靜電紡絲絲素蛋白納米纖維在骨組織工程中的運(yùn)用

向 靜，李玲婕，李雨舟，張 赫，季 平，楊 生

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，重慶市口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶，401147）

意外事故、腫瘤切除、骨發(fā)育不全等造成的大面積骨缺損嚴(yán)重影響人體美觀、功能等，常常需要進(jìn)行人工骨移植或骨重建進(jìn)行修復(fù)。人工骨移植包括異體骨移植和自體骨移植，異體骨具有免疫原性，而自體骨則來源有限[1]。因此，1987年提出的“骨組織工程”成為修復(fù)骨缺損的新興方法得到了廣泛關(guān)注[2]。骨組織工程（tissue engineering，TE）由支架、細(xì)胞、生長因子及其在微環(huán)境中的相互聯(lián)系組成，其中，構(gòu)建理想的支架材料提高骨再生的效果是骨TE的核心問題。絲素蛋白（silk fibroin，SF）已被證明是一種極具前景的支架材料，其良好的生物相容性、優(yōu)異的力學(xué)性能和低免疫原性決定了其在骨TE的重要性和應(yīng)用潛能。本文就電紡SF納米纖維在骨TE中的運(yùn)用進(jìn)展作一綜述。

1 SF

SF是一種天然生物蛋白，來自于產(chǎn)絲節(jié)肢動物的腺體，包括蜘蛛，蠶等。使用最多最普遍的家蠶B.mori絲素蛋白，其蛋白結(jié)構(gòu)如示意圖1所示，由～26 kDa輕鏈（L鏈）和～390 kDa重鏈（H鏈）通過二硫鍵相互連接構(gòu)成[1]。SF具有3種典型的結(jié)構(gòu)[3]，其中，亞穩(wěn)態(tài)的親水性結(jié)構(gòu)silk I可以通過改變溫度或添加有機(jī)溶劑（如甲醇）等方式轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷越Y(jié)構(gòu)silk II；silk III則是一種在空氣和水界面自組裝形成的三倍體螺旋結(jié)構(gòu)[4]。SF具有良好的機(jī)械性能，包括300～740MPa的拉伸強(qiáng)度、62,104J/kg的韌性、10-17GPA的拉伸彈性模量以及4%-26%的斷裂應(yīng)變強(qiáng)度。此外，SF還具有良好的生物相容性，1993年，美國食品和藥物管理局（FDA）定義SF為安全的生物材料，并廣泛應(yīng)用于縫合等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[5]。不僅如此，SF還具有可控的生物降解性、良好的氧氣和水蒸氣滲透性等，在生物技術(shù)、材料科學(xué)、醫(yī)學(xué)美容等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用[6-7]。

圖1 絲素蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖[7]

2 靜電紡絲

靜電紡絲技術(shù)起源于20世紀(jì)初，其原理是粘彈性溶液在高靜電力下被擠壓成射流，形成連續(xù)的納米/微米纖維。靜電紡絲的基本裝置如圖2所示，包括高壓電源、注射泵、旋轉(zhuǎn)的聚合物溶液和接收裝置。研究表明，電紡參數(shù)對纖維的形態(tài)結(jié)構(gòu)有一定影響，比如聚合物性質(zhì)、溶劑性質(zhì)、溶質(zhì)性質(zhì)、加工環(huán)境條件以及電紡溶液的濃度、分子量、粘度和流速等[8]。電紡參數(shù)對纖維形態(tài)的影響在表1總結(jié)如下。

3 絲素蛋白靜電紡絲

SF靜電紡絲，常用六氟異丙醇（HFIP）、甲酸（FA）和水溶液三種溶劑。首先，HFIP有機(jī)溶劑，具有很好的粘彈性，7%(w/v)的SF-HFIP即可形成纖維，平均直徑6.5～100nm[10]；通過β折疊后，SF-HFIP納米纖維具有良好的機(jī)械性能[11]。FA作溶劑,5%～20%的SF-FA溶液制備的纖維直徑在12-1500nm之間[12];甲醇溶液誘導(dǎo)SF β折疊后，膜的孔隙率從76.1%下降到68.1%，膜的機(jī)械性能增強(qiáng)[13]。Zhang et al.比較HFIP和甲酸兩種溶劑對SF纖維形態(tài)、結(jié)構(gòu)和細(xì)胞毒性的影響發(fā)現(xiàn)，相同條件下SF-HFIP制備的纖維直徑平均約2um，而SF-FA平均直徑約0.3um，且SF-FA納米纖維膜結(jié)晶度更高，但兩種膜對人表皮細(xì)胞(NHEF)粘附生長的影響沒有明顯區(qū)別[14]。

HFIP和FA都是有機(jī)溶劑，殘留在體內(nèi)可能產(chǎn)生負(fù)作用，因此一些研究探討了對人體最安全的溶劑-水對SF電紡纖維的影響。SF-水作為電紡溶液，可紡性差。Wang et al.利用28w/v% SF-水溶液電紡制備的纖維直徑400～800nm，而濃度低于17%的SF-水溶液不能形成纖維[15]。但是，研究表明高濃度的SF-水溶液容易通過氫鍵和疏水作用等相互作用轉(zhuǎn)化為凝膠，不利于加工操作[16]。因此，為改善SF-水溶液的電紡性，Jin et al.提出在SF-水溶液中加入聚氧化乙烯(PEO)[17]。研究表明，5(wt)%的PEO溶液與8(wt)%的SF按4∶1(wt/wt)比例混合形成的7.5wt% SF-PEO溶液具有良好的可紡性，制備的纖維直徑平均約800nm，且具有良好的機(jī)械性能[18]。Kishimoto et al.通過改進(jìn)提取SF的方法，在無PEO等水溶性聚合物共存的情況下，以小于10wt%的SF-水溶液進(jìn)行電紡，制備的SF膜具有良好的機(jī)械性能和生物相容性。綜上，無論采用何種溶劑，SF電紡可行性高，且制備的SF納米纖維膜具有良好的機(jī)械性能和生物相容性，因此，在骨TE具有較大的應(yīng)用前景[19]。

4 絲素蛋白電紡納米纖維在骨組織工程的應(yīng)用

4.1 成骨相關(guān)細(xì)胞和絲素蛋白電紡納米纖維間的相互作用

雖然SF的蛋白序列中沒有任何細(xì)胞特異性結(jié)合位點(diǎn)，SF納米纖維膜依然能促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的粘附和增殖。首先，電紡SF納米纖維膜具有高比表面積，能夠促進(jìn)蛋白黏附和細(xì)胞附著，為骨細(xì)胞的鋪展生長奠定基礎(chǔ)[9]。其次，通過調(diào)節(jié)電紡參數(shù)可以調(diào)控SF納米纖維膜的孔徑、孔隙率以及生物活性等，更好的模擬骨細(xì)胞生長微環(huán)境，促進(jìn)成骨相關(guān)細(xì)胞的增殖分化[20]。Won Seo et al.研究表明SF納米纖維膜增強(qiáng)了小鼠前體成骨細(xì)胞（MC3T3-E1）的ALP活性，促進(jìn)了細(xì)胞成骨分化[21]。Nikbakht et al.通過體外培養(yǎng)BMSCs 12d證明SF促進(jìn)了BMSCs礦化[22]。研究表明，SF調(diào)控干細(xì)胞成骨分化的機(jī)制主要通過以下途徑：Wnt、Notch、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白/轉(zhuǎn)化生長因子β(BMP/TGFβ)、胰島素樣生長因子(IGF)和血小板衍生生長因子(PDGF)等[23]。根據(jù)藥理學(xué)和分子學(xué)的研究，Notch信號在MSCs向成骨細(xì)胞分化過程中起重要作用，SF通過抑制Notch信號而上調(diào)一些成骨細(xì)胞分化標(biāo)記物(如ALP,osteorix和Runx2)的表達(dá)[24]。以上研究表明，SF對成骨相關(guān)細(xì)胞的作用非常明顯，因此，其在骨TE中的具有較大的應(yīng)用前景。

表1：電紡參數(shù)及其對納米纖維形態(tài)的影響。

圖2 a)電紡裝置示意圖，包括一個(gè)裝溶液的注射器，一個(gè)可控速度的注射器泵，以及一個(gè)高壓電源。通過施加合適的電壓，形成泰勒錐，射流噴射到集電極板上。b)電壓升高對泰勒錐(深色尖端)形成的影響。在低電壓下，首先形成垂墜，然后在尖端形成錐體，電壓持續(xù)增大，在針尖處形成錐形，更高的電壓觸發(fā)纖維形成[9]。

4.2 破骨細(xì)胞和電紡絲素納米纖維間的相互作用

在骨組織工程中，骨形成細(xì)胞在支架上成骨向分化并礦化，促進(jìn)骨再生非常重要。但是，骨重建是一個(gè)骨形成和骨吸收平衡的過程，在骨再生過程中，不僅需要考慮骨形成細(xì)胞而且還要考慮骨吸收細(xì)胞。目前為止，只有少數(shù)文獻(xiàn)涉及破骨細(xì)胞和SF納米纖維膜之間的相互作用。通過蒸汽β折疊的SF和甲醇折疊的SF薄膜單培養(yǎng)或共培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)培養(yǎng)單核細(xì)胞時(shí)，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）陽性的細(xì)胞出現(xiàn)聚集；而破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，TRAP陽性細(xì)胞均勻分布，表明絲素蛋白可能是研究破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞之間細(xì)胞-細(xì)胞交流的有利生物材料[25]。相反，SF水解產(chǎn)物以時(shí)間和劑量依賴方式抑制鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW 264.7細(xì)胞中RANKL誘導(dǎo)的TRAP的形成[5]。目前尚不清楚在SF支架上培養(yǎng)破骨細(xì)胞過程中，存在多少絲素蛋白的裂解產(chǎn)物，但是，絲素蛋白的裂解物可以用作天然化合物通過減少破骨細(xì)胞生成來防止骨質(zhì)流失。

4.3.電紡絲素納米纖維作為支架參與體內(nèi)骨再生

臨床應(yīng)用中，生物材料的應(yīng)用不能僅通過體外測試來評估，因?yàn)楹茈y從體外情況推至體內(nèi)。因此，骨TE中骨科材料的生物相容性和骨再生能力也應(yīng)在體內(nèi)研究中體現(xiàn)。為了評估SF納米纖維支架的體內(nèi)骨再生能力，已在不同動物模型中進(jìn)行測試，主要包括小鼠、大鼠、兔和綿羊等的顱骨、下頜或股骨缺損等。Jwa-Young Kim et al.利用大鼠顱骨臨界缺損模型研究了BioGide膜和SF膜在骨再生中的差異。Bio-Gide膜主要是I型膠原，其中存在GER肽序列(GFP*GERGVEGPP*GPA)，是α2β1整合素結(jié)合的必要識別位點(diǎn)，在介導(dǎo)成骨細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用。然而，體內(nèi)研究表明，材料植入8周后，SF和商業(yè)Bio-Gide膠原膜（分別為8.75±0.80和8.47±0.75 mm3）的骨再生的能力沒有明顯差異[26]。此外，SF納米纖維膜降低了傳播感染的風(fēng)險(xiǎn)，為促進(jìn)骨再生提供了另一種選擇。另一研究制備的SF納米纖維膜具有良好的生物相容性，在兔顱骨缺損模型中，體內(nèi)植入8周后觀察到骨愈合[27]。用于頜面骨再生的SF納米纖維膜通過螺釘植入大鼠股骨缺損模型中，術(shù)后8周觀察到令人滿意的骨重建[28]。以上研究表明，SF在體內(nèi)亦具有良好的骨再生性能。

4.4 電紡絲素納米纖維作為成骨藥物的載體

近年來，靜電紡絲法制備的SF納米纖維已被用于骨TE。然而，SF本身并不具有成骨性能，因此，有必要加入合適的成骨因子提高骨再生效果，比如骨特異性生長因子（BMP-2，血小板衍生生長因子PDGF）、基因和酶等[29]。Shalumon采用靜電紡絲法制備了SF/殼聚糖/納米羥基磷灰石/骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (SF/CS/nHAp/BMP-2,SCHB2)支架[30]，BMP-2包裹在納米纖維的芯層，而殼層由兩種厚度的SF/CS/nHAp組成。與純SF/CS和SF/CS/nHAp相比，BMP-2結(jié)合的SCHB2納米纖維能更好的誘導(dǎo)BMSCs成骨向分化。盡管BMP-2在誘導(dǎo)骨代謝和再生方面效果很好，但高濃度的BMP-2可能導(dǎo)致免疫原性、異位骨修復(fù)和水腫等[9]。因此，P24(S[PO4]KIPKASSVPTELSAISTLYLDDD)，一種新的氨基酸多肽已被用作BMP-2的替代品用于骨TE[31]。研究表明，將P24經(jīng)氧化石墨烯(GO)修飾后（GO-p24）組裝到SF/CS納米纖維表面,避免了P24的局部快速擴(kuò)散，促進(jìn)了細(xì)胞的黏附[32]。最近，通過靜電紡絲法制備了聚谷氨酸結(jié)合BMP-2肽(E7-BMP-2)修飾的SF/PCL納米纖維膜，研究表明，脂肪組織源性干細(xì)胞(ADSCs)在E7-BMP-2肽修飾支架上具有良好的成骨分化能力[33]。

小分子也可以用作有效的骨誘導(dǎo)因子，因?yàn)樗鼈兊姆肿淤|(zhì)量較低(＜1000 Da)，不會激發(fā)宿主的免疫反應(yīng)，可以有效緩解使用蛋白質(zhì)和多肽帶來的難題[34]。例如，瑞舒伐他汀(RSV)是一種弱親水性小分子藥物，與其他他汀類藥物如阿托伐他汀和辛伐他汀相比，在骨誘導(dǎo)方面表現(xiàn)出了巨大的潛力[35]。此外，添加蕁麻(Urtica dioica L.，)這種成骨因子，增加了SF納米纖維的直徑，且以劑量依賴的方式促進(jìn)了ALP、Runx2、Col I和OCN等成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)了hADSCs的成骨分化[36-37]。

5 展 望

大面積骨缺損嚴(yán)重影響人體美觀、功能運(yùn)動，骨TE成為修復(fù)治療骨缺損的重要方法之一。電紡SF納米纖維在形態(tài)結(jié)構(gòu)和生物活性等方面具有可調(diào)性，比如與生物材料（如nHA）結(jié)合，形成復(fù)合支架，模仿天然骨骼環(huán)境，增加支架的成骨能力，這使它們成為骨TE應(yīng)用優(yōu)先考慮的候選材料。但是SF作為一種天然聚合物，其性質(zhì)因來源而異，且不同的脫膠過程和制造方法以及電紡參數(shù)的控制都可能改變材料的性能。此外，盡管許多研究證實(shí)了SF納米纖維膜在體內(nèi)具有誘導(dǎo)成骨的潛力，但這些研究大多是在小動物模型上進(jìn)行的，因此結(jié)果可能不能完全推廣到人類使用。未來還需要進(jìn)行更多的研究，以確定在臨床試驗(yàn)中使用SF納米纖維支架的安全性，并構(gòu)建適合的用于骨組織再生的商業(yè)化產(chǎn)品。