苗淑月，高曉曉，鄭立敏，陳建斌，趙星月，程菊娥，陳 莎，章松柏 ，劉 勇

（1. 長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025；2. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，湖南 長沙 410125；3. 西南林業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650032；4. 湖南工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，湖南 株洲 412007）

0 引言

【研究意義】番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus, TSWV）是布尼亞病毒目（Bunyaviriales）、番茄斑萎病毒科（Tospoviridae），正番茄斑萎病毒屬（Orthotospovirus）的成員[1]。該病毒是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要病原物之一，其寄主范圍十分廣泛，包括番茄、辣椒等蔬菜作物以及花卉等經(jīng)濟(jì)作物[2]。TSWV已被列為全球十大植物病毒之一，每年造成的損失超過10億美元[3?4]。目前，TSWV已經(jīng)在荷蘭、法國、英格蘭、意大利以及西班牙等歐洲國家暴發(fā)，隨后傳播到南、北美洲等地。近年來，在伊朗、日本、韓國、中國等亞洲國家陸續(xù)發(fā)現(xiàn)該病毒[5?8]。自TSWV首次在我國發(fā)現(xiàn)以來，因其病害擴(kuò)展迅速，目前在天津、北京、山東、海南、云南等多地均有報道。明確寄主蛋白調(diào)控N蛋白多聚體的形成過程及N蛋白介導(dǎo)的病毒致病機(jī)理，有助于了解寄主因子調(diào)控TSWV在煙草內(nèi)侵染的分子機(jī)制，解析病毒侵染機(jī)理?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】番茄斑萎病毒的病毒粒體為球狀體或多面體顆粒，病毒顆粒直徑大約有80～120 nm[9]。其基因組為三分體RNA單鏈，根據(jù)其分子量命名為L RNA，M RNA和S RNA[10]。L RNA的互補(bǔ)鏈編碼RdRp蛋白，M RNA編碼Gn/Gc蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白（NSm），S RNA編碼核衣殼蛋白（N）和非結(jié)構(gòu)蛋白（NSs）[11?12]。所有蛋白質(zhì)以高度協(xié)調(diào)的方式在寄主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，有助于TSWV成功感染寄主植物。番茄斑萎病毒的核衣殼蛋白（N）可以自身結(jié)合形成多聚體并與核糖核蛋白（RNPs）的形成有關(guān)[13?14]。在植物體內(nèi)病毒粒子的裝配和成熟與N蛋白與Gn和Gc蛋白的互作有關(guān)[15]。此外，病毒通過胞間連絲的過程需要NSm和N之間的相互作用來完成[16]。近年來，對N的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)N具有一個由帶正電荷的N-和C-端組成的結(jié)構(gòu)域，并且有一個潛在的RNA結(jié)合位點。此外，N的結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)與相鄰亞單位的同型蛋白之間的相互作用[12]。TSWV N在植物細(xì)胞內(nèi)可以形成沿著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和微絲組成的網(wǎng)絡(luò)高速運動的顆粒[17]。在TSWV侵染寄主植物時，發(fā)現(xiàn)N蛋白與誘導(dǎo)超敏感型辣椒的程序性細(xì)胞死亡（PCD）有關(guān)[18]。研究表明，含有綠色熒光蛋白（GFP）基因與TSWV的N基因融合片段的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)GFP和N基因片段的轉(zhuǎn)錄后基因沉默，并且對TSWV具有抗性[19]?！颈狙芯壳腥朦c】TSWV N蛋白在介導(dǎo)病毒侵染寄主過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本試驗以TSWV N蛋白作為誘餌蛋白，采用酵母雙雜交（Yeast two-hybrid，Y2H）的方法篩選煙草內(nèi)與TSWV N相互作用的寄主蛋白?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究結(jié)果有助于了解寄主蛋白調(diào)控N蛋白多聚體的形成過程及N蛋白介導(dǎo)的病毒致病機(jī)理，以及寄主因子調(diào)控TSWV在煙草內(nèi)侵染的分子機(jī)制和病毒侵染機(jī)理，解析病毒侵染機(jī)理，以期為后續(xù)更有效地防控該病毒病害提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

pGBKT7-N、pGBKT7-53、pGBKT7-Lam、pGADT7-T等重組質(zhì)粒、煙草酵母文庫，酵母菌株Y2H Gold、大腸桿菌菌株（Escherichia coli）DH5α由湖南省植物保護(hù)研究所實驗室保存；酵母雙雜交營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基，X-α-gal、Aureobasidin A購自寶生物工程（大連）有限公司；酵母質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；一步法酵母活性蛋白提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；cMyc的單克隆抗體購自Thermo Fisher Scientific。

1.2 試驗方法

1.2.1 重組誘餌載體pGBKT7-N的自激活檢測 采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將誘餌表達(dá)載體質(zhì)粒pGBKT7-N和pGADT7、陽性載體質(zhì)粒pGBKT7-53和pGADT7-T、陰性載體質(zhì)粒pGBKT7-Lam和pGADT7-T分別轉(zhuǎn)化入Y2H Gold酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布于SD/-Trp/-Leu營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基，并在30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)2-3 d，待克隆長出后挑取單克隆劃線于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基，在30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)2-3 d，比較酵母菌落的生長狀態(tài) 和顏色變化，判斷N蛋白是否有自激活活性。

1.2.2 重組誘餌載體pGBKT7-N的毒性檢測 采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將誘餌表達(dá)載體質(zhì)粒pGBKT7-N轉(zhuǎn)入Y2H Gold酵母感受態(tài)細(xì)胞，同時轉(zhuǎn)化pGBKT7空載體做對照，將轉(zhuǎn)化好的酵母菌分別稀釋10倍、100倍、1 000倍，然后取100 μL涂板于SD/-Trp營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基。30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)2～3 d，直至長出克隆。比較單克隆的大小和數(shù)量，判斷N蛋白對酵母 細(xì)胞是否有毒性。

1.2.3 Western blotting檢測TSWV N蛋白在酵母細(xì)胞內(nèi)的表達(dá) 在30 ℃ 250 r·min?1條件下，用SD/-Trp液體培養(yǎng)基培養(yǎng)1.2.2獲得的pGBKT7-N單克隆酵母菌至OD600大于1.0，1 000 g離心10 min收集菌體，提取酵母總蛋白，用cMyc的單克隆抗體來檢測N蛋白 是否在酵母Y2H Gold細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

1.2.4 重組誘餌載體pGBKT7-N篩選煙草文庫 在轉(zhuǎn)有誘餌表達(dá)載體pGBKT7-N的SD/-Trp固體培養(yǎng)基上挑取單克隆于50 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基中。在30 ℃250 r·min?1條件下，振蕩培養(yǎng)直到OD值為0.8左右。然后將其離心后與轉(zhuǎn)有煙草cDNA文庫的菌株Y187進(jìn)行融合培養(yǎng)，培養(yǎng)20 h左右取出培養(yǎng)液，在顯微鏡下觀察到有接合體出現(xiàn)時繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心并洗脫后涂布于15 cm SD/-Trp/-Leu/-His營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上，挑取單克隆，轉(zhuǎn)移至SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/Aba、SD/-Trp/-Leu/-His/-A de/Aba/X-ɑ-gal營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上進(jìn)行顯色反應(yīng)。

1.2.5 酵母質(zhì)粒提取及PCR鑒定測序分析 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade液體培養(yǎng)基在30 ℃ 250 r·min?1條件下震蕩培養(yǎng)從SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上挑取的長勢良好的酵母菌2 d后提取酵母質(zhì)粒，用pGADT7載體的通用引物對質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。PCR反應(yīng)體系：酵母質(zhì)粒1 μL，10 μmol·L?1上下游引物各0.5 μL，反應(yīng)緩沖液2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol·L?1）2 μL，TransStart?Top Taq DNA聚合酶（2.5 U·μL?1）0.5 μL，去離子水18 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸120 s，共30個循環(huán)后，72 ℃延伸7 min。并將提取到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coli DH5ɑ內(nèi)，以3′AD為引物進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增鑒定，提取捕獲質(zhì)粒并進(jìn)行測序。分析篩選到的互作基因名稱、基因 簡介、讀碼框完整性和一致性等信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母誘餌表達(dá)載體自激活檢測

分別將誘餌載體pGBKT7-N和空載體pGBKT7、陽性載體pGBKT7-53和pGADT7-T、陰性載體pGBKT7-Lam和pGADT7-T轉(zhuǎn)入酵母菌株Y2H Gold中，比較其在SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-ɑ-gal營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上的生長情況，發(fā)現(xiàn)三組質(zhì)粒在SD/-Trp/-Leu營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上均能生長（圖1-a）。只有pGBKT7-53和pGADT7-T在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上生長（圖1-b）并在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-ɑ-gal營養(yǎng)缺陷型上顯藍(lán)色（圖1-c），試驗結(jié)果證明誘餌載體pGBKT7-N不能單獨激活報告基因表達(dá) ，沒有自激活現(xiàn)象。

2.2 酵母誘餌表達(dá)載體的毒性檢測

將誘餌載體pGBKT7-N和空載體pGBKT7轉(zhuǎn)入酵母菌株Y2H Gold中，比較其在SD/-Trp營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上的生長情況，發(fā)現(xiàn)兩組菌落大小均隨著稀釋倍數(shù)的增加而變大，數(shù)量均隨著稀釋倍數(shù)的增加而變少，且兩組菌落大小均勻一致，表明N蛋白表達(dá)對Y2H Gold酵母菌無毒性。

圖 1 N蛋白在酵母細(xì)胞中的自激活驗證Fig. 1 Verification of self-activation of N protein in yeast cells

2.3 誘餌表達(dá)載體在酵母細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

以含pGBKT7空載體的菌落作為陰性對照，用SD/-Trp液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)含有誘餌表達(dá)載體pGBKT7-N的單菌落，利用一步法酵母活性蛋白提取試劑盒提取酵母總蛋白。由于載體上的標(biāo)簽cMyc與誘餌可形成融合蛋白，因此本試驗以cMyc的單克隆抗體進(jìn)行Western-blotting檢測，結(jié)果表明N蛋白能夠在酵母細(xì)胞中表達(dá)，N與cMyc的融合蛋白大小為39 kDa（ 圖2）。

2.4 篩選與TSWV N蛋白互作的寄主蛋白

將轉(zhuǎn)入誘餌質(zhì)粒pGBKT7-N的菌株Y2H Gold過夜培養(yǎng)至OD值為0.8左右，然后將其離心后與轉(zhuǎn)有煙草cDNA文庫的菌株Y187進(jìn)行融合培養(yǎng)，20 h后取出培養(yǎng)液，在顯微鏡下觀察到有形狀像米奇頭像或三葉草形狀的接合體出現(xiàn)（圖3），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后離心并洗脫，涂布于15 cm SD/-Trp/-Leu/-His營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上，挑取單克隆，轉(zhuǎn)移至SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade /Aba、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/Aba/X-ɑ-gal營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上，并在3～5 d后發(fā)現(xiàn)有114菌落生長并發(fā)生顯色反應(yīng)（圖4）。

2.5 鑒定與TSWV N蛋白互作的寄主蛋白

挑取114個菌落，經(jīng)SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade液體培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d，提取酵母質(zhì)粒，并進(jìn)行質(zhì)粒PCR檢測（圖5），選取條帶大于500 bp的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliDH5ɑ，以氨芐青霉素為抗生素進(jìn)行陽性篩選，挑取陽性克隆送公司測序，分析后共發(fā)現(xiàn)15種蛋白，將序列在NCBI比對發(fā)現(xiàn)這15個蛋白分別為葉綠素ab結(jié)合蛋白16（chlorophyll a-b binding protein 16, CabBP16）、葉綠素a-b結(jié)合蛋白（chlorophyll a-b binding protein, Ca-bBP）、葉綠素a-b結(jié)合蛋白50（chlorophyll a-b binding protein 50, Ca-bBP50）、葉綠素a-b結(jié)合蛋白CP 26（chlorophyll a-b binding protein CP 26, Ca-bBp CP 26）、1，5二磷酸核酮糖羧化加氧酶小鏈（ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase oxygenase small chain Rubisco，1,5-BCOSC）、葉綠素a-b結(jié)合蛋白21（chlorophyll a-b binding protein 21, Ca-Bbp 21）、30S核糖體蛋白S6（30S ribosomal protein S6 alpha,30SRPS6A）、光系統(tǒng)I反應(yīng)中心亞基II（photosystem I reaction center subunit II, PIRCSII）、酰基輔酶A結(jié)合蛋白（acyl-coa-binding protein, ACBP）、脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白（lipid transfer protein, LTP）、非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋 白 2（non-specific lipid-transfer protein 2-like,NSLTP2L）、多蛋白橋接因子1b（multiprotein-bridging factor 1b-like, MBF1BL）、衰減核糖體生物發(fā)生蛋白BRX1同源物（ribosome biogenesis protein BRX1 homolog, RBPBRX1H）、細(xì)胞分裂周期蛋白48同源物（cell division cycle protein 48 homolog, CDCP48H）、硫胺噻唑合酶（thiamine thiazole synthase, TTSCL）（表1）。

圖 2 Western blot檢測N蛋白在酵母內(nèi)的表達(dá)情況Fig. 2 Expression of N protein in yeast as detected by Western blot

圖 3 酵母結(jié)合體Fig. 3 Yeast complexes

圖 4 酵母菌在四缺培養(yǎng)基上的生長情況Fig. 4 Growth of yeast on 4 nutrient-deficient culture media

圖 5 陽性克隆的PCR檢測Fig. 5 PCR detection of positive clones

表 1 與TSWV N蛋白互作的15個候選蛋白Table 1 Fifteen candidate proteins that interacted with N protein of TSWV

3 討論

目前，尚未有治療TSWV的有效手段。隨著科研工作者對TSWV的深入研究，對該病害的病狀、發(fā)病規(guī)律的了解越來越多。然而，對于TSWV與寄主植物的互作關(guān)系了解的相對較少。盡管培育抗TSWV的植物是防治TSWV的必由之路，過去幾十年的研究讓我們對TSWV致病性以及番茄對該病毒的抵抗力的理解有了質(zhì)的飛躍，但是，這種抗性是特異性的，并且很快被病毒所克服，因此不能成功地用于育種工作。而研究TSWV與寄主的互作關(guān)系也同樣可以指導(dǎo)番茄等作物的生產(chǎn)，并可以為TSWV防控提供有效理論依據(jù)。N蛋白在植物寄主的主要作用也與病毒的增殖密切相關(guān)。因此，為了更好地研究寄主和TSWV的相互作用，尤其是了解寄主蛋白參與調(diào)控病毒的增殖過程，使植物成功獲毒，本試驗以N蛋白為誘餌蛋白篩選煙草酵母文庫，為更好開展TSWV與寄主的互作研究奠定基礎(chǔ)，為找到阻斷病毒在植物體內(nèi)增殖尋找理想靶標(biāo)，為防治病毒提供新的思路和方向。

本研究在對酵母菌誘餌載體進(jìn)行表達(dá)后發(fā)現(xiàn)其融合蛋白大小為39 kDa，較目標(biāo)融合蛋白偏小，可能是當(dāng)cMyc標(biāo)簽蛋白存在時，誘餌蛋白的mRNA轉(zhuǎn)錄量減少所導(dǎo)致的[20]。另外，本研究共篩選到15個寄主蛋白與TSWV N互作。分別為Ca-bBP、Ca-bBP 16、Ca-Bbp 21、Ca-bBP 50、Ca-bBp CP 26、1,5-BCOSC、30SRPS6A、PIRCSII、ACBP、LTP、NSLTP2L、MBF1BL、RBPBRX1H、CDCP48H、TTSCL蛋白（表1）。其中Ca-bBP、Ca-bBP 16、Ca-Bbp 21、Ca-bBP 50是葉綠體結(jié)合相關(guān)蛋白，可能參與色素的生物合成或類囊體膜的組裝[21]。Ca-bBp CP 26是葉綠體結(jié)合相關(guān)蛋白，屬于Lhc蛋白家族，在CP 26中，3個葉綠素結(jié)合位點對Chl-a有選擇性，第一個是色素蛋白復(fù)合物折疊所必需的；第二個是蛋白質(zhì)折疊所必需的，并可以與葉黃素特異性結(jié)合；第三個具有較低的選擇性，可以與類囊體中存在的任何葉黃素物種結(jié)合[22]。1,5-BCOS與核酮糖二磷酸羧化酶相關(guān)，是自然界中含量最豐富的蛋白質(zhì)，可能會對催化蔬菜核酮糖二磷酸羧化酶的遲滯性、時間依賴性的活性降低產(chǎn)生不同的影響[23]。核酮糖二磷酸羧化酶在植物中含量豐富，大約占總?cè)~綠蛋白的一半。葉綠素含量的高低往往能客觀反映植物抗病性的強(qiáng)弱[24]。葉綠體作為植物特有的光合作用的細(xì)胞器，通過將信息傳遞至細(xì)胞核來調(diào)節(jié)抗病基因表達(dá)，從而激活防御來抵御入侵者。N蛋白可能“模仿”植物自身的蛋白質(zhì)行為，到達(dá)葉綠體，通過損害葉綠體與細(xì)胞核之間的通訊來阻礙植物防御反應(yīng)的激活，促進(jìn)自身的生存和繁殖。本研究中N蛋白與葉綠體相關(guān)蛋白互作的研究為設(shè)計植物保護(hù)策略與開發(fā)新的抗病品種提供了新思路。30SRPS6A是參與翻譯調(diào)控的輔助蛋白[25]。RBPBRX1H參與核糖體生物發(fā)生的過程，核糖體成熟過程中核糖體蛋白的rRNA加工和組裝涉及許多核糖體生物發(fā)生因子，與核糖體的成熟相關(guān)[26]。寄主細(xì)胞的核糖體蛋為病毒基因組復(fù)制和蛋白翻譯所需的各種蛋白組分。推測其可能通過與TSWV N發(fā)生相互作用而促進(jìn)病毒蛋白在植物體內(nèi)的翻譯。PIRCSII以體內(nèi)亞基II的前體作為PSI復(fù)合物的一部分被插入和嵌入到類囊體中，然后通過基質(zhì)肽酶的作用被加工成成熟的形式[27]。ACBP在脂質(zhì)代謝和細(xì)胞功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[28]?？赡鼙籒結(jié)合和運輸，從而提高植物的抗逆性。LTP是致病性相關(guān)蛋白（PR-14）家族的成員，參與植物防御反應(yīng)[29]。NSLTP2L在植物發(fā)育和對非生物脅迫的反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[30]。脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白可能通過與N的相互作用來參與植物的生理功能，進(jìn)一步促進(jìn)植物細(xì)胞壁的延伸，增強(qiáng)植物自身對細(xì)菌和真菌病原體的防御活性。MBF1BL可以增強(qiáng)擬南芥的耐鹽性和對ABA不敏感性。在鹽和ABA條件下，脅迫響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高。多蛋白橋接因子1（MBF1）是一種轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，通過連接序列特異性激活因子樣蛋白和TATA-box結(jié)合蛋白（TBP）介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活[31]。MBF1BL在植物種可能通過與N的相互作用增強(qiáng)病毒對植株的侵染。CDCP48H與泛素蛋白酶體系統(tǒng)降解相關(guān)，可能介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖調(diào)控的機(jī)制基礎(chǔ)[32]?？赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)細(xì)胞生理周期來降低病毒蛋白的表達(dá)。TTSCL硫胺素在所有生物體的幾種酶反應(yīng)中是一個必要的輔助因子[33]。

4 結(jié)論

本研究成功篩選到了15個與TSWV N蛋白相互作用的寄主蛋白，它們具有豐富多樣的生物功能，因此，我們推斷N蛋白的功能同樣具有多樣性，尤其在病毒裝配和成熟，病毒反防御寄主植物免疫系統(tǒng)等過程中發(fā)揮重要作用。