吳曉雯 王鐵桿 劉穎 張鵬

(浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，溫州市海洋生物遺傳育種重點實驗室，浙江溫州 325005)

海洋游泳動物是海洋生態(tài)系統(tǒng)和海洋生物資源的重要組成部分，包括海洋魚類、頭足類、甲殼類等，可以直接給人類提供高營養(yǎng)價值的食物，具有重要的經(jīng)濟利用價值。對海洋游泳生物進行調(diào)查鑒定是海洋生物資源監(jiān)測、海洋生物多樣性研究的基礎(chǔ)工作，也是海洋資源開發(fā)利用和海洋保護區(qū)建設(shè)重要的參考依據(jù)。長期以來，都是根據(jù)生物的外部形態(tài)來鑒定物種。通常魚類在早期的形態(tài)特征差異不夠明顯或者相類似，很難根據(jù)其早期階段的形態(tài)特征進行精確分類[1]。由于物種表型具有可塑性，其形態(tài)特征會受到生物或者非生物因素的干擾[2]；生物在不同的生長發(fā)育階段或者兩性異形也會影響鑒定的準確性[3]。此外，形態(tài)學鑒定還受到分類者經(jīng)驗和能力的影響，需要大量的專業(yè)知識積累。因此，準確地鑒定物種顯得尤為重要。

隨著生物分子技術(shù)的快速發(fā)展，DNA條形碼分析成為物種系統(tǒng)演化和分類鑒定的1種新的手段[4]，是專業(yè)人員可以運用的1種有效鑒定工具[5]。Hebert 等[6]明確提出了DNA 條形碼(DNA barcoding) 的概念，即通過使用短的、標準化的基因片段來進行物種鑒定，以提高真核生物識別效率，也使得DNA 序列輔助分類方法得到一定程度的統(tǒng)一。DNA條形碼技術(shù)的快速發(fā)展，在物種鑒定方面表現(xiàn)出較高的優(yōu)越性，尤其是DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建，為種類鑒定奠定了基礎(chǔ)。目前，線粒體細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(COI) 基因被公認為標準DNA條形碼[7-8]，可以有效鑒定魚類[9-12]、頭足類[13]、甲殼類[14]和多毛類[15]。

洞頭海域處于浙江省南部，該海域受浙閩沿岸流和臺灣暖流的低、高鹽水系交匯的影響，水文條件適宜，海域開闊，海洋生物資源豐富。雖然已有該海域游泳動物的物種組成和群落結(jié)構(gòu)季節(jié)性變化的研究報道[16-17]，但鮮有關(guān)于DNA條形碼數(shù)據(jù)收集的報道。為了監(jiān)測該地區(qū)的游泳生物資源，本研究通過測定和比對溫州海域常見游泳生物的線粒體COI基因的DNA 條形碼序列，分析該基因在溫州海域游泳生物鑒定中的可行性，并為建立溫州海域游泳生物DNA 條形碼庫提供方法和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，研究結(jié)果可為該地區(qū)漁業(yè)監(jiān)測、海洋生物資源保護、海洋保護區(qū)的建立提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集與鑒定

2020年4月在浙江省洞頭海域進行張網(wǎng)調(diào)查(張網(wǎng)網(wǎng)口長10 m、寬7 m、高5 m， 80目)，生物學測定按照《海洋調(diào)查規(guī)范 第6 部分：海洋生物調(diào)查》(GB/T 12763.6—2007)進行。將每個調(diào)查站位的漁獲物全部取樣裝入樣品袋，做好漁撈記錄和樣品袋編號記錄后，冰鮮保存，帶回實驗室進行分析和鑒定，對主要品種進行生物學測定。稱量用電子天平精確度為0.001 g。游泳動物中軟體動物和節(jié)肢動物種類名稱及分類地位參考《中國海洋生物名錄》[18]，魚類參考《中國海洋魚類》[19]《浙江海洋魚類》[20]等文獻資料。

1.2 試驗方法

取漁獲物的肌肉組織，用雙蒸水洗去雜物，再用濾紙吸干，采用海洋動物組織DNA提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)提取基因組DNA，4 ℃保存?zhèn)溆?。利用通用引物對目的基因進行擴增，引物詳見表1。

表1 引物序列信息

PCR反應體系為25 μL：上下游引物各1 μL(10 μM)，DNA模板2 μL，金牌PCR Mix(green，北京擎科生物技術(shù)有限公司)21 μL。PCR反應程序為：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，53 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。以上試驗均設(shè)置陰性對照。取2 μL擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將單一目的條帶的PCR產(chǎn)物送到杭州擎科生物技術(shù)有限公司進行純化和雙向測定，以確保序列的可靠性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對獲得的全部序列進行人工比對并進行人工矯正，截取有效準確片段進行后續(xù)分析，將所有序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行blast序列相似性比對，采用兩兩序列間遺傳相似度>98%的為同一物種、92%～98%為同一屬、85%～91%為同一科的標準對洞頭海域的游泳生物進行種類鑒定[21-22]。然后通過MEGA 6.0[23]對序列進行排列，計算所獲序列的長度、GC含量、多態(tài)位點、簡約信息位點等參數(shù)。結(jié)合數(shù)據(jù)庫中與樣品DNA 條形碼相似度最高的序列，利用鄰接法(neighbor-joining) 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。鄰接法分支樹的可信度采用Bootstrap檢驗，經(jīng)1 000次自檢獲得分支樹節(jié)點的支持率。

2 結(jié)果和分析

2.1 基因序列

本研究共獲得29條序列，經(jīng)過比對，平均長度為666 bp，其中魚類序列共有19條，無脊椎動物10條，所有序列沒有插入、缺失堿基。保守位點316個，變異位點350個，單變異位點13個，簡約信息位點337個。T、C、A和G含量分別為31.8%、24.9%、25.1%和18.1%。

在脊椎動物(魚類)19條序列中，保守位點379個，變異位點287個，其中單變異位點30個，簡約信息位點257個。T、C、A和G含量分別為30.2%、27.1%、24.3%和18.4%。

在無脊椎動物(頭足類、甲殼類和多毛類)10條序列中，保守位點346個，變異位點320個，其中單變異位點41個，簡約信息位點279個。T、C、A和G含量分別為34.8%、20.8%、26.9%和17.5%。

2.2 序列同源性分析

將所獲得的29條有效序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行blast比對，比對結(jié)果見表2。其中魚類19種，頭足類2種，甲殼類5種，多毛類3種。共有15條序列相似度為100%，12條序列相似度為99.0%，1條序列相似度為98.8%，大于98%的序列共有28條，占所有序列的96.5%。只有長吻沙蠶(Glycerachirori)相似度為86.19%。將所有序列上傳到GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得相應的登錄號(見表2)。

表2 樣品信息

2.3 遺傳距離分析

K2P雙參數(shù)模型為生物條形碼協(xié)會(Consortium for the Barcode of Life，CBOL) 推薦的遺傳距離計算方法[24]。本研究采用K2P 雙參數(shù)模型，結(jié)合GenBank 數(shù)據(jù)庫檢索到的29條序列，統(tǒng)計試驗中樣品的種內(nèi)、種間和科間的遺傳距離，結(jié)果見表3。根據(jù)K2P 模型計算各分類階元的遺傳距離，結(jié)果顯示，硬骨魚綱的種內(nèi)遺傳距離為0.11%，種間遺傳距離為24.87%；甲殼類的種內(nèi)遺傳距離為0.24%，種間遺傳距離為23.99%；多毛類的種內(nèi)遺傳距離為0.24%，種間遺傳距離為29.47%。

表3 各個分類級別遺傳距離

2.4 系統(tǒng)進化分析

本研究構(gòu)建的NJ 樹由58條序列構(gòu)成，在種的水平上，所有序列均與GenBank中的序列聚合，與形態(tài)學鑒定結(jié)果一致。所有種類能夠聚為獨立分支，同種物種均能聚合在一起，同一物種的序列聚合后，再與同一屬的樣品序列聚合，同屬和同科的樣品序列均聚合在一起，同形態(tài)分類一致。在科以上階元中，NJ樹與形態(tài)學鑒定結(jié)果不一致，各目未能完全聚合在一起，存在一定的交叉(見圖1)。

3 討論

傳統(tǒng)的形態(tài)分類物種鑒定過度依賴于鑒定者的個人能力和經(jīng)驗，分類單元的表型可塑性也會加大錯誤識別的概率[1]。DNA條形碼方法已被證明是1種有效的物種識別工具，尤其是對于損壞、不完整或由幾個形態(tài)學上不同階段組成的標本，可以使物種鑒定過程實現(xiàn)信息化和標準化[25]。DNA 條形碼技術(shù)能夠準確地鑒定形態(tài)相似種、隱存種以及處于不同生活史階段的物種，為海洋生態(tài)調(diào)查、物種遺傳進化以及環(huán)境資源保護提供數(shù)據(jù)和支持。但是，DNA條形碼也有局限性，如在某些情況下，近緣物種序列相似度較大，可能會導致DNA條形碼無法識別而失敗。因此，DNA條形碼可以作為鑒定物種的輔助工具，但不能替代形態(tài)分類學分析[26]。本研究中，通過DNA條形碼鑒定，所鑒定的小公魚sp與島嶼小公魚(Stolephorusinsularis)的相似度為100%。但是根據(jù)《臺灣魚類志》[27]記載，島嶼小公魚(Stolephorusinsularis)分布于印度-太平洋熱帶海域，包括我國臺灣南、北、東北及西部近海，在我國東海未有記載。本次利用DNA條形碼鑒定出的島嶼小公魚(Stolephorusinsularis)值得探討，遺憾的是由于樣本個體過小，無法對其進行形態(tài)學的深入比較。出現(xiàn)該結(jié)果的原因可能有以下2個方面：一是因待測樣品同時與GenBank數(shù)據(jù)庫中其他物種序列相似度相同，即種間界限不明顯，DNA片段難以將物種間的遺傳距離拉開，因而無法做出判定，需要借助其他序列輔助來綜合判定。利用DNA 條形碼技術(shù)雖然可以快速鑒別物種，但這項技術(shù)還需要結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定方法才能獲得準確的種類序列，從而為DNA 條形碼鑒別工作累積有效的資料；另一方面，GenBank 是1個開放的共享數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)資料雖然豐富且龐大，但是其中的基因序列質(zhì)量良莠不齊，上傳者在進行形態(tài)鑒定時也可能存在偏差，導致比對的序列同源性存在偏差。為了避免此情況，在此基礎(chǔ)上應該使用其他的條形碼進行輔助鑒定。

Hebert等[5]最早提出DNA條形碼的定義，以COI基因部分DNA序列作為物種分類指標，種內(nèi)遺傳距離一定要小于種間距離，種間遺傳距離在2%以上，且是種內(nèi)遺傳距離的10 倍以上。本次研究中，硬骨魚綱的種內(nèi)遺傳距離為0.11%，種間遺傳距離為24.87%，種間遺傳距離約為種內(nèi)遺傳距離的226倍；甲殼類的種內(nèi)遺傳距離為0.24%，種間遺傳距離為23.99%，種間遺傳距離約為種內(nèi)遺傳距離的100倍；多毛類的種內(nèi)遺傳距離為0.24%，種間遺傳距離為29.47%，種間遺傳距離約為種內(nèi)遺傳距離的122倍。以上結(jié)果表明以COI基因進行游泳生物鑒定是可行的。在構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹中，所有物種都能聚為獨立分支，且以屬、科作為分類單元均能在進化樹上成功聚類，說明DNA條形碼技術(shù)能成功應用于游泳生物的鑒定。

本研究遵循：相似度>98%的序列為同一種類，90%～98%為同一屬，80%～89%為同一科的標準對洞頭海域游泳生物進行種類判定[1]。所獲物種獲得的COI基因的DNA片段與相應基因的標準DNA條形碼進行序列同源性比對，得到的比對結(jié)果相較于傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定更為精準。本研究根據(jù)DNA 條形碼的鑒定結(jié)果，共鑒定出了28種游泳生物，其中魚類19種，頭足類2種，甲殼類5種，多毛類1種，序列比對的相似度均大于98%，條形碼鑒定和形態(tài)學判別結(jié)果互相吻合，因而可精準判別樣品所屬的物種，與預期結(jié)果一致。結(jié)果表明，該方法穩(wěn)定、精準、易于操作，可應用于物種鑒定，值得推廣。

本研究中還存在一些不足的地方需要改進。例如有樣品的基因組DNA提取失敗，導致目的基因擴增失敗，無法進行后續(xù)實驗，因此未能獲得該物種的序列。該樣品在捕獲時未能及時進行冰凍保存，在鑒定時出現(xiàn)反復凍溶的情況，可能因此導致基因組DNA降解嚴重。此外，為了避免腸道內(nèi)其他生物對實驗的影響，一般只取背部肌肉來提取基因組DNA，由于一些稚魚個體較小，其肌肉組織非常少，提取過程中稍有操作不當，即導致樣品基因組DNA提取失敗，未能獲得有效的基因組DNA。在今后的研究中需對操作進行優(yōu)化，以提高實驗的檢出率。

本研究基于COI基因的DNA條形碼分析能夠識別洞頭海域的的大部分游泳生物，其鑒定結(jié)果與形態(tài)鑒定結(jié)果相吻合。DNA條形碼技術(shù)已成功應用于識別其他地理區(qū)域中的海洋魚類[1,28]。本研究建立了一個較可靠的洞頭海域的游泳生物DNA條形碼參考文庫，這將有助于更好地進行該地區(qū)的漁業(yè)監(jiān)測、海洋生物資源保護和管理。

4 結(jié)論

基于COI基因的DNA 條形碼技術(shù)將隨機選取的29個樣品中的28個樣品準確鑒定到種，表明COI基因序列適用于溫州海域游泳生物物種的分類鑒定。在形態(tài)學分類資料缺乏或樣品形態(tài)特征缺失的情況下，DNA 條形碼技術(shù)可以作為游泳生物鑒定的一種便捷有效的方式，同時可以用來對游泳生物形態(tài)學分類系統(tǒng)進行補充和修訂。

由于COI基因的突變速率相對于線粒體DNA 控制區(qū)低，在鑒定分化程度較低的物種(如圓屬)時，利用COI序列無法準確鑒定到種。為了更好地發(fā)揮DNA 條形碼技術(shù)在物種鑒定中的作用，DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫在數(shù)量和種類上亟需完善，以使物種鑒定更為精確。