冬凌草甲素上調(diào)PLK1對Jurkat細胞細胞周期的影響

赫瑋，左勇

上海交通大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子細胞生物學系，上海200025

Polo樣蛋白激酶1（Polo-like kinase 1，PLK1）是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其蛋白水平具有嚴格的細胞周期依賴性。激活PLK1可通過誘導細胞周期蛋白-細胞周期素依賴蛋白激酶B（CDK1-cyclin B）復合物去磷酸化、磷酸化細胞質(zhì)接頭蛋白170（cytoplasmic linker protein-170，Clip-170）調(diào)節(jié)其與微管的結合［1］，磷酸化并激活后期促進復合物/環(huán)體（anaphase-promoting complex/cyclosome，APC/C）［2］等機制促進細胞G2/M期轉換、有絲分裂以及胞質(zhì)分裂。由于PLK1參與多種關鍵的細胞周期事件，因此成為癌癥治療藥物研發(fā)的靶標之一。

急性T淋巴細胞白血?。╝cute T-1ymphocytic leukemia，T-ALL）是T淋巴母細胞增殖異常導致的一種血液疾病，臨床發(fā)病率達1.7/10萬［3］。T-ALL患者主要表現(xiàn)為血原始細胞計數(shù)較高、縱隔腫塊及中樞神經(jīng)浸潤。T-ALL細胞具有高侵襲性，其惡性行為與細胞增殖失控等原因密不可分［4］。目前，中醫(yī)藥治療白血病的研究不斷發(fā)展。與傳統(tǒng)化學治療藥物相比，中藥天然產(chǎn)物的毒副反應較小，且不易出現(xiàn)耐藥性。冬凌草甲素（oridonin）是一種貝殼杉烯二萜，體外實驗發(fā)現(xiàn)可通過不同機制明顯抑制白血病等多種腫瘤的細胞生長［5］。研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲能通過Fas/Fasl通路調(diào)控細胞色素C的釋放，從而誘導U937細胞凋亡［5］；能選擇性剪切t(8；21)M2b白血病細胞的原癌蛋白AML-ETO而發(fā)揮治療作用［6］。Jurkat細胞目前常被用于T-ALL的體外研究，我們以Jurkat細胞為模型，研究冬凌草甲素對T-ALL的抑制作用及機制，為冬凌草甲素應用于靶向治療T-ALL提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要細胞與質(zhì)粒人急性T淋巴細胞白血病Jurkat細胞和人腎皮質(zhì)上皮細胞293T（上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院北部實驗中心保存）。pCMV-flag-PLK1質(zhì)粒（北京義翹神州生物技術有限公司），psPAX2、pMD2.G質(zhì)粒、pCMV-Δ8.91（上海交通大學基礎醫(yī)學院病理生理學教研室惠贈）。

1.1.2主要試劑RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基（上海富衡生物科技有限公司），胎牛血清、0.25%胰蛋白酶（Gibco，美 國），Lipofectamine 3000轉 染 試 劑（Invitrogen，美國），冬凌草甲素（辰光生物科技有限公司），細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒、高保真DNA聚合酶（上海翊圣生物科技有限公司），瑞士吉姆薩染色液（珠海貝索生物技術有限公司），CCK-8試劑盒（Dojindo，日本），BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），PLK1抗體、WEE1抗體（Santa Cruz，美國），GAPDH抗體（上?？党巧锕こ逃邢薰荆珺ubR1抗體、Bub1抗體、Aurora A抗體、Aurora B抗體、HSP90抗體、CDC25c抗體、CDC27抗體（Abcam，英國），Ub抗體（Cell Signaling Technology，美國），Anti-FLAG M2 Magnetic Beads（Sigma，美國），辣根過氧化物酶標記的抗兔/抗鼠二抗（Jackson ImmunoResearch，美國），化學發(fā)光試劑盒（Millipore，美國），Cocktail（Biotool，瑞士），MG132（Selleck，美國）。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)Jurkat細胞和293T細胞于37℃、5%CO2條件下用含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞融合度達80%左右時進行傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2流式細胞術檢測細胞周期收集待測細胞，用預冷磷酸緩沖液（phosphate butter saline，PBS）洗滌3遍，重懸細胞于1 mL PBS中，邊振蕩邊逐滴加入3 mL無水乙醇，-20℃固定過夜。次日離心后棄上清液，每個樣品中加入0.5 mL配置好的碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液，37℃避光孵育30 min，用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.3流式細胞術檢測細胞凋亡情況收集待測細胞，用預冷PBS洗滌3次，棄上清。用100μL 1×binding buffer重懸細胞，加入5μL Annexin V-Alexa Fluor488和10μL PI，避 光、室 溫 孵 育15 min后 加 入400μL 1×binding buffer，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.4蛋白質(zhì)印跡法檢測各蛋白表達收集待測細胞，用預冷PBS洗滌3次，加入SDS細胞裂解液提取細胞總蛋白，收集上清后用聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchonininc acid，BCA）法測定蛋白濃度。各樣品加入上樣緩沖液后取40μg進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后將蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入稀釋后的一抗4℃孵育過夜。TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，再次用TBST洗膜，用化學發(fā)光成像系統(tǒng)掃膜成像，定量分析目的蛋白。

1.2.5瑞士吉姆薩染色收集待測細胞，用預冷PBS洗滌后充分吹打混勻，制作細胞涂片。加入50μL瑞士吉姆薩染色A液等待1 min，加入100μL瑞士吉姆薩染色B液等待10 min，用自來水從玻片一端輕輕沖洗干凈后晾干，光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2.6 CCK-8檢測細胞增殖情況待測細胞接種于96孔板中，接種濃度為每孔細胞2×105/100μL，分別加入終濃度為0、1、5、10、20、40μmol/L的冬凌草甲素（每個濃度設3個復孔）。將96孔板轉移至37℃恒溫、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每孔加入10μL CCK-8試劑，37℃孵育2 h，酶標儀測定每孔吸光度值（D）。生長率（%）=（處理孔D值-空白孔D值）/（對照孔D值-空白孔D值）×100%。

1.2.7免疫沉淀收集待測細胞，用預冷PBS洗滌3次，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，裂解細胞后收集的上清液取1/20用于對照input，其余用于免疫沉淀。清洗磁珠，在清洗后的磁珠中加500μL稀釋后的樣本，4℃翻轉孵育過夜。過夜后的樣品用RIPA裂解液洗滌3次，加入1×SDS裂解液，100℃煮樣10 min，EP管中的上清可用于Western blotting分析。

1.2.8細胞熱力學遷移實驗收集待測細胞，用預冷PBS洗滌3次，用PBS重懸細胞沉淀，按1∶100比例加入Cocktail，用液氮反復凍融裂解細胞。在細胞裂解液中加入DMSO或終濃度為100μmol/L的冬凌草甲素，溫度梯度孵育后收集蛋白樣品用于Western blotting分析。

重復以上步驟裂解待測細胞，在細胞裂解液中加入不同終濃度的冬凌草甲素，孵育后收集蛋白樣品用于Western blotting分析。

1.2.9分子對接在Swiss-TargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）網(wǎng)站繪制冬凌草甲素的3D結構，對接前用AUTODOCK（4.2版）軟件預處理冬凌草甲素3D結構并設置為對接配體，預處理PLK1蛋白質(zhì)分子3D結構并設置為接的大分子。設置對接參數(shù)后將兩者對接，用PyMOL軟件進行分析對接結果。

1.2.10構建PLK1突變質(zhì)粒設計PLK1蛋白Cys67或Cys133位點突變引物（表1），由上海生工生物工程有限公司合成。以pCMV-flag-PLK1質(zhì)粒為模板進行反應及重組，轉化并測序后獲得Cys67位點突變質(zhì)粒pCMVflag-PLK1-M1與Cys133位點突變質(zhì)粒pCMV-flag-PLK1-M2。

表1 PLK1蛋白Cys67位點（M1）及Cys133位點（M2）突變引物序列（5′→3′）Tab 1 Cys67（M1）and Cys133（M2）mutation primers of PLK1 protein sequence（5′→3′）

1.3 統(tǒng)計學分析

用GraphPad Prism 8.0.2軟件對數(shù)據(jù)進行作圖與統(tǒng)計分析，各組間數(shù)據(jù)使用t檢驗，符合正態(tài)分布的定量資料用x±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 冬凌草甲素抑制Jurkat細胞增殖

CCK-8法檢測冬凌草甲素對Jurkat細胞增殖情況的影響，觀察到10μmol/L濃度冬凌草甲素即可顯著抑制Jurkat細胞增殖（圖1A）。我們選擇低濃度冬凌草甲素處理Jurkat細胞24 h，用流式細胞術檢測Jurkat細胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)低劑量冬凌草甲素不誘導Jurkat細胞發(fā)生凋亡（圖1B）。以上結果顯示冬凌草甲素可抑制Jurkat細胞增殖，且低劑量冬凌草甲素不誘導Jurkat細胞凋亡。

2.2 冬凌草甲素誘導Jurkat細胞G2/M期阻滯

用冬凌草甲素處理Jurkat細胞24 h，細胞經(jīng)PI染色后用流式細胞術檢測細胞周期，結果顯示當冬凌草甲素濃度達6μmol/L和8μmol/L時，處于G2/M期的Jurkat細胞顯著增多（圖2A、B）；用6μmol/L冬凌草甲素處理Jurkat細胞，發(fā)現(xiàn)6μmol/L冬凌草甲素作用12 h后，G2/M期Jurkat細胞數(shù)即開始增加并持續(xù)至加藥后48 h（圖2C、D）。上述結果表明冬凌草甲素可誘導Jurkat細胞發(fā)生G2/M期阻滯。

為深入觀察冬凌草甲素對Jurkat細胞有絲分裂的影響，我們用濃度為6μmol/L的冬凌草甲素處理Jurkat細胞24 h，瑞士吉姆薩染色結果顯示冬凌草甲素處理后，有絲分裂期的細胞數(shù)量顯著增加，表現(xiàn)為細胞核體積增大，染色質(zhì)濃縮為染色體，染色單體分離（圖2E）。在Jurkat細胞加入濃度為6μmol/L冬凌草甲素，0、12、24 h分別提取總蛋白并用Western blotting方法檢測cyclin B蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素可使cyclin B表達升高（圖2F）。以上實驗結果均表明冬凌草甲素可誘導Jurkat細胞發(fā)生G2/M期阻滯。

圖2低劑量冬凌草甲素處理Jurkat細胞后對細胞周期的影響Fig 2 Effect of low concentration oridonin on the cell cycle in Jurkat cells

2.3 冬凌草甲素上調(diào)Jurkat細胞PLK1蛋白水平

細胞周期事件的發(fā)生受到細胞周期蛋白的調(diào)控，許多蛋白激酶在細胞周期的不同階段催化不同的細胞周期蛋白發(fā)生磷酸化，促發(fā)細胞周期進程。我們以“mitosis”為關鍵詞檢索Genecards數(shù)據(jù)庫獲取與有絲分裂相關的基因信息，檢索結果顯示有7 690個基因可能參與調(diào)控有絲分裂，我們選取排名靠前的5個蛋白激酶BuBR1、BuB1、PLK1、Aurora A、Aurora B展開研究（表2）。用濃度為6μmol/L的冬凌草甲素處理Jurkat細胞12和24 h后，檢測細胞中BuBR1、BuB1、PLK1、Aurora A、Aurora B蛋白的表達情況。Western blotting結果顯示冬凌草甲素處理后，PLK1蛋白表達顯著增加，而其他4種蛋白的表達量未發(fā)生明顯變化（圖3）。鑒于PLK1蛋白和細胞周期調(diào)控的密切關系，我們推測冬凌草甲素通過上調(diào)PLK1誘導Jurkat細胞發(fā)生有絲分裂阻滯。

表2 Genecards數(shù)據(jù)庫中檢索與有絲分裂相關的基因信息Tab 2 Searching the Genecards database with"mitosis"as key word

圖3低劑量冬凌草甲素對有絲分裂相關蛋白激酶表達的影響Fig 3 Effect of low concentration oridonin on the expression of mitosis-related kinase

2.4 冬凌草甲素促進PLK1下游蛋白磷酸化

細胞周期蛋白BuBR1、CDC25c、CDC27的磷酸化和活性受PLK1調(diào)控，我們通過檢測這些蛋白的磷酸化水平來反映PLK1的活性。分別用6μmol/L冬凌草甲素和274 ng/mL的PLK1激動劑Noc處理Jurkat細胞，于0、6、12、18、24 h提取細胞總蛋白，用Western blotting方法檢測PLK1下游蛋白BuBR1、CDC25c、CDC27的磷酸化情況。因為BuBR1、CDC25c、CDC27的磷酸化抗體效果不佳，我們選用以上激酶的總蛋白抗體進行檢測。結果顯示：用Noc處理Jurkat細胞后，PLK1下游蛋白的磷酸化水平隨藥物處理時間的增加而加強；6μmol/L冬凌草甲素誘導PLK1下游蛋白磷酸化水平在12 h達高峰，之后隨時間延長其磷酸化水平略有降低，但始終高于未加入冬凌草甲素的對照組（圖4A）。此結果表明冬凌草甲素可上調(diào)PLK1蛋白激酶活性。

WEE1是細胞周期依賴性激酶CDK1的抑制性激酶，WEE1被PLK1磷酸化后經(jīng)泛素化修飾降解。我們也檢測了WEE1的蛋白含量，結果顯示W(wǎng)EE1蛋白含量在冬凌草甲素處理12 h后顯著減少（圖4B），表明冬凌草甲素上調(diào)PLK1活性。

圖4冬凌草甲素對PLK1下游蛋白磷酸化水平的影響Fig 4 Effect of oridonin on the phosphorylation level of PLK1 downstream protein

2.5 冬凌草甲素抑制PLK1蛋白發(fā)生泛素化修飾和蛋白酶體途徑降解

研究表明PLK1在細胞有絲分裂完成后通過泛素化修飾和蛋白酶體途徑降解，我們進一步對冬凌草甲素是否通過抑制PLK1蛋白的泛素化修飾和蛋白酶體途徑降解來維持蛋白的穩(wěn)定性進行探討。

我們在PLK1過表達的293T細胞中分別加入濃度為0、10、20、50μmol/L的冬凌草甲素，處理24 h后通過免疫共沉淀實驗獲得外源性表達的Flag-PLK1蛋白，通過Western blotting方法檢測PLK1泛素化修飾水平的改變。結果顯示冬凌草甲素抑制了Flag-PLK1蛋白的泛素化修飾，并呈現(xiàn)濃度依賴效應（圖5）。

圖5冬凌草甲素對PLK1蛋白泛素化修飾水平的影響Fig 5 Effect of oridonin on the level of ubiquitination modification for PLK1 protein

2.6 冬凌草甲素可直接與PLK1蛋白結合

我們運用細胞熱力學遷移實驗檢測冬凌草甲素對PLK1蛋白的熱穩(wěn)定性的影響，以推斷冬凌草甲素是否與PLK1形成復合物。我們在Jurkat細胞裂解液中加入DMSO或終濃度為100μmol/L的冬凌草甲素室溫孵育30 min，分別在45.0、46.7、49.3、52.5、56.9、60.2℃孵育3 min后，Western blotting檢測不同溫度條件下冬凌草甲素對PLK1的蛋白量的影響。發(fā)現(xiàn)在45.0、46.7、49.3、52.5、56.9、60.2℃處理溫度下，PLK1蛋白量減少，說明冬凌草甲素能通過與PLK1形成復合物而降低PLK1的熱穩(wěn)定性（圖6A、B）。

由于46.7℃孵育后冬凌草甲素對PLK1蛋白的穩(wěn)定性影響最大，我們進一步用46.7℃進行熱處理，探討不同濃度冬凌草甲素對PLK1蛋白穩(wěn)定性的影響，驗證冬凌草甲素是否與PLK1蛋白直接結合。在Jurkat細胞裂解液中加入DMSO或終濃度為12.5、25.0、50.0、100.0、200.0μmol/L的冬凌草甲素，46.7℃孵育后Western blotting檢測PLK1蛋白含量。結果顯示，與加入DMSO的對照組相比，PLK1蛋白穩(wěn)定性與冬凌草甲素濃度負相關（圖6C、D）。以上結果證明冬凌草甲素可與PLK1蛋白直接結合。

2.7 冬凌草甲素與PLK1蛋白質(zhì)分子對接

圖6不同溫度或濃度條件下冬凌草甲素對PLK1穩(wěn)定性的影響Fig 6 Effect of oridonin on the stability of PLK1 under different temperatures or concentration

通過檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank，PDB），我們獲得PLK1蛋白與其ATP競爭型抑制劑BI2536的復合物 結 構（PDB編 號：2RKU，圖7A）。我 們 使 用AUTODOCK軟件（4.2版）模擬冬凌草甲素與PLK1蛋白（PDB編號：2RKU）的對接情況（圖7B），經(jīng)PyMOL軟件分析對接結果，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素與PLK1復合物的對接能量為-31.1 J/mol，在對接口袋中PLK1蛋白有2個半胱氨酸殘基（Cys67和Cys133）與冬凌草甲素相距較近，可能會形成共價鍵。由此推測，PLK1蛋白Cys67或Cys133位點對PLK1與冬凌草甲素直接結合發(fā)揮重要作用。

圖7冬凌草甲素與PLK1對接位點預測Fig 7 Prediction of the docking site of oridonin and PLK1

2.8 PLK1蛋白上Cys67或Cys133位點參與冬凌草甲素與PLK1蛋白直接結合且上調(diào)PLK1蛋白穩(wěn)定性

通過分析冬凌草甲素與PLK1蛋白質(zhì)分子對接模型，我們推測PLK1蛋白氨基酸殘基Cys67或Cys133可能對PLK1與冬凌草甲素直接結合發(fā)揮重要作用，故通過定點突變的方法構建Cys67、Cys133位點突變?yōu)樯彼岬耐蛔冑|(zhì)粒。分別在轉染pCMV-flag-PLK1、pCMV-flag-PLK1-M1、pCMV-flag-PLK1-M2質(zhì)粒的239T細胞裂解液中加入DMSO或濃度為200μmol/L的冬凌草甲素，經(jīng)46.7℃孵育后Western blotting檢測結果顯示突變后每組Flag-PLK1蛋白的表達量無明顯變化（圖8A、B），即PLK1蛋白分子的氨基酸殘基Cys67或Cys133突變后，冬凌草甲素不再誘導PLK1蛋白穩(wěn)定性發(fā)生變化，提示冬凌草甲素不再與PLK1蛋白直接結合。

我們在轉染野生型及突變型質(zhì)粒的293T細胞中分別加入濃度為0或50μmol/L的冬凌草甲素，24 h后收集蛋白裂解液經(jīng)免疫沉淀獲得外源性表達的PLK1蛋白，通過Western blotting方法檢測冬凌草甲素對其泛素化修飾水平的影響。結果顯示Cys67位點或Cys133位點突變后，冬凌草甲素對PLK1泛素化修飾的抑制顯著減弱（圖8C），提示PLK1蛋白上Cys67或Cys133位點參與冬凌草甲素上調(diào)PLK1蛋白穩(wěn)定性。

圖8 PLK1蛋白突變后冬凌草甲素對PLK1穩(wěn)定性的影響Fig 8 Effect of oridonin on the stability of PLK1 after mutation

3 討論

近年來，用傳統(tǒng)中藥治療T-ALL，對其有效天然產(chǎn)物進行驗證并進行結構改造及增效，正逐漸引起廣泛關注。來自中藥的天然產(chǎn)物因其不良反應少、作用確切等諸多優(yōu)勢而成為抗腫瘤藥物的研究熱點［7］。冬凌草甲素是冬凌草的有效活性成分，分子中與環(huán)外亞甲基共軛的環(huán)戊酮結構是發(fā)揮藥理作用的活性中心。冬凌草甲素對急性白血病、胰腺癌、乳腺癌等有抑制腫瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡的作用［8-11］，且其毒性低，對骨髓、肝、腎等無明顯損傷［12］，提示冬凌草甲素是較好的抗腫瘤候選藥物之一。

有研究［13］報道冬凌草甲素可通過抑制NF-κB通路或下調(diào)Brg1抑制Jurkat細胞增殖。Dal Piaz等［14］用蛋白質(zhì)組學方法研究發(fā)現(xiàn)，在Jurkat細胞中，冬凌草甲素可以直接與Hsp70-1A結合并使之結構發(fā)生改變而無法與下游靶標結合，最終產(chǎn)生抗腫瘤作用。我們的研究結果顯示，冬凌草甲素可抑制Jurkat細胞增殖，且低劑量冬凌草甲素誘導Jurkat細胞發(fā)生G2/M期阻滯。

PLK1最早在黑腹果蠅的基因組中被發(fā)現(xiàn)，其蛋白水平和活性在細胞周期進程中受到精確調(diào)控，在G1期幾乎檢測不到PLK1蛋白，在S期PLK1蛋白開始累積，于G2末期達到峰值，M期維持高水平，分裂完成后急劇下降［15］。由于PLK1參與各種關鍵的細胞周期事件，因此被認為是有效的癌癥治療藥物靶標之一。我們發(fā)現(xiàn)低劑量冬凌草甲素誘導Jurkat細胞阻滯在有絲分裂期，由此我們猜測冬凌草甲素可能直接調(diào)控了有絲分裂相關的激酶。Genecards數(shù)據(jù)庫檢索結果顯示，BuBR1、BuB1、PLK1、Aurora A、Aurora B是評分最高的調(diào)控有絲分裂的蛋白激酶，且BuBR1、PLK1、Aurora A和Aurora B蛋白都能發(fā)生泛素化修飾降解，從而快速調(diào)控其在有絲分裂期中的蛋白量［16］。我們用冬凌草甲素處理Jurkat細胞，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素可上調(diào)PLKl蛋白量且上調(diào)其活性，而另4種蛋白激酶的含量無變化，提示PLK1可能是冬凌草甲素的另一個作用靶點。

泛素-蛋白酶體途徑（ubiquitin proteasome pathway，UPP）可降解細胞內(nèi)超過80%的正?；虍惓５鞍踪|(zhì)，是一種具有高度特異性和選擇性的蛋白質(zhì)降解途徑［17］，泛素化過程與幾乎所有細胞生理活動相關，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的異常調(diào)控會導致腫瘤等各種疾病的發(fā)生［18］。蛋白質(zhì)通過泛素化途徑降解或者通過抑制泛素化降解導致蛋白累積是快速調(diào)控蛋白水平的途徑，也是細胞周期進程中調(diào)控細胞周期依賴性蛋白水平的重要方式。我們的研究不僅發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素處理Jurkat細胞24 h后PLK1蛋白含量始終維持高水平，且揭示冬凌草甲素可抑制PLK1蛋白的泛素化修飾，這可能是提高PLK1蛋白穩(wěn)定性的主要機制。

細胞裂解液中各不同靶蛋白都有各自獨特的熔解曲線。Martinez Molina等［19］將臨床藥物作用于細胞裂解液，發(fā)現(xiàn)如藥物可與靶蛋白結合，則可觀察到靶蛋白的熔解曲線發(fā)生明顯移動，由此設計細胞熱力學遷移實驗（celluar thermal shift assay，CETSA）。結合后形成的復合物會改變靶蛋白原來的熱穩(wěn)定性，使其在一定溫度范圍內(nèi)更穩(wěn)定或更容易降解，通過這種穩(wěn)定性的差異，我們可以判斷小分子化合物和靶蛋白能形成復合物［20-21］。CETSA的結果證明冬凌草甲素可與PLK1蛋白直接結合。雖然我們初步證實冬凌草甲素能和PLK1直接作用，但是我們也不排除冬凌草甲素通過抑制特異性泛素連接酶E3來抑制PLK1的泛素化修飾和降解。

為進一步驗證冬凌草甲素可與PLK1蛋白結合，我們通過定點突變的方法分別構建PLK1蛋白氨基酸殘基Cys67、Cys133位 點 突 變 的pCMV-flag-PLK1-M1和pCMV-flag-PLK1-M2質(zhì)粒并轉染293T細胞，獲得外源性表達的突變型PLK1蛋白。CETSA結果顯示冬凌草甲素不再誘導Cys67或Cys133位點突變后的PLK1蛋白含量發(fā)生變化，提示Cys67或Cys133位點在冬凌草甲素與PLK1直接結合中起核心作用。我們繼續(xù)深入探索Cys67、Cys133位點對冬凌草甲素處理后PLK1蛋白穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)以上位點突變后可逆轉冬凌草甲素誘導的PLK1泛素化修飾水平下調(diào)，提示冬凌草甲素與PLK1的直接結合受抑制，證實Cys67和Cys133位點是PLK1與冬凌草甲素結合的關鍵位點。

綜上所述，冬凌草甲素可誘導Jurkat細胞發(fā)生G2/M期阻滯以抑制細胞增殖。進一步探究其機制，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素可上調(diào)PLK1蛋白含量并通過直接與PLK1蛋白結合而抑制其泛素化降解，從而增強PLK1蛋白穩(wěn)定性。經(jīng)計算機模擬及體外實驗驗證，我們發(fā)現(xiàn)PLK1蛋白的Cys67和Cys133位點是PLK1蛋白與冬凌草甲素結合的關鍵位點。

參·考·文·獻

[1]Whibley C,Pharoah PDP,Hollstein M.p53 polymorphisms:cancer implications[J].Nat Rev Cancer,2009,9(2):95-107.

[2]Nasmyth K.Segregating sister genomes:the molecular biology of chromosome separation[J].Science,2002,297(5581):559-565.

[3]Cao PF,Yu YL,Wang W,et al.Fluorescence in situ hybridization comparison of the prognostic factors in adult and pediatric acute lymphoblastic leukemia:a retrospective analysis of 282 cases[J].Exp Ther Med,2018,16(6):4674-4684.

[4]Han QG,Xu X,Li J,et al.GATA4 is highly expressed in childhood acute lymphoblastic leukemia,promotes cell proliferation and inhibits apoptosis by activating BCL2 and MDM2[J].Mol Med Rep,2017,16(5):6290-6298.

[5]郭勇,單卿卿,龔玉萍,等.冬凌草甲素抗Ph染色體陽性急性淋巴細胞白血病效應的實驗研究[J].中華血液學雜志,2012,33(6):439-443.

[6]Zhen T,Wu CF,Liu P,et al.Targeting of AML1-ETO in t(8;21)leukemia by oridonin generates a tumor suppressor-like protein[J].Sci Transl Med,2012,4(127):127ra38.

[7]Moreau P,Attal M,Facon T.Frontline therapy of multiple myeloma[J].Blood,2015,125(20):3076-3084.

[8]Li FF,Yi S,Wen L,et al.Oridonin induces NPM mutant protein translocation and apoptosis in NPM1c+acute myeloid leukemia cells in vitro[J].Acta Pharmacol Sin,2014,35(6):806-813.

[9]Gui ZF,Luo F,Yang YY,et al.Oridonin inhibition and miR-200b-3p/ZEB1 axis in human pancreatic cancer[J].Int J Oncol,2017,50(1):111-120.

[10]Xu B,Shen W,Liu X,et al.Oridonin inhibits BxPC-3 cell growth through cell apoptosis[J].Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai),2015,47(3):164-173.

[11]齊琦,張配,李其響,等.冬凌草甲素誘導三陰乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡及對細胞內(nèi)活性氧水平的影響[J].中國中藥雜志,2017,42(12):2361-2365.

[12]張覃沐.一種新的抗癌物質(zhì)冬凌草素[J].科學通報,1978,23(1):53-54.

[13]葉珍珍,薛飛龍,丁文評,等.冬凌草甲素通過下調(diào)Brg1表達抑制Jurkat細胞生長[J].中國當代兒科雜志,2017,19(11):1208-1212.

[14]Dal Piaz F,Cotugno R,Lepore L,et al.Chemical proteomics reveals HSP70 1A as a target for the anticancer diterpene oridonin in Jurkat cells[J].J Proteomics,2013,82:14-26.

[15]Lee KS,Yuan YL,Kuriyama R,et al.Plk is an M-phase-specific protein kinase and interacts with a kinesin-like protein,CHO1/MKLP-1[J].Mol Cell Biol,1995,15(12):7143-7151.

[16]Park J,Kwon MS,Kim EE,et al.USP35 regulates mitotic progression by modulating the stability of Aurora B[J].Nat Commun,2018,9(1):688.

[17]Wang JS,Maldonado MA.The ubiquitin-proteasome system and its role in inflammatory and autoimmune diseases[J].Cell Mol Immunol,2006,3(4):255-261.

[18]俞卿,熊秀芳,孫毅.靶向Cullin-RING E3泛素連接酶的抗腫瘤策略及相關藥物研發(fā)進展[J].浙江大學學報(醫(yī)學版),2020,49(1):1-19.

[19]Martinez Molina D,Jafari R,Ignatushchenko M,et al.Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay[J].Science,2013,341(6141):84-87.

[20]Almqvist H,Axelsson H,Jafari R,et al.CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil[J].Nat Commun,2016,7:11040.

[21]Martinez Molina D,Nordlund P.The cellular thermal shift assay:a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol,2016,56:141-161.