墨蘭精油提取工藝優(yōu)化及成分分析

鄧乾坤，王 斌，史學(xué)偉，朱根發(fā)，楊鳳璽，高 潔

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所/廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜合利用實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】蘭花為蘭科蘭屬植物，是中國(guó)十大名花之一，素有“國(guó)香”“君子之花”的美譽(yù)，在我國(guó)已有近2 000 年的栽培歷史，并形成了極具中國(guó)特色的蘭花文化［1］。因具有獨(dú)特的文化和觀賞價(jià)值，蘭花歷來(lái)是文人墨客喜愛(ài)的對(duì)象，在市場(chǎng)上具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值?？鬃臃Q國(guó)蘭為“王者之香”，其香氣為國(guó)蘭的精髓和靈魂，是體現(xiàn)國(guó)蘭觀賞、文化及經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重要性狀，歷來(lái)是人們用來(lái)評(píng)估和鑒定蘭花品種優(yōu)劣的重要條件之一。墨蘭（Cymbidium sinense）又名報(bào)歲蘭，適宜生長(zhǎng)在半陰、溫暖、濕潤(rùn)的環(huán)境中，主要分布于東南沿海地區(qū)的廣東、廣西、福建，以及西南地區(qū)的云貴川等地，品種豐富［2-3］，在廣東國(guó)蘭交易市場(chǎng)中最常見(jiàn)也最受歡迎。墨蘭葉形優(yōu)美，花香清新幽遠(yuǎn)，解郁提神，沁人心脾［4］，為優(yōu)質(zhì)香料物質(zhì)，可在化妝品等領(lǐng)域進(jìn)行良好應(yīng)用。但有關(guān)蘭花精油的應(yīng)用及相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)相對(duì)較少，針對(duì)墨蘭精油的開(kāi)發(fā)和研究更為少見(jiàn)。因此，本研究開(kāi)展墨蘭精油提取工藝的研究并對(duì)提取的精油進(jìn)行成分測(cè)定，以期為墨蘭精油的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)及理論基礎(chǔ)，進(jìn)而提升墨蘭的產(chǎn)業(yè)價(jià)值，促使墨蘭產(chǎn)業(yè)鏈的延伸?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明，植物精油是一類從植物中提取的含芳香氣味［5］的物質(zhì)，具有消炎、抗菌、抗病毒、抗氧化以及保護(hù)心血管等作用［6］，可以作為天然抗氧化劑有效延緩食品變質(zhì)、提升食用油和肉類的貨架期。植物精油主要由萜類化合物、脂肪族化合物、芳香族化合物以及其他含氮硫類化合物等組成［7］，其中萜類化合物被認(rèn)為是植物精油的主要成分［8］。李杰同時(shí)采用蒸餾法和萃取法提取了‘企黑’［9］和‘小香’［10］墨蘭精油，并對(duì)精油組分進(jìn)行了初步分析，發(fā)現(xiàn)墨蘭精油主要含有棕櫚酸、二十五烷、二十三烷、二十七烷、二十四烷醇等。近年來(lái)，越來(lái)越多方法被應(yīng)用于提取植物精油，包括溶劑浸提法、水蒸氣蒸餾法、超聲波輔助萃取法、超臨界CO2萃取法等［11-14］。其中，微波輔助萃取法所需設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，萃取范圍寬泛，出油率高，適合常規(guī)工業(yè)的工藝提取，因而廣泛應(yīng)用于天然植物有效成分的提取?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】墨蘭香氣清新優(yōu)雅，但目前關(guān)于墨蘭精油的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用幾乎為空白。本研究采用新育成的‘迎春素’墨蘭作為研究對(duì)象，采取超聲輔助萃取法提取墨蘭精油，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化墨蘭精油提取工藝，并采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HS-SPME-GC-MS）對(duì)墨蘭精油的香氣成分進(jìn)行測(cè)定?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)優(yōu)化超聲輔助萃取法提取墨蘭精油的工藝，篩選墨蘭精油提取的最適條件。結(jié)合墨蘭精油成分的分析，為墨蘭精油在食品、化妝品、醫(yī)藥以及農(nóng)業(yè)環(huán)保領(lǐng)域中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，為墨蘭資源產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試墨蘭品種為‘迎春素’，采于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所國(guó)蘭種質(zhì)資源圃內(nèi)。將采摘后的‘迎春素’墨蘭花朵用液氮冷凍，收集包裝在不透氣性聚乙烯袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室保存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

試驗(yàn)有機(jī)溶劑有正己烷、石油醚、乙酸乙酯、95%乙醇等，均為國(guó)產(chǎn)分析純；試驗(yàn)主要儀器包括RE212-B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（日本Yamato 公司）、BS 2000S 型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）、7980A-5975C 氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫公司）、SPME 進(jìn)樣器（瑞士CTC Analytics 公司）、MC202231DF-Ⅱ數(shù)顯集熱式磁力攪拌器（常州愛(ài)華儀器制造有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 超聲輔助萃取 將墨蘭花朵在60 ℃下烘干處理 24 h，烘干后用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)孔徑380 μm的篩。稱取 20 g 粉末樣品，裝入錐形瓶中，加入有機(jī)溶劑，待其混合均勻后，將墨蘭料液置于超聲波處理器中處理，設(shè)置超聲波的頻率、時(shí)間和溫度進(jìn)行超聲波浸提［15］。超聲作用后靜置，將料液進(jìn)行分離，再進(jìn)行抽濾，將提取液與濾渣分離。對(duì)抽濾得到的提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行濃縮（轉(zhuǎn)速100 r/min，溫度調(diào)至20 ℃，待溫度穩(wěn)定后再調(diào)至 60 ℃），將濾渣重復(fù)萃取 3 次，收集3 次萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器分離有機(jī)溶劑，提取液中加入適量無(wú)水Na2SO4脫水干燥，稱重，計(jì)算墨蘭精油的提取率，平行試驗(yàn)3 次。

1.2.2 墨蘭精油提取工藝優(yōu)化 （1）單因素試驗(yàn)：以墨蘭粉末為材料，選取不同的提取溶劑（95 %乙醇、乙酸乙酯、正己烷、石油醚）、料液比（1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10，g/mL）、提取時(shí)間（35、40、45、50、55 min）、提取溫度（45、50、55、60、65 ℃）進(jìn)行墨蘭精油提取單因素試驗(yàn)，計(jì)算墨蘭精油的得率。

（2）正交試驗(yàn)：以墨蘭精油得率為指標(biāo)，選取提取溫度、提取時(shí)間、料液比作為影響因素，通過(guò)正交試驗(yàn)法 L9（33）確定有機(jī)溶劑提取墨蘭精油的最佳工藝條件（表 1）。

表1 L9（33）正交試驗(yàn)因素表Table 1 L9（33）Orthogonal test factors

1.2.3 精油得率計(jì)算

式中，M1為瓶子和墨蘭精油的質(zhì)量（g），M2為瓶子質(zhì)量（g），M 為墨蘭質(zhì)量（g），W 為墨蘭精油的提取率（%）。

1.2.4 頂空固相微萃取 取5 mL 提取的墨蘭精油于 20 mL 隔墊密封樣品瓶中，加入轉(zhuǎn)子置于磁力攪拌器上加熱。將50/30 μm DVB/CAR/PDMS 型號(hào)萃取頭在 GC/MS 進(jìn)樣口250 ℃下老化 5 min 后，插入頂空樣品瓶進(jìn)行懸空富集一定時(shí)間后取出萃取頭，于 GC/MS 中解析、檢測(cè)。

1.2.5 GC-MS 定性定量分析 墨蘭精油的GC-MS 測(cè)定條件：選用HP-INNOWAX 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣，流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度 250 ℃，進(jìn)樣量 1 mL，分流比50∶1；程序升溫條件：初始柱溫度40 ℃，以2 ℃/min 升至90 ℃，再以4 ℃/min升至140 ℃，最后以7 ℃/min升至250 ℃。

質(zhì)譜條件：電離方式為EI，電子能量70 eV，溶劑延遲3 min，離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150℃，掃描質(zhì)量范圍為 30～550 amu［16］。利用Wiley275.L 和NIST98.L 兩個(gè)譜庫(kù)對(duì)采集到質(zhì)譜圖中的香氣成分串聯(lián)檢索，確定墨蘭精油的香氣成分?？傠x子流圖用峰面積歸一法計(jì)算各組分的相對(duì)百分含量，確定墨蘭精油的組成成分。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析。利用軟件Origin 8.5 進(jìn)行結(jié)果處理并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 不同有機(jī)溶劑對(duì)墨蘭精油得率的影響 稱取 10 g 墨蘭樣品，選擇石油醚、正己烷、95% 乙醇、乙酸乙酯 4 種有機(jī)溶劑為萃取劑，按料液比1∶9，在 45 ℃條件下提取 45 min，墨蘭精油得率見(jiàn)表 2。

由表2 可知，4 種有機(jī)溶劑中，使用95%乙醇提取得到的墨蘭精油產(chǎn)率最高、為1.92%。不同的有機(jī)溶劑對(duì)墨蘭精油的得率、顏色和香味都會(huì)產(chǎn)生不同程度的影響。95%乙醇作為萃取劑，精油色澤比較理想，墨蘭的特征香味濃郁，風(fēng)味佳；石油醚作為萃取劑，精油得率雖然較高，但顏色呈墨綠色較混濁，而且香味淡薄，風(fēng)味一般；正己烷作為萃取劑，精油得率不高，顏色為深墨綠色，香味淡薄，風(fēng)味較好；乙酸乙酯作為萃取劑，精油得率較低，顏色為渾濁的墨綠色，香味淡薄，風(fēng)味差。因此，95%乙醇是較好的有機(jī)溶劑提取劑，從價(jià)格、產(chǎn)率以及安全性等方面來(lái)考慮，選擇 95%乙醇為提取劑較為適宜。而石油醚、正己烷、乙酸乙酯提取得到的精油無(wú)論顏色還是香氣都不太理想，不適宜作為墨蘭精油的提取劑。

表2 不同有機(jī)溶劑對(duì)墨蘭精油得率的影響Table 2 Effects of different organic solvents on the yield of essential oil from Cymbidium sinense

2.1.2 不同料液比對(duì)墨蘭精油得率的影響 稱取20 g 墨蘭樣品，以95%乙醇作為萃取劑，選擇不同料液比（1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10）45 ℃萃取45 min，墨蘭精油得率變化見(jiàn)圖1。由圖1 可知，在不同的液料比下萃取墨蘭精油的精油得率不同。在料液比為1∶6～9 范圍內(nèi)，隨著液料比的增加，墨蘭精油得率呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，液料比為1∶9 時(shí)精油得率最高；料液比再增加時(shí)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在料液比較少的情況下，物料墨蘭與有機(jī)溶劑接觸的表面積比越大［17］，固液濃度差就會(huì)相應(yīng)增加，溶解度和滲透壓也會(huì)變大，加快了95%乙醇與墨蘭油脂分子的擴(kuò)散速率，有利于油脂從墨蘭細(xì)胞組織中脫離出來(lái)，墨蘭油脂分子擴(kuò)散速率的增加［18］，同時(shí)提高了墨蘭精油的得率。但當(dāng)有機(jī)溶劑的量過(guò)高，液料比超過(guò)1∶9 時(shí)，不僅會(huì)增加試驗(yàn)成本，還會(huì)使墨蘭精油得率降低。因此，從節(jié)約能源、降低成本、便于溶劑回收等綜合因素考慮，最佳的液料比為1∶9。

圖1 料液比對(duì)墨蘭精油得率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on yield of essential oil from Cymbidium sinense

2.1.3 不同提取時(shí)間對(duì)墨蘭精油得率的影響 稱取20 g 墨蘭樣品，以95%乙醇作為萃取劑，料液比為1∶8，45 ℃下分別提取35、40、45、50、55 min，墨蘭精油得率變化見(jiàn)圖2。由圖2 可知，超聲波提取時(shí)間由35 min 增加到40 min 時(shí)，墨蘭精油得率大幅度增加；但是提取時(shí)間由40 min 延長(zhǎng)到55 min 的過(guò)程中，墨蘭精油得率反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這是由于提取的初始階段，物料中精油含量較高，固液間濃度差較大，溶解度和滲透壓也變大，墨蘭精油擴(kuò)散速率較大，墨蘭精油的油脂分子會(huì)不斷擴(kuò)散到95%乙醇的有機(jī)溶劑中，精油萃取率就不斷增加；這可能是由于隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，超聲能轉(zhuǎn)化成熱能，同時(shí)溶質(zhì)中的小分子相互碰撞導(dǎo)致精油溶液溫度升高，使墨蘭精油揮發(fā)嚴(yán)重，精油的得率反而下降，因此進(jìn)一步延長(zhǎng)超聲作用時(shí)間對(duì)墨蘭精油得率的提高無(wú)促進(jìn)作用，有機(jī)溶劑中的油脂量趨于飽和，溶液體系滲透壓趨于平衡［19］，得率不再增加，同時(shí)提取精油時(shí)間過(guò)長(zhǎng)還會(huì)造成能耗的增加以及工序時(shí)間的延長(zhǎng)，因此墨蘭精油提取工藝最佳提取時(shí)間為40 min。

圖2 超聲提取時(shí)間比對(duì)墨蘭精油得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic extraction time on yield of essential oil from Cymbidium sinense

2.1.4 不同提取溫度對(duì)墨蘭精油得率的影響 稱取20 g 墨蘭樣品，以95%乙醇作為萃取劑，料液比為1∶8，分別于45、50、55、60、65℃下萃取45min，墨蘭精油得率變化見(jiàn)圖3。由圖3 可知，提取溫度在45～50 ℃之間，隨著溫度的升高，墨蘭精油得率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)溫度增加到50 ℃時(shí)，墨蘭精油得率為2.81%，顯著高于其他提取溫度下的精油得率；隨著超聲提取溫度的進(jìn)一步升高，墨蘭精油得率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這是因?yàn)闇囟鹊纳咴黾恿朔肿又g的擴(kuò)散作用，促進(jìn)溶劑分子滲透到物料細(xì)胞內(nèi)部，增加了溶劑分子和油脂分子的活動(dòng)動(dòng)能，加劇溶劑分子的揮發(fā)和擴(kuò)散，從而萃取率增加［20］。此外，溫度升高以及隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)沸騰劇烈，導(dǎo)致95%乙醇的揮發(fā)加劇，減少了95%乙醇與墨蘭的有效作用，不利于墨蘭精油的萃取，因此當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)，墨蘭精油得率出現(xiàn)下降現(xiàn)象。

圖3 超聲提取溫度比對(duì)墨蘭精油得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic extraction temperature on yield of essential oil from Cymbidium sinense

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

選取料液比、超聲提取時(shí)間、超聲提取溫度作為影響因素，以墨蘭精油得率為指標(biāo)，采用L9（33）正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化墨蘭精油提取工藝。由表3 的R值可知，超聲提取溫度、超聲提取時(shí)間、料液比3 個(gè)因素對(duì)墨蘭精油得率的影響次序?yàn)椋篈 液料比＞B 超聲提取時(shí)間＞C 超聲提取溫度，根據(jù)3 個(gè)k 值的最大值組合，確定最優(yōu)工藝條件為A2B1C1，即料液比1∶9、超聲提取時(shí)間35 min、超聲提取溫度45 ℃。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，墨蘭精油平均得率為2.96%，精油香味較濃郁，風(fēng)味佳。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析Table 3 Analysis of orthogonal test results

2.3 墨蘭精油香氣成分分析

墨蘭‘迎春素’的精油成分總離子流如圖4所示。經(jīng)GC-MS 分析，測(cè)得該精油的78 種組分（表4），含量占精油成分總量的94.36%，相對(duì)含量在1%以上的組分有20 種，分別為異戊醛、2-己烯醛、己酸乙酯、羅勒烯、1,2,3,4-四氫萘、壬醛、辛酸乙酯、紫羅蘭酮、（E,E）-2,4-庚二烯醛、茶螺烷、L-芳樟醇、苯乙醛、乙二醇油酸酯、正十五烷酸、二氫紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、棕櫚酸、十八碳二烯酸甲酯、二十四烷、二十五烷。這20種精油組分的相對(duì)含量達(dá)到了80.37%，其中，棕櫚酸相對(duì)含量最高、為17.37%，其次為壬醛、正十五烷酸、二十四烷、合金歡醇，相對(duì)含量分別為10.57%、8.69、4.65%和4.03%。

圖4 墨蘭精油GC/MS 分析總離子流Fig.4 GC/MS analysis of total ion flow of essential oil from Cymbidium sinense

表4 墨蘭精油成分及其相對(duì)含量Table 4 Compositions and relative contents of essential oils from Cymbidium sinense

（續(xù)表4）

將鑒定出的墨蘭精油成分劃分為醛類、醇類、芳香族類、酮類、烷烴類、烯烴類、羧酸類、酯類、其他類呋喃和酰胺共9 類化合物。從圖5 可以看出，‘迎春素’精油中羥酸類、醛類、烷烴類、醇類最多，分別占化合物總數(shù)的26.21%、26.01%、11.59%和10.58%，這4 類化合物已達(dá)化合物總數(shù)的74.39%；酯類、酮類化合物相對(duì)少些，兩者所占比重相近，分別為9.64%和9.25%；而芳香族類和烯烴類最少，占比3.77%和2.62%。

圖5 墨蘭精油不同化合物的相對(duì)含量Fig.5 Relative contents of different compounds in essential oil of Cymbidium sinense

3 討論

3.1 超聲輔助萃取對(duì)墨蘭精油提取的影響

與采用水蒸餾法提取墨蘭精油的方法相比［9-10］，本研究采用超聲輔助萃取法的加熱溫度低，所需時(shí)間較短，可以防止墨蘭精油中的熱敏成分和易水解成分分解，最大限度地保留了精油中的特征香氣成分。傳統(tǒng)方法提取的精油得率僅為1%左右，而本研究采用超聲輔助萃取法經(jīng)優(yōu)化后可獲得較高的精油得率（2.9%左右），精油得率得到了大大提高。

不同溶劑會(huì)影響精油得率，選擇有效的有機(jī)溶劑對(duì)精油提取有重要影響。王海波等［21］研究表明，利用不同有機(jī)溶劑提取的桂花精油，在形態(tài)、氣味和顏色上有所區(qū)別，其中獲得精油效果較好的為石油醚。而從價(jià)格、產(chǎn)率以及安全性等方面考慮，本研究選擇乙醇作為提取劑較為適宜，所得到精油品質(zhì)較好。

在影響超聲波輔助提取精油的因素中，料液比通過(guò)影響固液濃度差、溶解度和滲透壓等，改變有機(jī)溶劑與精油分子從植物細(xì)胞組織脫離的擴(kuò)散速率；超聲波提取時(shí)間和提取溫度影響精油分子與有機(jī)溶劑的結(jié)合程度，從而影響精油得率。本研究認(rèn)為料液比是影響精油得率的主要因素，與吳曉菊等［22］研究神香草精油工藝的結(jié)論相一致，而且從節(jié)約能源、降低成本、便于溶劑回收等方面綜合考慮，通過(guò)優(yōu)化料液比、提取時(shí)間和提取溫度的工藝條件可獲得較高的精油得率。

3.2 墨蘭精油的香氣成分分析

本研對(duì)墨蘭‘迎春素’精油的香氣成分進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)到78 種成分，香氣成分較多且大部分以羥酸類、醛類、烷烴類、醇類為主。通過(guò)分析對(duì)比得出墨蘭精油中的特征香氣成分主要為棕櫚酸、壬醛、正十五烷酸、二十四烷和合金歡醇等，其中棕櫚酸成分含量最高（17.37%），可以作為食品用的香料，也可添加到化妝品中滋潤(rùn)皮膚。而在文殊蘭精油中檢測(cè)到棕櫚酸的相對(duì)含量為15.77%［23］，墨蘭‘迎春素’精油的棕櫚酸相對(duì)含量更多，而且這類芳香精油大多具有抑菌功能，推測(cè)墨蘭‘迎春素’精油也可能具有抑菌活性。墨蘭‘迎春素’精油的壬醛含量也較高，具有強(qiáng)烈的油脂氣味和甜橙氣息，其稀乙醇溶液有香草醛的香調(diào)，可用作食品添加劑，也可用于調(diào)制玫瑰、橙花、香紫羅蘭、香味等香精。此外，墨蘭中的合金歡醇物質(zhì)具有青香韻的鈴蘭花香氣，并有青香和木香香韻，這些特征香氣可在今后應(yīng)用于食品、化工和化妝品領(lǐng)域等。

4 結(jié)論

本研究以墨蘭‘迎春素’為原料，采用超聲波輔助萃取法提取墨蘭精油，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得到最佳的工藝參數(shù)如下：以95%乙醇作為萃取劑，料液比1∶9（g/mL），超聲提取溫度45 ℃，超聲提取時(shí)間35 min，在此條件下墨蘭精油得率為2.96%，精油墨綠色透亮，香味較濃郁，風(fēng)味佳。料液比、超聲提取時(shí)間、超聲提取溫度對(duì)墨蘭精油得率的影響順序?yàn)椋阂毫媳龋境曁崛r(shí)間＞超聲提取溫度。通過(guò)頂空固相微萃取-GC-MS 聯(lián)用技術(shù)分析鑒定了墨蘭‘迎春素’精油的化學(xué)成分，共鑒定出78 種化合物，其中主要成分為棕櫚酸、壬醛、正十五烷酸、二十四烷和合金歡醇等物質(zhì)。