著高于正常葉CN，且SAUR4表現(xiàn)最為突出。在FeSO4處理組內(nèi)，各基因表達(dá)量隨處理時(shí)間都先降后升，其表達(dá)量均顯著低于相應(yīng)的黃化葉CC，且均在T6 d葉達(dá)到最低值且與其他處理差異顯著，在T3 d、T9 d葉居中，在T12 d葉中達(dá)到最大值并顯著高于T9 d；其中，SAUR1/2/3/4基因在T12 d葉中表達(dá)量均顯著高于正常葉片CN(圖4，B)。

圖4 FeSO4處理下黃化葉片IAA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)的變化Fig.4 The expression variation of IAA signaling genes in chlorotic leaves sprayed with FeSO4

再次，GH3.1/3.2/3.5表達(dá)量對(duì)照組內(nèi)均表現(xiàn)為黃化葉CC顯著高于正常葉CN，GH3.3/3.4的表達(dá)量則表現(xiàn)相反，CC均顯著低于CN。在FeSO4處理組內(nèi)，GH3.1/3.2/3.5表達(dá)量均隨處理時(shí)間而增加，且T12 d顯著高于其余處理時(shí)期。但各基因表達(dá)量在各時(shí)期大多較CC顯著下降；GH3.3/3.4的表達(dá)量均隨處理時(shí)間而先升后降，并均在T6 d時(shí)達(dá)到最大值，且顯著高于其余時(shí)期，而兩基因在T3 d～T9 d的表達(dá)量均顯著高于CC(圖4，C)。

另外，AUX/IAA1/2/3/7表達(dá)量在對(duì)照組中均表現(xiàn)為黃化葉CC顯著高于正常葉CN，而AUX/IAA4/5/6的表達(dá)量則表現(xiàn)為顯著低于正常葉CN的相反趨勢(shì)。在FeSO4處理組內(nèi)，AUX/IAA3/7表達(dá)量在各處理時(shí)期均較CC顯著下降；AUX/IAA1/2表達(dá)量分別在T12 d和T9 d中與黃化葉無顯著性差異，其他時(shí)期均較黃化葉CC顯著下降；AUX/IAA4/5/6的表達(dá)量各處理時(shí)期均較黃化葉CC顯著增加，并于T9 d時(shí)達(dá)到甚至顯著超出CN水平；且除T12 d葉片的AUX/IAA6表達(dá)量與T9 d無顯著變化外，T12 d葉片的AUX/IAA4/5表達(dá)量都較T9 d顯著下降(圖4，D)。

因此，‘碭山酥梨’正常葉與黃化葉之間的AUX1.1/1.2/1.3、TIR1.1/1.2、SAUR1/2/3/4、GH3.1/3.2/3.3/3.4/3.5、AUX/IAA1/2/3/4/5/6基因表達(dá)量均存在顯著差異。總體而言，F(xiàn)eSO4處理在處理后第6、9 天時(shí)促進(jìn)了TIR1.1、GH3.3/3.4、AUX/IAA4/5/6基因的表達(dá)，而抑制了AUX1.1/1.3、SAUR1/2/3/4、GH3.1/3.2/3.5、AUX/IAA1/3/7基因的表達(dá)。

2.4 FeSO4處理對(duì)黃化葉內(nèi)IAA響應(yīng)因子ARFs表達(dá)的影響

首先，IAA響應(yīng)因子ARF1/2/11/12/13/14的表達(dá)量在對(duì)照組均表現(xiàn)為黃化葉CC顯著高于正常葉CN(圖5)。在FeSO4處理組內(nèi)，ARF1/2表達(dá)量在T3d～T12d葉中均較黃化葉CC顯著下降。ARF2表達(dá)量在各時(shí)期葉片之間無顯著差異性，ARF1表達(dá)量則表現(xiàn)為T12 d>T6 d>T9 d>T3 d葉片，除后兩者外各處理時(shí)期間均差異顯著。與CC相比，ARF11/14表達(dá)量均在T3 d葉中無顯著變化，而在T6 d～T12 d葉中顯著降低，且T9 d葉又顯著高于T6 d和T12 d葉。ARF12/13表達(dá)量在各處理時(shí)期均比黃化葉CC不同程度降低，且除T6 d葉外降幅均達(dá)到顯著水平，在其余時(shí)期表現(xiàn)為T9 d>T3 d>T12 d，且三者之間均差異顯著。

圖5 FeSO4處理下黃化葉片ARFs基因表達(dá)量的變化Fig.5 The ARFs gene expression variation in chlorotic leaves sprayed with FeSO4

其次，IAA響應(yīng)因子ARF3/4/5/6/7/8/9/10/15/17/18/19/20/21/22/23的表達(dá)量在對(duì)照組中均表現(xiàn)為黃化葉CC顯著低于正常葉CN(圖5)。在FeSO4處理組內(nèi)，ARF7/18表達(dá)量在T3 d～T12 d葉中均與CC無顯著性差異，ARF15/17表達(dá)量也在T3 d～T9 d葉中與葉CC均無顯著性差異，但在T12 d葉中均較CC顯著下降；ARF5/6/20/21/23表達(dá)量在T3 d～T12 d葉中均較CC顯著增加；ARF3/9/19/22表達(dá)量在T3 d～T9 d葉中均較CC顯著增加，而在T12 d葉中較T9 d葉顯著下降，且與CC無顯著性差異；ARF4表達(dá)量在T6 d和T9 d葉顯著高于CC，而T3 d和T12 d葉與黃化葉無顯著差異；ARF8表達(dá)量在T3 d和T9 d葉顯著高于黃化葉，在T6 d葉中與黃化葉無顯著差異，在T12 d葉中顯著低于黃化葉；ARF10表達(dá)量?jī)H在T9 d葉中顯著高于黃化葉，在其余時(shí)期葉中均與黃化葉無顯著差異。

另外，與前兩類基因不同，ARF16表達(dá)量在正常葉CN與黃化葉CC之間并無顯著性差異，且在FeSO4處理的T3 d～T9 d葉表達(dá)量并無顯著性差異，且與CN、CC之間無顯著變化，但T12 d葉表達(dá)量較其他時(shí)期及對(duì)照均顯著下降。

因此，‘碭山酥梨’正常、黃化葉ARF基因表達(dá)量存在顯著差異，且外源FeSO4處理顯著促進(jìn)了ARF3/5/6/9/19/20/21/22/23的表達(dá)，而抑制了ARF1/2的表達(dá)。

2.5 黃化葉片IAA含量與其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達(dá)量的相關(guān)性分析

‘碭山酥梨’黃化葉片F(xiàn)e2+含量、IAA含量及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達(dá)量之間相關(guān)性分析結(jié)果(圖6)表明：一方面，F(xiàn)eSO4處理組轉(zhuǎn)綠葉內(nèi)的Fe2+含量較黃化葉CC和正常葉CN顯著增加，從而誘導(dǎo)有相互促進(jìn)作用的2個(gè)基因AUX/IAA5、AUX/IAA6 的表達(dá)；AUX/IAA5基因表達(dá)量的顯著增加進(jìn)一步顯著上調(diào)了ARF5基因的表達(dá)，而AUX/IAA6表達(dá)量的增加則在上調(diào)ARF5表達(dá)的同時(shí)，抑制了ARF14基因的表達(dá)；在ARF5表達(dá)顯著上調(diào)之后，AUX/IAA1、ARF2、ARF11、ARF14、SAUR1等5個(gè)基因的表達(dá)量反而顯著下降。

紅線表示顯著正相關(guān)，黑線代表顯著負(fù)相關(guān)，橫線上數(shù)字代表兩者之間在P<0.05水平上的相關(guān)系數(shù)，下同圖6 ‘碭山酥梨’葉片F(xiàn)e2+含量、IAA含量及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達(dá)量間相關(guān)性分析結(jié)果示意簡(jiǎn)圖Red lines indicate significant positive correlation,while black lines indicate significant negative correlation.The numbers above the lines represent the correlation coefficient between each other at P<0.05 level;the same as belowFig.6 Schematic diagram of correlation analysis among Fe2+ content,IAA content and its signaling genes expression level

另一方面，F(xiàn)eSO4處理組轉(zhuǎn)綠葉內(nèi)的IAA含量較黃化葉CC和正常葉CN顯著增加，可能與其葉內(nèi)顯著上調(diào)的GH3.3、顯著下調(diào)的SAUR1、SAUR2基因表達(dá)量密切相關(guān)。就GH3.3而言，其表達(dá)在受到TIR1.1的正反饋調(diào)節(jié)的同時(shí)，也受到SAUR1/2/3基因的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。

此外，SAUR1基因表達(dá)量顯著下降可能與ARF5基因的上調(diào)表達(dá)及AUX/IAA1的下調(diào)表達(dá)相關(guān)；而SAUR2基因表達(dá)量顯著下調(diào)也與AUX/IAA1下調(diào)有關(guān)，同時(shí)也與TIR1.1的顯著上調(diào)相關(guān)；其中，SAUR1與SAUR2存在著相互促進(jìn)的作用。

因此，外源FeSO4可顯著增加處理黃化葉內(nèi)(轉(zhuǎn)綠葉)Fe2+含量，并影響IAA的轉(zhuǎn)導(dǎo)，間接影響IAA代謝，造成其葉內(nèi)IAA含量的顯著上升。其簡(jiǎn)要作用途徑可分為3種：Ⅰ)Fe2+→AUX/IAA5、AUX/IAA6→(ARF14)→ARF5→SAUR1→IAA；Ⅱ)Fe2+→AUX/IAA5、AUX/IAA6→(ARF14)→ARF5→AUX/IAA1→SAUR2→IAA；Ⅲ)Fe2+→AUX/IAA5、AUX/IAA6→(ARF14)→ARF5→AUX/IAA1→TIR1.1→GH3.3→IAA，其作用簡(jiǎn)圖如圖7所示。

圖7 Fe2+含量與IAA含量及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達(dá)量的相關(guān)性作用示意簡(jiǎn)圖Fig.7 Schematic sketch of the relevance between Fe2+ content with IAA content and its signaling genes expression

3 討 論

Fe是植物體內(nèi)重要的微量元素之一，影響著葉綠素分子組成成分卟啉的合成，從而參與葉綠素的合成，缺鐵易導(dǎo)致植物黃化[15]。研究指出，葉面噴施低濃度鐵肥可改善果樹體內(nèi)Fe2+含量，改善其失綠癥[16]；外源Fe2+處理也可使受缺鐵脅迫的沙梨上部黃化葉片顯著復(fù)綠，其葉綠素含量顯著提升，轉(zhuǎn)色延緩[17]。說明外源Fe2+處理利于植株葉內(nèi)Fe2+積累，并誘導(dǎo)黃化葉復(fù)綠。本試驗(yàn)中，葉面噴施FeSO4可誘導(dǎo)‘碭山酥梨’黃化葉出現(xiàn)復(fù)綠斑塊，甚至整葉復(fù)綠，與前人相關(guān)研究相符。另外，酸性溶液(pH=6.0)處理能延緩正常銀杏葉片的轉(zhuǎn)色[18]，F(xiàn)eSO4也屬于弱酸物質(zhì)，這也可能是使‘碭山酥梨’黃化葉復(fù)綠的原因之一。

同時(shí)，本試驗(yàn)結(jié)果表明，‘碭山酥梨’正常葉內(nèi)IAA含量顯著高于黃化葉，F(xiàn)eSO4處理顯著提高了黃化葉內(nèi)IAA含量，說明FeSO4處理促進(jìn)了IAA的合成。已有研究表明，正常葉內(nèi)IAA含量顯著高于黃化葉，且缺鐵黃化程度越深，其葉內(nèi)IAA含量越低[17]，因此，高IAA含量利于葉片持綠。此外，6-BA處理能顯著增加切花菊‘優(yōu)香’葉內(nèi)IAA含量，延緩葉綠素的降解，推遲葉片黃化[18]，且在甘薯幼苗內(nèi)IAA氧化酶活性提高的同時(shí)，其葉綠素含量也減少[19]，說明IAA可抑制葉綠素降解。本試驗(yàn)研究結(jié)果均與之相符。但迄今關(guān)于FeSO4誘導(dǎo)IAA含量變化的作用機(jī)制未見報(bào)道。

前人研究指出，檳榔正常葉和黃化葉轉(zhuǎn)錄組顯示的差異基因主要富集在激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑中，黃化葉中IAA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的AsSAUR基因表達(dá)量顯著上調(diào)，而AsAUX1、AsTIR1、AsARF基因表達(dá)量均顯著下調(diào)[20]；絕大多數(shù)IAA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)量在銀杏葉片黃化過程中也顯著下降[21]。說明IAA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在葉片持綠過程中具有重要作用，且AsSAUR可能參與促進(jìn)了葉片黃化癥的形成，而AsAUX1、AsTIR1、AsARF在葉片黃化調(diào)控過程中的功能則與AsSAUR相反。在本試驗(yàn)中，‘碭山酥梨’對(duì)照組黃化葉內(nèi)AUX1.1、AUX1.2表達(dá)量均顯著高于正常葉，該結(jié)果可能是葉片的黃化應(yīng)激所致；在FeSO4處理后第3天，這些基因表達(dá)量均較黃化葉顯著下降，而處理后第9天顯著增加而高于正常葉，處理后第12天較黃化葉顯著增長(zhǎng)，均與前期AUX1可促進(jìn)葉片持綠的相關(guān)研究結(jié)果相符。同時(shí)，本研究中‘碭山酥梨’對(duì)照組黃化葉內(nèi)受體蛋白基因TIR1.1/1.2表達(dá)量均顯著低于正常葉片，而在FeSO4處理后第3、6、9天表達(dá)量顯著增加。說明IAA含量及其轉(zhuǎn)運(yùn)體的顯著增加促進(jìn)了TIR1表達(dá)量的顯著增加，增強(qiáng)了IAA效應(yīng)，并進(jìn)一步參與調(diào)控葉內(nèi)葉綠素合成及‘碭山酥梨’的黃化復(fù)綠過程。即TIR1對(duì)于葉片的黃化復(fù)綠過程起正向調(diào)控作用，這與前人研究結(jié)果相符。

另據(jù)報(bào)道，過表達(dá)AtSAUR36加快了擬南芥葉片的衰老[22]，且水稻老葉中OsSAUR39表達(dá)量較幼嫩組織高，其過表達(dá)水稻株系內(nèi)的IAA含量減少，花青素、葉綠素含量降低，葉片提前衰老[23]，說明SAUR與葉綠素降解及葉片衰老正相關(guān)。在本試驗(yàn)中，‘碭山酥梨’對(duì)照組黃化葉內(nèi)SAUR1/2/3/4表達(dá)量均較正常葉顯著升高，而FeSO4處理后各時(shí)期表達(dá)量均較黃化葉顯著下降。說明高表達(dá)的SAUR可能是黃化葉形成的重要原因，而FeSO4處理所誘導(dǎo)的SAUR表達(dá)量顯著下降是調(diào)控黃化葉復(fù)綠的重要因素，這與前人相關(guān)研究結(jié)果相符。

已有研究表明，茉莉酸(jasmonic acid，JA)能抑制FIT、bHLH38/39/100/101、IRT1和FRO2基因的表達(dá)，使擬南芥缺鐵脅迫更加嚴(yán)重，黃化現(xiàn)象加劇[24]；而施用JA或水楊酸(salicylic acid，SA)可促進(jìn)葉片黃化基因及早衰基因的表達(dá)，使野生型擬南芥黃化而早衰[25-26]。說明JA與SA參與應(yīng)答葉片黃化過程。而GH3基因家族可編碼一類酰酸酰胺合成酶，促使氨基酸與JA和SA結(jié)合，并改變其生物活性[27]。本研究結(jié)果表明，‘碭山酥梨’對(duì)照組黃化葉內(nèi)GH3.1/3.2/3.5表達(dá)量均顯著高于正常葉；GH3.1/3.2/3.5表達(dá)量在FeSO4處理后第3、6、9 天均較黃化葉顯著下降。由此說明GH3可能通過JA、SA信號(hào)途徑而介導(dǎo)葉片的黃化復(fù)綠，但其功能具有冗雜性。

另一方面，本研究中‘碭山酥梨’對(duì)照組黃化葉中AUX/IAA1/2/3/7表達(dá)量均顯著高于正常葉，AUX/IAA4/5/6的表達(dá)量顯著低于正常葉；而FeSO4處理葉片AUX/IAA1/3/7表達(dá)量較黃化葉顯著下降，AUX/IAA5/6表達(dá)量則較黃化葉顯著增加。缺鐵黃化癥最先產(chǎn)生于幼葉，而相關(guān)研究也指出，PoptrAUX/IAA16.3/16.4基因僅在幼葉中表達(dá)，且幼葉中的PoptrAUX/IAAs表達(dá)量也顯著高于成熟葉[28]，這與本試驗(yàn)中黃化葉內(nèi)AUX/IAA1/2/3的高表達(dá)現(xiàn)象相符，同時(shí)說明幼葉AUX/IAA的高表達(dá)可能是引起其缺鐵的重要因素。

與GH3、AUX/IAA基因家族功能類似，ARF對(duì)于‘碭山酥梨’黃化復(fù)綠的作用也具有冗余性。已有研究表明，外源IAA處理可上調(diào)SlARF1/2/3/4/7/8.1/9/12/13/13.1/14/17的表達(dá)而抑制番茄花柄外植體的萎黃而脫落，但SlARF5/6/8/10/11/16/19卻在黃化、脫落花柄中顯著上調(diào)；然而，番茄SlARF2-RNAi植株葉片葉色鮮綠，與野生型在老化時(shí)大規(guī)?？焖傥S死亡相比，SlARF2-RNAi延緩了葉片老化，并抑制了促衰老基因SENU1和SENU5的表達(dá)[29]；在擬南芥衰老葉片中，AtARF2/7/19的表達(dá)顯著增加，葉綠素含量顯著下降，而arf2突變體葉片衰老延遲，葉綠素降解過程減緩[30]即ARF對(duì)葉片葉綠素降解和黃化也起著重要調(diào)控作用。在本試驗(yàn)中，‘碭山酥梨’對(duì)照組黃化葉內(nèi)ARF3/4/5/6/7/8/9/10/15/17/18/19/20/21/22/23表達(dá)量顯著低于正常葉，其中的ARF3/5/6/9/10/19/20/21/22/23表達(dá)量在FeSO4處理后第3、6、9 天均較黃化葉顯著增加。由此說明ARF3/5/6/9/10/19/20/21/22/23功能可能與SlARF1/2/3/4/7/8.1等基因功能相似，對(duì)葉片葉綠素降解及葉片黃化具有抑制作用。而較正常葉而言，‘碭山酥梨’黃化葉內(nèi)ARF1/2/11/12/13/14表達(dá)量顯著增加，再綜合這些基因表達(dá)量在FeSO4處理后的變化規(guī)律來看，ARF1/2/11/12/13/14可能與AtARF2/7/19功能相似，起著降解葉內(nèi)葉綠素及促進(jìn)葉片黃化的作用。

綜上所述，‘碭山酥梨’正常葉、黃化葉內(nèi)Fe2+含量、IAA含量及其信號(hào)傳導(dǎo)基因表達(dá)量存在顯著差異；FeSO4處理在誘導(dǎo)黃化葉復(fù)綠的同時(shí)，也顯著增加了葉內(nèi)Fe2+含量及IAA含量。而IAA含量的增加可能與黃化葉復(fù)綠過程中Fe2+含量顯著增加，從而顯著增強(qiáng)IAA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因AUX1.2/1.3、TIR1.1/1.2、GH3.3/3.4、AUX/IAA4/5/6和ARF3/5/6/9/10/19/20/21/22/23的表達(dá)量相關(guān)，也與顯著減少的GH3.1/3.2/3.5、AUX/IAA1/3/7、SAUR1/2/3/4以及ARF1/2表達(dá)量相關(guān)，且進(jìn)一步的相關(guān)性分析結(jié)果表明了這些基因之間可能存在相互作用途徑。葉片F(xiàn)e2+含量的增加可促進(jìn)AUX/IAA5、AUX/IAA6的表達(dá)，從而上調(diào)ARF5表達(dá)，而造成SAUR1、AUX/IAA1的表達(dá)抑制，因此SAUR2表達(dá)量下降，TIR1、GH3.3表達(dá)量上升，造成IAA含量顯著增加，其簡(jiǎn)要作用途徑可表示為Fe2+→AUX/IAA5、AUX/IAA6→(ARF14)→ARF5→SAUR1、AUX/IAA1→SAUR2/TIR1.1/GH3.3→IAA。本試驗(yàn)初步揭示了IAA及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與FeSO4所誘導(dǎo)的‘碭山酥梨’黃化復(fù)綠過程存在一定聯(lián)系。