外周血淋巴細(xì)胞染色體G顯帶制備方案優(yōu)化研究*

謝曉貞，陳 穎，杜 濤，張嘉寧，呂杰忠，吳夏龍，彭玉婷，李慧妍，林麗婷

中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，廣東廣州 510120

自MOORHEAD等[1]在1960年建立人外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)后，外周血染色體檢測已成為細(xì)胞遺傳學(xué)研究的重要基礎(chǔ)，染色體G顯帶長度和帶型豐富程度成為診斷染色體結(jié)構(gòu)異常的關(guān)鍵。常規(guī)染色體培養(yǎng)技術(shù)存在過程操作繁瑣、技術(shù)要求高、耗時費(fèi)力、顯帶不理想、分辨率不高等問題[2]，鑒于此，本研究在以往學(xué)者的基礎(chǔ)上，將已經(jīng)比較穩(wěn)定、成熟的一管法、同步法、一管法+同步法聯(lián)合使用，以期彌補(bǔ)常規(guī)方法的不足，以期獲得更理想的結(jié)果。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機(jī)選取2018年12月至2020年6月在本院就診的100例(包含成人與嬰幼兒)患者作為研究對象，采集靜脈血檢測。每份標(biāo)本同時采用常規(guī)法、一管法、常規(guī)法+同步法、一管法+同步法4種方法進(jìn)行比較。

1.2儀器與試劑 Chromosome Dispersion System染色體分散儀、Leica Cytovision GSL station自動掃描顯微鏡和圖像分析系統(tǒng)、二氧化碳培養(yǎng)箱、淋巴細(xì)胞培養(yǎng)瓶、RPMI1640培養(yǎng)管、細(xì)胞預(yù)處理試劑盒、秋水仙堿20 μg/mL、胰酶。

1.3細(xì)胞接種+培養(yǎng) 分別將0.5 mL肝素鈉抗凝血無菌接種于編號1(常規(guī)法)、編號2(一管法)、編號3(常規(guī)瓶法+同步法)、編號4(一管法+同步法)的培養(yǎng)瓶/管中，每組接種1支，搖勻后放入37 ℃培養(yǎng)箱。

1.4分組

1.4.1常規(guī)法 常規(guī)培養(yǎng)72 h，加入20 μg/mL秋水仙堿25 μL，作用2.5 h取出，將血液標(biāo)本轉(zhuǎn)移到編號1的離心管中并離心。

1.4.2一管法 常規(guī)培養(yǎng)72 h，加入20 μg/mL秋水仙堿25 μL，作用2.5 h取出后直接離心，不需要開瓶蓋和轉(zhuǎn)移血液標(biāo)本。

1.4.3常規(guī)法+同步法 培養(yǎng)48 h后，無菌條件下加入細(xì)胞預(yù)處理試劑盒中CS-A試劑100 μL并搖勻，靜置培養(yǎng)17 h后，在無菌條件下加入CS-B試劑并搖勻，靜置5 h后加入秋水仙堿作用2.5 h取出，將血液標(biāo)本轉(zhuǎn)移到編號3的離心管中并離心。

1.4.4一管法+同步法 培養(yǎng)48 h后，無菌條件下加入細(xì)胞預(yù)處理試劑盒中CS-A試劑100 μL并搖勻，靜置培養(yǎng)17 h后，在無菌條件下加入CS-B試劑并搖勻，靜置5 h后加入秋水仙堿作用2.5 h，取出后直接離心，不需要開瓶蓋和轉(zhuǎn)移血液標(biāo)本。

1.5細(xì)胞收獲與制片 經(jīng)常規(guī)低滲、預(yù)固定、固定、制片、吉姆薩染色，全自動染色體掃描儀選取、拍攝核型，按《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制ISCN(2016)》分析和診斷染色體核型。每組每份常規(guī)制作2張玻片。

1.6觀察指標(biāo)

1.6.1有絲分裂指數(shù) 每份標(biāo)本計(jì)數(shù)200個細(xì)胞(含M期細(xì)胞)，分別計(jì)數(shù)分裂期和非分裂期細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞分裂指數(shù)。細(xì)胞分裂指數(shù)=分裂期細(xì)胞數(shù)/全部細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6.2G顯帶≥320帶可供分析中期分裂相 工作站掃片后統(tǒng)計(jì)，每張玻片觀察100個分裂相，計(jì)數(shù)≥320帶染色體中期分裂相數(shù)目，以及不同顯帶細(xì)胞數(shù)所占比例。質(zhì)量評價(jià)條帶的選?。簠⒄铡度祟惣?xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制ISCN2016》Fig.5所示的染色體核型示意圖選取12條質(zhì)評條帶，質(zhì)評條帶可見最低分辨率以400和550條帶水平為主[3]。對同一標(biāo)本的核型分析及質(zhì)量評價(jià)均由固定的2名專業(yè)技術(shù)人員完成。

1.6.3收獲細(xì)胞數(shù) 以可制片數(shù)量評價(jià)。

1.6.4培養(yǎng)成功率 存在20個可供計(jì)數(shù)染色體核型，5個以上可供分析核型。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.14種檢測方法有絲分裂指數(shù)、收獲細(xì)胞數(shù)、培養(yǎng)成功率比較 一管法、常規(guī)法+同步法、一管法+同步法有絲分裂指數(shù)、收獲細(xì)胞數(shù)、培養(yǎng)成功率與常規(guī)法比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 4種檢測方法細(xì)胞有絲分裂指數(shù)、可制片數(shù)量和成功率比較

2.2中期分裂相比較 一管法與常規(guī)法顯帶細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);常規(guī)法+同步法G顯帶≥320帶的染色體中期分裂相數(shù)目均數(shù)較常規(guī)法明顯增加，>400～550帶核型占比達(dá)到51.1%，并且發(fā)現(xiàn)23.9%的>550帶的高分辨率核型，與常規(guī)法以上項(xiàng)目比較，差異也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；一管法+同步法與常規(guī)法以上項(xiàng)目比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表2。

注：組1為常規(guī)法G顯帶核型圖；組2為一管法G顯帶核型圖；組3為常規(guī)法+同步法G顯帶核型圖； 組4為一管法+同步法G顯帶核型圖。圖1 示例6染色體核型

表2 4種檢測方法獲得G顯帶≥320帶染色體分析

3 討 論

3.1人外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)+染色體核型分析是細(xì)胞遺傳學(xué)研究的重要手段 染色體核型分析結(jié)果的準(zhǔn)確性取決于染色體的質(zhì)量、顯帶及染色體的長度。染色體越長，帶紋越豐富，分辨率越高。因此，本研究對目前外周血染色體G顯帶制備方法進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得質(zhì)量更高的制備外周血染色體的方法。

3.2傳統(tǒng)淋巴細(xì)胞培養(yǎng) 傳統(tǒng)淋巴細(xì)胞培養(yǎng)是在有鋁蓋的玻璃瓶中進(jìn)行，收獲時需用工具撬開鋁蓋，方能將標(biāo)本轉(zhuǎn)移到做好標(biāo)記的離心管中。在此過程中，撬開瓶蓋的過程費(fèi)時、費(fèi)力，且容易造成工作人員損傷，轉(zhuǎn)移過程還有可能導(dǎo)致標(biāo)本混淆，造成醫(yī)療差錯。因此，選用一管法代替常規(guī)法，省去開蓋的步驟，不需要轉(zhuǎn)移培養(yǎng)液，杜絕了這些步驟潛在的風(fēng)險(xiǎn)，可簡化過程，提高效率[4-5]。同時，本研究對一管法與常規(guī)法在有絲分裂指數(shù)、G顯帶≥320帶染色體中期分裂相數(shù)目、收獲細(xì)胞數(shù)、培養(yǎng)成功率等進(jìn)行比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明一管法能夠獲得穩(wěn)定、理想的染色體結(jié)果。

3.3外周血染色體常規(guī)制備法 G顯帶標(biāo)準(zhǔn)為320～400條帶，但常常會造成一些異常結(jié)構(gòu)的誤診和漏診[6]。

高分辨率染色體正中期顯示400條帶，早中期顯示400～550條帶，前中期顯示550～800條帶，晚前期顯示850～1 250條帶。雖然帶紋越多越有利于進(jìn)行遺傳學(xué)分析，但帶紋越長操作越繁瑣，染色體交叉越多，也難以辨識。按照國際標(biāo)準(zhǔn)分析，500～550條帶的染色體核型已能滿足常規(guī)臨床應(yīng)用。

要盡可能多地獲得顯帶條數(shù)多、交叉較少的染色體，需要有較多分裂相及大量處于細(xì)胞分裂早中期的細(xì)胞，這在普通培養(yǎng)條件下難以實(shí)現(xiàn)。已經(jīng)有兄弟單位摸索出同步化方法處理后，使大量細(xì)胞處于分裂早期，就可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要獲得不同顯帶標(biāo)準(zhǔn)的染色體，使大多數(shù)分裂相均為500條帶左右，但又不至于過長[7]。目前這一方法愈發(fā)成熟，并且已商品化。

本研究使用的是已商品化的細(xì)胞預(yù)處理試劑盒，分為CS-A和CS-B兩種試劑，CS-A主要包含胸腺嘧啶核苷，其可逆地抑制DNA合成，將大多數(shù)細(xì)胞同步于S、G1/S期的邊界。CS-B主要包含脫氧胞苷，加入CS-B后，CS-A阻滯釋放，細(xì)胞同步進(jìn)行有絲分裂，在適當(dāng)?shù)臅r候加入秋水仙堿，可獲得早中期分裂相。

常規(guī)染色體制備，僅通過秋水仙堿處理，無法獲得足夠的G顯帶達(dá)到500條帶的染色體核型。用同步化方法制備染色體，不僅獲得了足夠的500條帶甚至550條帶以上的G顯帶染色體，而且制備出的染色體條帶清晰，外形完整。

本研究發(fā)現(xiàn)，一管法、同步法均已經(jīng)相當(dāng)穩(wěn)定、成熟，因此，如果在染色體制備中采用一管法和同步法聯(lián)合使用，既不互相干擾，又可獲得二者的優(yōu)勢，可以在臨床實(shí)踐中推廣使用。