血清KL-6、DD及CRP在ANCA相關(guān)性血管炎合并間質(zhì)性肺病檢測(cè)中的臨床價(jià)值①

譚立明 盧曉霞 張 倩 黃家翌 宮陽(yáng)陽(yáng) 張皓承 劉宇晗 余建林

（南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，南昌 330006）

抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體相關(guān)性血管炎（antineutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis，ANCA-associated vasculitis，AAV）是一類以血清AN?CA檢測(cè)陽(yáng)性和中小型血管炎癥為特征的慢性自身免疫性疾病，主要包括顯微鏡下多血管炎、肉芽腫性多血管炎和嗜酸性肉芽腫性多血管炎三種類型，主要影響腎、肺和其他器官［1-2］。最新研究表明AAV患者的標(biāo)準(zhǔn)化死亡率是健康人的2.7倍［3］。AAV合并間質(zhì)性肺病（interstitial lung disease，ILD）在臨床上較為常見，診斷方法主要為病史分析、臨床檢查、影像學(xué)分析和ANCA檢測(cè)，但由于檢查存在不良反應(yīng)或費(fèi)用較高等，不易被一般患者所接受。研究表明，血清Ⅱ型肺泡細(xì)胞表面抗原（krebs von den-lun?gen-6，KL-6）在結(jié)締組織病（connective tissue dis?ease，CTD）合并ILD中高表達(dá)，可以反映ILD的活動(dòng)程度［4］；D-二聚體（D-dimer，DD）為凝血指標(biāo)，在活動(dòng)期的AAV中高表達(dá)，且與ILD的發(fā)生密切相關(guān)［5-6］；C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）為炎癥指標(biāo)，與AAV的活動(dòng)性相關(guān)。本研究選取南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院45例AAV-ILD患者、42例AAV患者和40例健康體檢者作為研究對(duì)象，旨在探究血清KL-6、DD及CRP檢測(cè)對(duì)AAV-ILD的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對(duì)象 選取南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院2015年5月至2019年7月確診的45例AAV-ILD患者，42例AAV患者，40例健康體檢者。AAV的診斷符合2012年美國(guó)Chapel Hill Consensus Conference關(guān)于ANCA相關(guān)性血管炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］；ILD確診條件：①臨床表現(xiàn)有漸進(jìn)性氣促、干咳、活動(dòng)性呼吸困難，肺部聽診有散在或彌漫的濕啰音；②肺功能檢查表現(xiàn)出不同程度的彌散量減少及限制性通氣功能障礙；③肺部高分辨率CT（high-resolution CT，HRCT）有下列影像學(xué)變化，如肺內(nèi)呈現(xiàn)不規(guī)則線條網(wǎng)格樣改變、雙下肺外側(cè)出現(xiàn)蜂窩影、小葉間隔增厚、磨玻璃影等多種表現(xiàn)。研究對(duì)象均知情同意，并且本研究獲得南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)許可。

1.1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①所有患者知情并同意本研究；②患者診斷明確，臨床資料詳實(shí)；③所有健康體檢者的臨床表現(xiàn)、病理、影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)檢查均無(wú)異常變化。

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①繼發(fā)性血管炎；②合并其他肺疾病，如：肺結(jié)核、肺部感染、支氣管擴(kuò)張及肺部腫瘤等；③合并其他自身免疫性疾??；④合并心、腦、肝、腎及血液系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病；⑤合并肝炎、艾滋病等傳染性疾??；⑥妊娠或哺乳期婦女。

1.1.4 試劑和儀器

1.1.4.1 KL-6的檢測(cè)試劑由日本積水醫(yī)療科技（中國(guó)北京）有限公司提供，儀器為AU5400全自動(dòng)生化分析儀。

1.1.4.2 DD的檢測(cè)試劑由日本積水醫(yī)療科技（中國(guó)北京）有限公司提供，儀器為全自動(dòng)血凝分析儀Sysmex CS-5100。

1.1.4.3 CRP的檢測(cè)由美國(guó)貝克曼公司提供的IM?MAGE 800型全自動(dòng)特定蛋白分析系統(tǒng)及配套試劑完成。

1.1.4.4 ANCA的檢測(cè)試劑由德國(guó)歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷股份有限公司提供，EUPOStarⅢPlus熒光顯微鏡由德國(guó)EVROIMMUN公司提供。

1.1.4.5 抗髓過氧化物酶抗體（MPO）和抗蛋白酶3抗體（PR3）的檢測(cè)試劑盒由歐根泰克診斷股份有限公司生產(chǎn)，儀器為KHBST-360酶標(biāo)儀(上海科華生物工程股份有限公司)、PW-960全自動(dòng)洗板機(jī)[記憶科技(深圳)有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 血樣采集 所有研究對(duì)象空腹采3.0 ml外周靜脈血2份，一份置于枸櫞酸鈉抗凝管中并搖晃均勻，2 500 r/min離心15 min，用于檢測(cè)DD濃度；一份置于非抗凝管中靜置30 min后，2 500 r/min離心15 min，用于檢測(cè)KL-6和CRP濃度及ANCA。

1.2.2 KL-6的檢測(cè) 操作步驟：輸入樣品號(hào)，輸入預(yù)先設(shè)置的項(xiàng)目組合號(hào)，選擇檢測(cè)項(xiàng)目KL-6，輸入對(duì)應(yīng)樣品號(hào)所做的項(xiàng)目信息，將樣品架放入進(jìn)樣軌道，點(diǎn)擊開始。所有操作均嚴(yán)格遵循試劑說明書及南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院質(zhì)量管理標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 DD的檢測(cè) 操作步驟：輸入樣本號(hào)，選擇檢測(cè)項(xiàng)目DD，將樣品架放入進(jìn)樣軌道，點(diǎn)擊開始。所有操作均嚴(yán)格遵循試劑說明書及南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院質(zhì)量管理標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 CRP的檢測(cè) 采用速率散射比濁法測(cè)定CRP，操作步驟：輸入樣本識(shí)別，確定架號(hào)和樣本號(hào)，選擇檢測(cè)項(xiàng)目CRP及樣本類型，保存設(shè)置，點(diǎn)擊開始。以上所有操作均嚴(yán)格遵循試劑說明書及南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院質(zhì)量管理標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 ANCA的檢測(cè)

1.2.5.1 采用間接免疫熒光法測(cè)定ANCA操作步驟：將患者稀釋的血清與生物載片（反應(yīng)區(qū)內(nèi)固定有包被基質(zhì)的生物薄片）溫育30 min后進(jìn)行沖洗，再加入熒光素標(biāo)記的抗人抗體溫育30 min，沖洗后進(jìn)行封片，最后于顯微鏡下觀察熒光模型。實(shí)驗(yàn)中建立質(zhì)量控制，每分析批使用試劑盒中匹配的陰陽(yáng)性對(duì)照物進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)使用自制的弱陽(yáng)性質(zhì)控物進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5.2 采用ELISA測(cè)定MPO和PR3操作步驟：將質(zhì)控品和稀釋的患者血清分別加入包被過氧化物酶和蛋白酶3的微孔板中，加速儀內(nèi)溫育15 min后洗液洗板3次，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的多克隆抗人IgG類抗體，加速儀內(nèi)溫育7.5 min，洗板5次，加底物后加速儀內(nèi)避光溫育7.5 min，加終止液，30 min之內(nèi)用450 nm波長(zhǎng)比色，計(jì)算結(jié)果。以上所有操作均嚴(yán)格遵循各試劑說明書及南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院質(zhì)量管理標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)分布資料以±s表示，比較前采用Levene's Test進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊性的兩兩比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，方差不齊的兩兩比較采用t'檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（n）或率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；根據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)繪制受試者工作特征（receiver operating characteris?tic，ROC）曲線，計(jì)算ROC曲線下面積（area under the curve，AUC），AUC在0.5～0.7有較低診斷準(zhǔn)確性，AUC在0.7～0.9有一定診斷準(zhǔn)確性，AUC＞0.9有較高診斷準(zhǔn)確性，當(dāng)P＜0.05時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組一般資料比較AAV-ILD組年齡36～85歲，平均（63.29±14.37）歲，AAV組年齡20～88歲，平均（58.12±15.74）歲，健康對(duì)照組年齡18～85歲，平均（53.63±18.36）歲，3組的平均年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.775，P=0.066）；AAV-ILD組男女比例為1∶0.55，AAV組男女比例為1∶1.1，健康對(duì)照組男女比例為1∶1，3組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.920，P=0.232），詳見表1。

表1 各組患者臨床特征的比較Tab.1 Comparison of clinical features of patients in each group

2.2 血清KL-6、DD及CRP檢測(cè)水平比較AAVILD組患者血清KL-6和CRP水平與AAV組和健康對(duì)照組比較，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；血清DD水平與AAV組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與健康對(duì)照組比較，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），詳見表2。

表2 血清KL-6、DD及CRP檢測(cè)水平比較（±s）Tab.2 Comparison of serum KL-6，DD and CRP levels（±s）

表2 血清KL-6、DD及CRP檢測(cè)水平比較（±s）Tab.2 Comparison of serum KL-6，DD and CRP levels（±s）

Note：Compared with AAV and control group，1）P＜0.01；compared with AAV，2）P＜0.05；compared with control group，3）P＜0.01.

n Groups AAV-ILD AAV Control CRP（mg/L）78.01±37.721）51.41±28.943）6.90±3.39 45 42 40 KL-6（U/ml）715.95±265.991）266.48±101.14 251.11±98.14 DD（μg/ml）4.88±3.032）3.61±2.133）0.30±0.13

2.3 血清ANCA檢測(cè)結(jié)果比較AAV-ILD和AAV組的p-ANCA、c-ANCA陽(yáng)性率均大于健康對(duì)照組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；AAV-ILD和AAV組內(nèi)，p-ANCA陽(yáng)性率均大于c-ANCA陽(yáng)性率，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），詳見表3。

表3 血清ANCA檢測(cè)結(jié)果比較［例（%）］Tab.3 Comparison of test results of serum ANCA［n（%）］

2.4 血清KL-6、DD及CRP的診斷效能KL-6的靈敏度和特異度都很高；DD的靈敏度最高，但特異度很低；CRP的靈敏度較高，特異度一般，詳見表4。

表4 血清KL-6、DD及CRP的診斷效能比較Tab.4 Comparison of diagnostic efficacy of serum KL-6，DD and CRP

2.5 血清KL-6、DD及CRP的ROC曲線分析 根據(jù)3組患者血清KL-6、DD及CRP水平計(jì)算出ROC曲線參數(shù)，繪制ROC曲線，其中KL-6對(duì)AAV-ILD的診斷價(jià)值最高，詳見表5和圖1。

表5 標(biāo)志物的ROC曲線參數(shù)Tab.5 Parameters of biomarker′s ROC curves

2.6 各血清標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè) 將檢測(cè)指標(biāo)聯(lián)合，進(jìn)行串并聯(lián)分析，計(jì)算聯(lián)合后診斷AAV-ILD的敏感度和特異度。串聯(lián)檢測(cè)可顯著提高診斷特異度，其中KL-6+DD+CRP串聯(lián)時(shí)最高，為0.995；并聯(lián)檢測(cè)可顯著提高診斷敏感度，其中KL-6+DD+CRP并聯(lián)時(shí)最高，為0.999。所以聯(lián)合檢測(cè)對(duì)AAV-ILD診斷意義更大，詳見表6。

圖1 血清KL-6、DD及CRP的ROC曲線Fig.1 ROC curves of serum KL-6，DD and CRP

表6 各血清標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)（%）Tab.6 Joint detection of serum markers（%）

3 討論

AAV是一種嚴(yán)重的自身免疫性疾病，主要影響中小型血管且常累及其他器官。AAV的臨床表現(xiàn)多種多樣，從最初的皮疹可發(fā)展到多系統(tǒng)疾病，往往導(dǎo)致診斷上的明顯延遲［8］。ILD是AAV常見的并發(fā)癥之一，合并ILD的AAV患者病死率較高，早期診斷對(duì)于治療和預(yù)后有重要意義。目前，HRCT是AAV-ILD診斷的重要手段，但難以做到早期診斷和檢測(cè)病情的變化。因此，尋找診斷價(jià)值高的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)尤為重要。

KL-6是日本人KOHNO等［9］于1985年發(fā)現(xiàn)并命名的高分子量（200 kD）糖蛋白，由MUC1基因編碼，主要在Ⅱ型肺泡細(xì)胞表面表達(dá)，肺泡上皮細(xì)胞受破壞后會(huì)導(dǎo)致血清中KL-6的水平升高，因此KL-6可鑒別診斷各種慢性肺纖維化和肺泡蛋白沉積，目前已有研究報(bào)道KL-6為診斷ILD、評(píng)估病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的一種有效的生物標(biāo)志物［10-14］；DD來源于纖溶性交聯(lián)纖維蛋白凝塊，主要用于排除肺動(dòng)脈栓塞和輔助診斷急性主動(dòng)脈夾層，其含量在AAV的活動(dòng)期患者中顯著高于緩解期，對(duì)AAV-ILD患者的診斷價(jià)值研究尚少［15-16］；CRP是全身性炎癥反應(yīng)的標(biāo)志物，可反映AAV的病情活動(dòng)程度，在大部分AAVILD患者中顯著升高，但屬非特異性指標(biāo)，其對(duì)AAV-ILD的診斷價(jià)值少有研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，AAV-ILD組血清KL-6水平明顯高于AAV組和健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），AAV組KL-6水平和健康對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與YASUNORI IWATA等［17］的研究結(jié)果相似，說明AAV-ILD患者血清中KL-6水平的升高與AAV無(wú)關(guān)，而是由并發(fā)的ILD造成。本研究還發(fā)現(xiàn)AAV-ILD組血清DD及CRP水平高于AAV組和健康對(duì)照組，且AAV組高于健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。以上研究結(jié)果提示KL-6、DD及CRP可作為輔助診斷AAV-ILD的血清學(xué)指標(biāo)，經(jīng)分析得出三者單獨(dú)檢測(cè)時(shí)的診斷效能，發(fā)現(xiàn)KL-6的敏感度為0.844，特異度為0.963，具有最大的診斷價(jià)值；DD和CRP的靈敏度均較高，但特異度比較低，DD的特異度僅為0.524，表明二者單獨(dú)檢測(cè)時(shí)診斷價(jià)值不大。

ANCAs是一組針對(duì)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞胞漿成分的抗體，是診斷AAV的重要血清學(xué)指標(biāo)，主要分為核周型（p-ANCA）和胞質(zhì)型（c-ANCA）。本研究中，AAV-ILD組的ANCA陽(yáng)性率顯著高于健康對(duì)照組，與AAV組ANCA陽(yáng)性率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明AAV并發(fā)ILD對(duì)ANCA結(jié)果沒有顯著影響，同時(shí)也提示ANCA不是輔助診斷AAV-ILD的血清學(xué)指標(biāo)。此外，AAV-ILD和AAV組內(nèi)p-ANCA陽(yáng)性率均高于c-ANCA，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），這與NISHKANTHA ARULKUMARAN等［18］的研究結(jié)果相似，說明AAV并發(fā)ILD之后對(duì)ANCA的陽(yáng)性類別沒有顯著影響。

通過比較血清KL-6、DD及CRP單獨(dú)檢測(cè)時(shí)ROC曲線下面積，發(fā)現(xiàn)KL-6的曲線下面積最大，為0.932，說明其具有很高的診斷價(jià)值，這是因?yàn)镵L-6主要在Ⅱ型肺泡細(xì)胞表面表達(dá)，當(dāng)肺組織受到損傷時(shí)，血清中KL-6水平升高，而AAV組和健康對(duì)照組的肺組織并未受到損傷，血清KL-6水平基本不會(huì)升高［19］。聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，KL-6+DD+CRP串聯(lián)檢測(cè)的特異度最高，為0.995；并聯(lián)檢測(cè)的靈敏度最高，為0.999，表明聯(lián)合檢測(cè)的輔助診斷價(jià)值明顯優(yōu)于單獨(dú)檢測(cè)。此外，KL-6+DD和KL-6+CRP串聯(lián)檢測(cè)的特異度較高，KL-6+DD、KL-6+CRP和DD+CRP并聯(lián)檢測(cè)時(shí)的靈敏度均較高，因此在臨床工作中，需要根據(jù)具體情況選擇合適的檢測(cè)方法。

綜上所述，血清KL-6、DD及CRP這3項(xiàng)指標(biāo)在AAV-ILD患者中高表達(dá)，單獨(dú)檢測(cè)KL-6具有較高的診斷價(jià)值，三者聯(lián)合檢測(cè)可顯著提高AAV-ILD輔助診斷的診斷效能、靈敏度和特異度，具有較大的臨床價(jià)值。