劉延嶺，鄧 林，陶瑞霄

（四川工商職業(yè)技術學院，四川 都江堰 611830）

青稞是禾本科大麥屬的一種禾谷類作物，主要分布在我國西藏、青海、四川、云南等地，是藏族人民的主要糧食。青稞營養(yǎng)價值較高，特別是β-葡聚糖含量是普通小麥平均含量的50倍[1-3]。β-葡聚糖具有很高的營養(yǎng)保健功能，既可通過減少腸道黏膜與致癌物質的接觸，從而間接抑制致癌微生物作用的方式來預防結腸癌，又可通過降血脂和降膽固醇物質合成的方式預防心血管疾病[4-7]。

酵素是指以一種或多種新鮮蔬菜、水果、菌菇、谷物、中草藥等為原料[8]，經多種有益菌發(fā)酵而得，含有豐富的維生素、酶、礦物質和次生代謝產物等營養(yǎng)成分的功能性微生物發(fā)酵產品[9-12]。酵素產品市場前景較好，而目前以青稞為原料的酵素產品相對較少，因此，開發(fā)以青稞為原料發(fā)酵而成、具有保健功能的酵素產品具有一定的市場價值。

本研究采用高溫蒸料法處理青稞原料，通過青稞（原料）發(fā)酵，提高了熟化過程中β-葡聚糖含量。此外采用先乳酸菌發(fā)酵后紅曲霉發(fā)酵的方式，提高了紅曲霉次級代謝產物莫納可林的含量。兩種處理不僅為混合發(fā)酵提供了新的方法，同時強化了青稞酵素降血脂的保健功能，相較于現有降血脂的保健品，其適用范圍更廣，功能性更強。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

青稞：市售；乳酸菌（Lactobacillus）、紅曲霉菌（Monascus purpureus Went）：由中國科學院成都生物研究所保存。

1.1.2 儀器與設備

ZT1-02型電熱蒸煮鍋，興平市中通試驗裝備有限公司；SYQ-DSX-280B型手提式滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；DS-1型高速組織搗碎機，上海標本模型廠；SXX-103型凈化工作臺，中國蚌埠凈化設備廠；PYX-DH型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海市躍進醫(yī)療器械一廠；LRH-250型生化培養(yǎng)箱，廣州深華生物技術有限公司；XS-212-202型雙目電子顯微鏡，蘇州勝視電子設備有限公司；DHR95型可視手持折光儀，德國S+H（中國）有限公司；PHS-3D型pH計，鄭州南北儀器設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 輔助降血脂青稞酵素含片的制備

1.2.1.1 工藝流程

青稞→浸泡→磨漿→蒸料→冷卻→發(fā)酵→噴霧干燥→壓片

1.2.1.2 操作要點

篩選：選擇麥粒飽滿、硬度適中的青稞原料，篩選除雜后用循環(huán)水沖洗。

浸泡：將洗凈的青稞用2倍質量的無菌水浸泡5 h，至青稞吸水膨脹率為60%，撈出備用。

磨漿：將浸泡后的青稞與同質量的無菌水過膠體磨，磨漿后過90目篩得到青稞漿料。

蒸料：將青稞漿料于一定溫度下高壓蒸煮30 min。

冷卻：將蒸料后的青稞漿料冷卻至20℃，得青稞料液。

發(fā)酵：在冷卻后的青稞料液中加入其質量5.0%乳酸菌種子液（種子液含菌數1×106CFU/mL），靜置厭氧發(fā)酵6 d至發(fā)酵液pH為4.0，得到前發(fā)酵液。采用液體振蕩發(fā)酵法向前發(fā)酵液中加入一定量的紅曲霉菌種子液（種子液含菌數1×106CFU/mL），在一定的溫度振蕩頻率下繼續(xù)發(fā)酵，發(fā)酵8 d至發(fā)酵液黏度為4 500～5 000 cP，發(fā)酵結束。

噴霧干燥：將發(fā)酵液置于噴霧干燥設備中進行噴霧干燥。

壓片：將干燥后的青稞酵素在壓片機中按0.5 g每片進行壓片。

1.2.2 單因素試驗設計

1.2.2.1 青稞蒸煮溫度對紅曲霉發(fā)酵的影響

分別取于100、110、120、130、140℃下蒸煮得到的料漿，經乳酸菌發(fā)酵后，取100 mL發(fā)酵醪，接入其質量5.0%的紅曲霉菌（種子液含菌數1×106CFU/mL），在振蕩頻率100 r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中于30℃發(fā)酵8 d，測定成品中β-葡聚糖和莫納可林的含量。

1.2.2.2 發(fā)酵溫度對紅曲霉發(fā)酵的影響

取蒸料溫度于120℃下得到的料漿，經乳酸菌發(fā)酵后，取100 mL發(fā)酵醪，接入其質量5.0%的紅曲霉菌（種子液含菌數1×106CFU/mL），在振蕩頻率100 r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中，分別于20、25、30、35、40℃發(fā)酵8 d，測定成品中β-葡聚糖和莫納可林的含量。

1.2.2.3 振蕩頻率對紅曲霉發(fā)酵的影響

取蒸料溫度于120℃下得到的料漿，經乳酸菌發(fā)酵后，取100 mL發(fā)酵醪，接入其質量5.0%的紅曲霉菌（種子液含菌數1×106CFU/mL），在振蕩頻率50、100、150、200、250 r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中于30℃分別發(fā)酵8 d，測定成品中β-葡聚糖和莫納可林的含量。

1.2.2.4 接種量對紅曲霉發(fā)酵的影響

取蒸料溫度于120℃下得到的料漿，經乳酸菌發(fā)酵后，取100 mL發(fā)酵醪，分別接入其質量4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%的紅曲霉菌（種子液含菌數1×106CFU/mL），在振蕩頻率100 r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中于30℃發(fā)酵8 d，測定成品中β-葡聚糖和莫納可林的含量。

1.2.3 正交試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上，選取蒸煮溫度、發(fā)酵溫度、搖床轉速和接種量為主要考察因素進行L9(34)正交試驗設計，以發(fā)酵醪中的莫納可林含量作為主要評價指標，β-葡聚糖含量作為次要評價指標，其權重系數分別為60%和40%。根據綜合評分對其進行正交試驗設計分析，其中綜合評分=莫納可林含量/莫納可林含量最大值×100×60%+β-葡聚糖含量/β-葡聚糖含量最大值×100×40%。試驗因素水平如表1所示。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 不同β-葡聚糖和莫納可林含量制品的降血脂效果評價

1.2.4.1 評價方法

采用脂代謝紊亂模型——預防性給受試物法，按最優(yōu)發(fā)酵條件所制得的樣品（X）和直接混合同等劑量β-葡聚糖和莫納可林所制得的樣品（Y）進行對比。

基礎飼料為市售普通飼料。高脂飼料由78.8%基礎飼料、1%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油和0.2%膽鹽混合而成。受試飼料1由80%高脂飼料、20%樣品X混合而成。受試飼料2由80%高脂飼料、20%樣品Y混合而成。小鼠平均質量130～140 g。

1.2.4.2 主要實施步驟

用基礎飼料喂養(yǎng)大鼠7 d后，空腹過夜取尾血，測血清總膽固醇（TC）、血清甘油三酯（TG）、血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C），根據TC水平隨機分為4組，每組10只。

在X、Y兩個樣品的基礎上，另設一個高脂模型對照組和一個基礎飼料對照組。經口給予受試物，灌胃量10 mL/kg BW。連續(xù)給予30 d。

試驗期內兩個受試組給予受試飼料1和受試飼料2，高脂模型對照組給予高脂飼料，基礎飼料對照組給予基礎飼料。于試驗結束禁食16 h后取血，測血清TC、TG、HDL-C三項指標。

1.2.5 測定項目與方法

β-葡聚糖含量：按NT/Y 2006—2011《谷物及其制品中β-葡聚糖含量的測定》[13]中的方法進行測定。

莫納可林含量：將不同條件下的發(fā)酵原液置于60℃干燥至恒重，研磨過80目篩，取5 g樣品，用100 mL乙醇索氏提取器提取1 h，減壓濃縮至5 mL，過濾，清液為待分析樣品。采用高效液相色譜法[14]測定。

1.2.6 數據處理

試驗數據以測定3次得到的xˉ±s表示。采用Origin 8.0進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 蒸煮溫度對紅曲霉發(fā)酵的影響

熟化可以讓組織變軟，利于后期發(fā)酵，但由于熟化溫度不夠，淀粉等大分子物質也會分解不完全，對于青稞產品，則不利于β-葡聚糖的累積。由圖1可見，隨著蒸煮溫度的升高，β-葡聚糖含量和莫納可林含量均呈現增加的趨勢，且在110～120℃時隨著溫度的升高，其含量增長較快，說明在此階段溫度的升高對青稞中有效成分溶出的影響很大，但從120～130℃增速緩慢，130～140℃增速趨于平緩，說明此階段有效成分已經趨于飽和，再升高溫度影響不大，且會增加成本。

圖1 蒸煮溫度對紅曲霉發(fā)酵的影響Fig.1 Effects of cooking temperatures on fermentation of Monascus purpureus Went

2.1.2 發(fā)酵溫度對紅曲霉發(fā)酵的影響

由圖2可見，β-葡聚糖含量和莫納可林含量隨著發(fā)酵溫度的升高，呈現先增加后降低的趨勢，其中當發(fā)酵溫度為35℃時，β-葡聚糖和莫納可林的含量達到最大，分別為6.12%和2.96 mg/g。

圖2 發(fā)酵溫度對紅曲霉發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of fermentation temperatures on fermentation of Monascus purpureus Went

2.1.3 振蕩頻率對紅曲霉發(fā)酵的影響

由圖3可知，隨著振蕩頻率的增大，β-葡聚糖和莫納可林含量呈現先增加后降低的趨勢。紅曲霉菌為好氧型絲狀霉菌，發(fā)酵液中的氧氣含量直接影響紅曲霉的生長和次級代謝產物的合成，因此在發(fā)酵過程中不斷通入氧氣有利于其生長和代謝產物的蓄積，但是轉速過高時會產生一定的剪切力，殺傷紅曲霉，造成其代謝產物產量下降[15]。當振蕩頻率為150 r/min時，β-葡聚糖和莫納可林的含量達到最高值，分別為6.15%和2.95 mg/g。

圖3 振蕩頻率對紅曲霉發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of oscillatory frequency on fermentation of Monascus purpureus Went

2.1.4 接種量對紅曲霉發(fā)酵的影響

由圖4可見，隨著接種量的增大，β-葡聚糖和莫納可林含量呈現先增加后降低的趨勢，其中在接種量為6%時達到最大，此時β-葡聚糖含量為6.27%，莫納可林含量為3.12 mg/g。這可能是由于在接種量小時，營養(yǎng)物質豐富適合微生物的生長繁殖，但是其基數小，不利于次級產物的積累，接種量大時，受限于霉菌本身的特性，次級代謝產物的產量只會在最大值處波動，且后期的代謝產物會對莫納可林的積累產生阻遏作用。

圖4 接種量對紅曲霉發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of inoculation amounts on fermentation of Monascus purpureus Went

2.2 正交優(yōu)化試驗結果

根據單因素試驗的結果，為獲得最佳紅曲霉菌發(fā)酵條件，選取蒸煮溫度、發(fā)酵溫度、振蕩頻率和接種量為主要考察因素進行L9(34)正交試驗設計，以發(fā)酵醪中的莫納可林含量作為主要評價指標，β-葡聚糖作為次要評價指標，其權重系數分別為60%和40%。正交試驗結果如表2所示。

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal test results

由表2可見，最優(yōu)條件為A2B2C2D2，即蒸煮溫度120℃，發(fā)酵溫度30℃，振蕩恒溫培養(yǎng)箱的搖床轉速150 r/min，接種量6%。由極差R值可以看出，4個因素影響順序由大到小為：A＞C＞B＞D，即蒸煮溫度＞振蕩恒溫培養(yǎng)箱的搖床轉速＞發(fā)酵溫度＞接種量，并且蒸煮溫度為最主要影響因素。

在此最佳條件下做驗證試驗，得到β-葡聚糖和莫納可林的含量達到最高值，分別為6.32%和3.15 mg/g。

2.3 不同β-葡聚糖和莫納可林含量制品的降血脂效果評價

β-葡聚糖和莫納可林含量制品飼養(yǎng)小鼠后的降血脂效果見表3和表4。

由表3與表4分析可知，高脂飼料組小鼠的體重、TG和TC顯著高于基礎飼料組（P＜0.05），受試飼料1、受試飼料2與基礎飼料組相比，各指標間的顯著差異性各有不同。但從整體上看，受試飼料2組在降低小鼠甘油三酯、總膽固醇以及提高高密度脂蛋白膽固醇上不如受試飼料1組好，說明采用最優(yōu)發(fā)酵條件所制得的產物制作的青稞酵素含片，比直接混合β-葡聚糖和莫納可林效果好。

表3 不同β-葡聚糖和莫納可林含量制品對小鼠體重的影響Table 3 Effects of differentβ-glucan and monacolin contents products on body weights of mice 單位：g

表4 不同β-葡聚糖和莫納可林含量制品對小鼠甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇的影響Table 4 Effects of differentβ-glucan and monacolin contents products on TG,TC and HDL-C contents of mice 單位：mmol/L

3 結論

（1）采用先乳酸菌發(fā)酵后紅曲霉發(fā)酵的方式，通過乳酸菌發(fā)酵對環(huán)境的改變，為紅曲霉提供最適發(fā)酵條件，提高了紅曲霉次級代謝產物莫納可林含量。其次級代謝產物莫納可林有降膽固醇、降血脂的作用。因此，發(fā)酵過程引入紅曲霉進行發(fā)酵，將會強化青稞的降血脂功能。

（2）乳酸菌發(fā)酵產物可促進腸胃蠕動，增進吸收；同時，也有一定的降血脂功能。最重要的是，乳酸菌發(fā)酵可調節(jié)發(fā)酵液pH，為紅曲霉的生長提供有利的環(huán)境，所以，利用乳酸菌和紅曲霉發(fā)酵是必要的。同時，這種前者發(fā)酵產物作為后者發(fā)酵條件的工藝是一種新的嘗試，為混合發(fā)酵提供了新的方法。

（3）紅曲霉發(fā)酵的最佳條件為：蒸煮溫度120℃，發(fā)酵溫度30℃，振蕩恒溫培養(yǎng)箱的搖床轉速150 r/min，接種量6%。在此工藝下得到的β-葡聚糖和莫納可林的含量達到最高值，分別為6.32%和3.15 mg/g。在此條件下制作的青稞酵素含片，比直接混合β-葡聚糖和莫納可林的降脂效果好。