一株豬圓環(huán)病毒2型SY-12株的分離鑒定

李秋菊，孫明梅 ，費景春，潘志忠，魏 星

（1.松原職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉林 松原 138000；2.遼源市動物疫病預(yù)防控制中心，吉林 遼源 136220）

豬圓環(huán)病毒 2型 （Porcine Circovirus type 2，PCV2）感染是一種以斷乳豬進(jìn)行性消瘦、呼吸困難、腹瀉及明顯的淋巴組織病變?yōu)橹饕卣鞯募膊。?-3］。研究表明，PCV2感染除了造成PMWS外，同時還與豬呼吸道綜合癥、豬皮炎和繁殖障礙等密切相關(guān)［4-5］。PCV2經(jīng)常與豬呼吸與繁殖綜合征病毒(PRRSV)或豬細(xì)小病毒(PPV)并發(fā)感染或繼發(fā)細(xì)菌感染,使患病豬病情加重,導(dǎo)致基因缺失突變[6]。所以，通過當(dāng)?shù)亓餍卸局赀M(jìn)行PCV2的分離鑒定，篩選免疫原性較強(qiáng)的毒株用于制備PCV2滅活疫苗，對PCV2防控具有十分重要的意義。

1 試驗材料

1.1 病料來源

從松原地區(qū)某發(fā)病豬場采集疑似豬圓環(huán)病毒感染病豬的腹股溝淋巴結(jié)，共12份。

1.2 試驗材料

PK15細(xì)胞，PCV檢測為陰性，由本公司研究室保存；基因組提取試劑盒、切膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑和索萊寶公司Ex Taq DNA Ploymerase工具酶，購自TaKaRa公司；MEM培養(yǎng)基和胎牛血清，均購自Invitrogen公司。

2 試驗方法

2.1 病料處理

取疑似豬圓環(huán)2型病變腸系膜淋巴結(jié)和腹股溝淋巴結(jié)，加入5 mL MEM(含青霉素最終濃度為100U/mL、鏈霉素100U/mL)生長液研磨。加入3 mL氯仿，充分混勻，12000 rpm/min離心20 min。吸取上清液用0.22 um過濾除菌。將病毒懸液1 mL接種于長成單層的PK-15細(xì)胞，37℃ 5% CO2感作50 min，補(bǔ)充2% MEM營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄上清液，用終濃度為0.3的M D-氨基葡萄糖37℃處理30 min。棄掉0.3的M D-氨基葡萄糖液，用MEM洗滌2次，用2%胎牛血清與雙抗的MEM繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d，收集細(xì)胞毒液。

2.2 PCR鑒定與分型鑒定

根據(jù)已發(fā)表的PCV2序列設(shè)計PCV ORF2引物：ORF2F:5'-GCGGATCCGTGACGTATCCAAG-3'，ORF2R:5'-CACTAGTATAGGGGTTAAGTGGGG-5'，產(chǎn)物長度為702 bp；同時，設(shè)計另一對引物克隆其余部分基因片 段，F(xiàn)ragLF：5'-GAATTCCTGCGGGGGCG GTGTCTTCT-3'；FragLR：5'-GTCGACCAATCCCCC AACCCTTGCCTACC-3'，產(chǎn)物長度為 1373 bp；并合成PCV2分型鑒定引物，以區(qū)別PCV2a和 PCV2b，PCV2aF：5'-CCAGTTCGTCACCCTTTCC-3'，PCV2a R：5'-GGGG GACCAACAAAATCTC-3'， 擴(kuò)增長度為550 bp；PCV2b F：5'-GTGGTCTACATTT CCAGC AGTT-3'，PCV2bR：5'-GCTCAAACCCCCG CTC-3'，提取病毒 DNA，PCR反應(yīng)體系：10×PCR 緩沖液2.0 μL、dNTPs 0.5 μL、CEU、CED 各 0.5 μL、Ex Taq DNA Ploymerase 0.25 μL、細(xì)胞總 DNA1.0 μL 和滅菌水15.40μL，總體積為20.0 μL。 PCR反應(yīng)條件：95 ℃3 min，95 ℃1 min，65 ℃1 min，72 ℃1 min，共 35 個循環(huán)；72℃10 min。將PCR產(chǎn)物切膠回收，并連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，鑒定陽性質(zhì)粒測序。

2.3 核苷酸序列測定與同源性分析

將測序結(jié)果利用GenBank中BLAST軟件進(jìn)行同源性對比分析。

2.4 病毒形態(tài)觀察

將凍融3次收獲的病毒培養(yǎng)液在12000轉(zhuǎn)/min離心30 min，除去細(xì)胞碎片。取上清液用2%磷鎢酸染色，透射電鏡觀察病毒粒子。

2.5 特異性鑒定

取PCV2強(qiáng)毒SY-12株病毒細(xì)胞培養(yǎng)物1 mL，加入等體積的PCV2陽性血清，37℃培養(yǎng)1 h。取200 μL接種于單層PK-15細(xì)胞，同時設(shè)不加血清的病毒對照和陰性血清對照。置37℃ CO2培養(yǎng)箱中24 h，換含3 mmol/L D-氨基葡萄糖鹽酸MEM維持液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。棄去維持液，用PBS洗滌3次，冷丙酮固定，150 μL/孔4℃ 30 min。 棄丙酮， 室溫下干燥，用PBS洗滌1次。加入工作濃度的鼠抗PCV2 CAP單抗，50 μL/孔37℃ 1 h。用PBS洗滌3次，加入工作濃度FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗，50 μL/孔，37 ℃ 1 h； 移去孔內(nèi)液體，用PBS洗滌3次。熒光顯微鏡下觀察。

3 結(jié)果

3.1 病毒分離

病毒分離見圖1。

圖1 病毒分離（PCV2 SY-12F0）染色結(jié)果

3.2 PCR鑒定及分型鑒定結(jié)果

采用PCV2引物通過PCR對疑似病例的淋巴組織進(jìn)行擴(kuò)增,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后觀察到2條長度約為702 bp和1375 bp的電泳條帶,與預(yù)期的片段大小一致(見圖2)。PCV2 SY-12株分型鑒定結(jié)果見圖3。擴(kuò)增出330 bp具有PCV2b特異的片段，無PCV2a特異550 bp的特異片段，對照細(xì)胞中沒有PCV2a和PCV2b特異片段。上述結(jié)果說明，PCV2 SY-12株為PCV2b型毒株。

圖2 PCR鑒定結(jié)果

圖3 PCV2a,PCV2b分型擴(kuò)增鑒定結(jié)果圖

3.3 序列測定和同源性分析結(jié)果

對克隆片段ORF2基因與XS基因分別測序，序列分析后，經(jīng)拼接得到SY-12株P(guān)CV2的部分基因序列為1767 bp，與GenBank中歐洲株親緣關(guān)系最近，與AF055394序列同源性達(dá)99.8%。該株全基因序列如圖4。編碼氨基酸的分子演化分析結(jié)果如圖5。

圖4 PCV2 SY-12株部分氨基酸序列

圖5 PCV2 SY-12株與其他毒株氨基酸序列同源性比較

3.4 病毒形態(tài)電鏡觀察結(jié)果

病毒培養(yǎng)液經(jīng)凍融后離心取上清液，2%磷鎢酸負(fù)染后顯微鏡下觀察到圓環(huán)病毒粒子 (箭頭所示如圖6)。

圖6 電鏡下觀察到的細(xì)胞分離物中的圓環(huán)病毒粒子

3.5 特異性鑒定結(jié)果

將PCV2陽性血清中和分離到的PCV2第3代病毒經(jīng)熒光抗體染色，結(jié)果和正常感染病毒相比，熒光斑數(shù)量減少70%，病毒對照接種細(xì)胞孔和陰性血清作用細(xì)胞孔內(nèi)均可見大量綠色熒光。

4 討論

豬圓環(huán)2型病毒自1997年發(fā)現(xiàn)至今，已證實與豬群中發(fā)生的許多疾病密切相關(guān)。因此，開展PCV2研究具有重要意義。本試驗通過對疑似感染的組織樣品進(jìn)行PCV2-ORF2核酸檢測，確定該病料經(jīng)PCV2感染后再用PK-15細(xì)胞進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，通過間接免疫熒光鑒定及電鏡鑒定，證實該病毒為豬圓環(huán)病毒2型，即PCV2-WH株。同時將SY-12分離毒株與Gen Bank中已發(fā)表的國內(nèi)外PCV2毒株進(jìn)行核苷酸序列同源性分析，結(jié)果表明SY-12分離毒株與其他毒株核苷酸序列同源性達(dá)99.7%。本研究分離的SY-12分離株為吉林省做好該病的防治工作提供了科學(xué)依據(jù)。由于豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）的生物學(xué)特性特殊，病毒在所有細(xì)胞中增殖的滴度不高，在細(xì)胞中復(fù)制需要依賴細(xì)胞生長周期S期的細(xì)胞表達(dá)蛋白。用D-氨基葡萄糖處理細(xì)胞培養(yǎng)物后有利于病毒的復(fù)制，感染細(xì)胞數(shù)量可提高30%。本試驗用PCR檢測得到的PCV2陽性病料經(jīng)處理后接種PK-15細(xì)胞，然后用D-氨基葡萄糖處理，連續(xù)盲傳后進(jìn)行熒光定量PCR及IFA檢測，分離到SY-12株，為進(jìn)一步從分子水平研究PCV2在吉林省的流行、變異規(guī)律以及主要結(jié)構(gòu)基因的特性奠定了基礎(chǔ)，也為吉林地區(qū)PCV2的診斷及預(yù)防奠定了基礎(chǔ)。

圖7 PCV2 SY-12株（F3）特異性鑒定結(jié)果