產(chǎn)油酵母利用廉價(jià)原料合成油脂的研究進(jìn)展

包文君，李子富，王雪梅，3，高瑞嶺，程世昆，門玉

（1北京科技大學(xué)能源與環(huán)境工程學(xué)院，北京100083；2北京市工業(yè)典型污染物資源化處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100083；3北京科技大學(xué)順德研究生院，廣東佛山528300）

經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展伴隨著能源的巨大消耗，但我國傳統(tǒng)化石能源儲(chǔ)存量有限且大量依賴進(jìn)口。因此為應(yīng)對(duì)國際形勢變化、保障能源安全并優(yōu)化能源結(jié)構(gòu)，可再生能源的發(fā)展受到了越來越多的關(guān)注。國家制定了《可再生能源中長期發(fā)展規(guī)劃》《可再生能源法》《能源發(fā)展十三五規(guī)劃》等一系列政策、法律法規(guī)引導(dǎo)可再生能源穩(wěn)健發(fā)展，首部能源法征求意見稿更是首次明確我國要將可再生能源列為能源發(fā)展的優(yōu)先領(lǐng)域。

自1983年Gramham Quick首次對(duì)生物柴油進(jìn)行定義后，這種可直接替代或與化石柴油調(diào)合使用，具有十六烷值高、無毒、低硫、可降解、無芳烴等特點(diǎn)的可再生、綠色環(huán)保的液體燃料便得到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注與研究。歐美國家研究生物柴油起步較早，國際市場上以大豆油和菜籽油為原料的生物柴油已實(shí)現(xiàn)了規(guī)模化生產(chǎn)[1]。我國雖然起步較晚，但發(fā)展速度較快，還頒布了《生物柴油產(chǎn)業(yè)發(fā)展政策》、《B5柴油》、《BD100生物柴油》等政策和標(biāo)準(zhǔn)，引導(dǎo)生物柴油規(guī)?；?、規(guī)范化生產(chǎn)與應(yīng)用。

圖1 生物柴油簡介

表1 常見產(chǎn)油微生物及其油脂含量

然而生產(chǎn)微生物油脂的成本較高，其中主要是碳源成本。有研究表明葡萄糖作為碳源的成本高達(dá)整個(gè)生物柴油生產(chǎn)過程總成本的80%[5]。為了降低微生物油脂的生產(chǎn)成本，研究者們致力于尋找廉價(jià)原料代替葡萄糖，以便使得微生物油脂具有更好的應(yīng)用價(jià)值。因此本文詳細(xì)總結(jié)了目前研究較多的4種廉價(jià)原料，即木質(zhì)纖維素、粗甘油、有機(jī)廢水和揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）用于產(chǎn)油酵母合成油脂的研究進(jìn)展，并展望了產(chǎn)油酵母菌利用這些廉價(jià)原料的發(fā)展趨勢。以期通過本文的綜述與總結(jié)，為推動(dòng)廉價(jià)原料廣泛、高效地應(yīng)用于微生物產(chǎn)油脂領(lǐng)域，提高微生物油脂生產(chǎn)生物柴油的經(jīng)濟(jì)效益提供借鑒。

1 產(chǎn)油酵母合成油脂的機(jī)理

微生物油脂是產(chǎn)油微生物合成的與植物油脂肪酸組成類似的甘油三酯（triacylglycerol,TAG）[18]。產(chǎn)油微生物種類眾多，凡是能合成其細(xì)胞干重20%以上油脂的微生物，都被稱為產(chǎn)油微生物[19]。產(chǎn)油酵母相較于產(chǎn)油微藻，其碳源更加豐富且不受光照、氣候等因素影響；相較于霉菌，其對(duì)重金屬離子耐受性更強(qiáng)、需氧量更少；相較于細(xì)菌，其菌體更大且所合成的油脂更易提取。更重要的是，產(chǎn)油酵母產(chǎn)油能力較強(qiáng)（20%～70%），并更易于進(jìn)行基因改造，這些優(yōu)點(diǎn)使得產(chǎn)油酵母成為極具潛力的產(chǎn)油微生物[20]。

產(chǎn)油酵母一般通過兩種不同的途徑合成油脂：非從頭（ex novo）合成途徑和從頭（de novo）合成途徑[21]。

非從頭合成途徑，產(chǎn)油酵母可以利用培養(yǎng)基中的疏水性底物，如脂肪酸、油和三?；视停═AG）等。這些物質(zhì)在胞外被脂肪酶水解，釋放的脂肪酸通過細(xì)胞膜運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)積累并儲(chǔ)存在脂質(zhì)體（lipid body）中。此途徑不受培養(yǎng)基中的營養(yǎng)素限制。

從頭合成途徑是指產(chǎn)油酵母在生長過程中，將培養(yǎng)基中的親水性底物，如葡萄糖、甘油、乙酸等，在特定的發(fā)酵條件下通過三羧酸循環(huán)等生化過程轉(zhuǎn)化為油脂。此途徑中脂質(zhì)積累通常是在培養(yǎng)基中碳源充足而氮源耗盡時(shí)啟動(dòng)的，氮是微生物合成細(xì)胞物質(zhì)（氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等）和用于細(xì)胞增殖的含氮代謝物的重要營養(yǎng)元素。因此當(dāng)?shù)春谋M時(shí)，菌體繼續(xù)吸收培養(yǎng)基中過量的碳源并用于脂質(zhì)合成，而不是細(xì)胞增殖。非產(chǎn)油微生物在相同的營養(yǎng)限制條件下，往往也會(huì)停止進(jìn)一步的細(xì)胞增殖，但是繼續(xù)吸收的碳水化合物則是被轉(zhuǎn)移儲(chǔ)存到到各種多糖中，如各種葡聚糖和甘露聚糖，而不是形成油脂。

產(chǎn)油酵母通過從頭合成途徑合成油脂的機(jī)理主要分為3步[22]。第1步，脂肪酸（fatty acids，F(xiàn)As）的合成。微生物油脂合成過程中需要乙酰-CoA作為底物，其通常來源于三羧酸循環(huán)和糖酵解途徑。產(chǎn)油微生物還可利用ATP-檸檬酸裂解酶（ACL）裂解檸檬酸生成乙酰-CoA和草酰乙酸。限氮培養(yǎng)條件可刺激腺苷一磷酸（AMP）脫氨酶活性增強(qiáng)，AMP脫氨酶裂解AMP生成大量的肌苷一磷酸（IMP）及氨，為微生物細(xì)胞提供氮。輔助因子AMP濃度降低導(dǎo)致細(xì)胞線粒體中異檸檬酸脫氫酶（ICDH）活性減弱甚至失活，無法轉(zhuǎn)化異檸檬酸脫氫酶為2-酮戊二酸，致使三羧酸循環(huán)受到阻礙，細(xì)胞代謝途徑由此轉(zhuǎn)換。檸檬酸在線粒體中逐漸積累，并通過膜上的蘋果酸/檸檬酸轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，由ACL裂解生成乙酰-CoA及草酰乙酸。草酰乙酸可被蘋果酸脫氫酶（ME）轉(zhuǎn)化為蘋果酸，生成的蘋果酸可由蘋果酸/檸檬酸轉(zhuǎn)移酶再次轉(zhuǎn)移至線粒體，或者由ME進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為丙酮酸，同時(shí)生成還原氫（NADPH）和CO2。這一系列的酶促反應(yīng)所產(chǎn)生的乙酰-CoA以及NADPH將參與脂肪酸合酶復(fù)合體（FAS）的合成直至生成最后的甘油三酯（TAGs）。

授課結(jié)束后，“雨課堂”會(huì)自動(dòng)生成課后小結(jié)，并發(fā)給教師和學(xué)生?！坝暾n堂”會(huì)自動(dòng)評(píng)定出本節(jié)課的優(yōu)秀學(xué)生和預(yù)警學(xué)生，教師也可通過“雨課堂”發(fā)布課后習(xí)題，學(xué)生作答后可直接查看“富文本答案解析”。通過數(shù)據(jù)采集、分析、教師對(duì)學(xué)生任務(wù)完成時(shí)間和情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，掌握每位學(xué)生課程的學(xué)習(xí)情況，準(zhǔn)確定位教師的教學(xué)活動(dòng)[6]。

第2步，脂肪酸合酶復(fù)合體的酶促反應(yīng)，利用ME產(chǎn)生的NADPH，使得第1步得到的脂肪酸鏈的碳鏈不斷增長，直到生成某一特征脂肪酸。第3步，脂肪酸合成后，絕大部分發(fā)生酯化反應(yīng)生成甘油三酯或磷酸甘油脂。微生物體內(nèi)甘油在甘油激酶（GK）作用下生成甘油-3-磷酸，再與酯酰-CoA形成中間產(chǎn)物磷脂酸（PA）。接著磷脂酸在磷脂酸磷酸酶（PAP）作用下磷酸化形成甘油二酯（DAG），再由酯酰-CoA:DAG?；D(zhuǎn)移酶（DGAT）轉(zhuǎn)化為最終產(chǎn)物甘油三酯。圖2介紹了產(chǎn)油酵母利用幾種常見碳源合成油脂的代謝途徑。

Braunwald等[23]評(píng)估了產(chǎn)油酵母生產(chǎn)生物柴油全過程的經(jīng)濟(jì)成本，結(jié)果表明現(xiàn)階段其經(jīng)濟(jì)可行性低于傳統(tǒng)油脂性植物原料；Dias等[24]的研究也顯示傳統(tǒng)柴油的生產(chǎn)成本為0.49美元/升（不包括稅費(fèi)和經(jīng)銷成本），棕櫚油合成生物柴油的成本為0.66美元/升，而產(chǎn)油酵母生產(chǎn)生物柴油的平均成本為2.07美元/升（不包括原料成本）。利用微生物油脂合成生物柴油不具有經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢，這也成為微生物油脂規(guī)模化應(yīng)用的限制因素。然而，無論是通過以上何種途徑合成微生物油脂，培養(yǎng)基中的碳源物質(zhì)都是重要因素，碳源的成本是影響微生物油脂成本的重要因素之一，占生物柴油生產(chǎn)總成本的40%～80%[25]。因此降低碳源成本對(duì)降低微生物油脂的生產(chǎn)成本至關(guān)重要。

2 產(chǎn)油酵母可利用的廉價(jià)原料

如前文所述，產(chǎn)油酵母可利用的碳源種類廣泛，如葡萄糖、淀粉、甘油、木糖、蔗糖、秸稈、烷烴、餐廚廢油和有機(jī)廢水等。其中葡萄糖是研究最多、應(yīng)用最廣且是細(xì)胞生長和油脂合成的高效碳源，產(chǎn)油酵母利用其合成的油脂含量可達(dá)60%以上[26]。但利用葡萄糖作為原料不僅會(huì)面臨與糧爭地、與人爭糧等爭議性問題，而且其成本高昂。據(jù)評(píng)估，葡萄糖成本約占培養(yǎng)基總成本的80%，占生物柴油總生產(chǎn)成本的60%以上[27]。因此，為了降低產(chǎn)油酵母生產(chǎn)生物柴油的總成本，使其更具有市場競爭優(yōu)勢和可推廣性，使用廉價(jià)原料進(jìn)行發(fā)酵勢在必行。

近年來，對(duì)廉價(jià)原料的研究主要集中在親水性底物上，例如木質(zhì)纖維素的水解產(chǎn)物、粗甘油和有機(jī)廢水等以及少數(shù)疏水性底物，如工農(nóng)業(yè)過程的副產(chǎn)物或廢物——揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acids,VFAs）等。利用這些物質(zhì)作為產(chǎn)油酵母的原料，不僅能夠降低生物柴油的生產(chǎn)成本，而且這些物質(zhì)大都屬于工農(nóng)業(yè)及生活廢物（水），此過程還能處理廢物（水）并進(jìn)行再利用，實(shí)現(xiàn)了可持續(xù)發(fā)展。表2對(duì)比了常用碳源的價(jià)格，圖3介紹了產(chǎn)油酵母可利用的廉價(jià)原料。

圖2 產(chǎn)油酵母利用常見碳源合成油脂

圖3 產(chǎn)油酵母可利用的廉價(jià)原料簡介

表2 產(chǎn)油酵母常用碳源價(jià)格表

2.1 木質(zhì)纖維素

木質(zhì)纖維素是農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品、城市固體廢物、低投入能源作物和森林殘留物的重要部分，占全球生物質(zhì)總量的一半[20]。我國是農(nóng)業(yè)大國且森林覆蓋率高，因此我國的木質(zhì)纖維素資源非常豐富，僅農(nóng)作物秸稈年產(chǎn)量就達(dá)(6～8)億噸[29]。因此，這種來源廣泛且不與食品供應(yīng)競爭的可再生原料成為產(chǎn)油酵母生產(chǎn)生物柴油的極具吸引力的原料[28]。

產(chǎn)油酵母大多不能對(duì)木質(zhì)纖維素進(jìn)行直接利用，因此需進(jìn)行預(yù)處理得到微生物可直接利用的各種單糖，這將大幅提高木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為微生物油脂的效率。常用的預(yù)處理方法有物理法、化學(xué)法、物化法和生物法[30-32]，無論采取何種方法，都應(yīng)最大程度地將木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)分解為單糖，并防止單糖進(jìn)一步化學(xué)分解。各種預(yù)處理方法都有優(yōu)缺點(diǎn)，表3進(jìn)行了較詳細(xì)的總結(jié)。

木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物多樣，圖4列出了常見的水解產(chǎn)物。其通常由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素3種不同的聚合物組成，比例構(gòu)成因原料種類的不同而不同[24]。其中纖維素和半纖維素可水解為單糖，如己糖（葡萄糖等）和戊糖（木糖等），產(chǎn)油酵母可有序利用這些糖類。木質(zhì)素的水解產(chǎn)物為芳香族化合物，具有毒性，極少的產(chǎn)油酵母菌能夠利用其生長。

產(chǎn)油酵母對(duì)木質(zhì)纖維素各水解糖的偏好和利用順序不同，促進(jìn)對(duì)各種糖類的快速和同時(shí)利用對(duì)木質(zhì)纖維素向微生物油脂的經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)化至關(guān)重要，因此已有許多學(xué)者對(duì)產(chǎn)油酵母利用多種木質(zhì)纖維素合成微生物油脂開展了研究（表4中油脂含量是指油脂產(chǎn)量和細(xì)胞干重的百分比，下同），以進(jìn)一步闡明糖同化機(jī)制。這些研究也再次印證了多種木質(zhì)纖維素用于產(chǎn)油酵母合成微生物油脂的可行性，從而有望顯著降低生物柴油的生產(chǎn)成本。

由于目前較多的木質(zhì)纖維素如玉米秸稈和水稻秸稈等，已大量地規(guī)?；糜诤铣善渌鲋诞a(chǎn)品，如生物乙醇。因此為避免潛在的土地管理問題等，應(yīng)大力發(fā)展非競爭性木質(zhì)纖維素用于生物柴油的生產(chǎn)，如天然雜草、造紙廠污泥等，保證多種可再生能源的共同發(fā)展。另外，木質(zhì)纖維素預(yù)處理過程產(chǎn)生的一些可能對(duì)產(chǎn)油酵母生長、油脂合成產(chǎn)生抑制作用的水解產(chǎn)物和副產(chǎn)物也需要注意并妥當(dāng)處理。

2.2 粗甘油

圖4 木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)及預(yù)處理和水解產(chǎn)物

表3 木質(zhì)纖維素預(yù)處理方法

粗甘油是生物柴油生產(chǎn)過程產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物，每生產(chǎn)10kg生物柴油將產(chǎn)生1kg甘油副產(chǎn)物。生物柴油原料以及處理工藝的不同使得粗甘油成分組成不同，但主要成分均為甘油、水、灰分和甲醇等[20]。甘油作為多種產(chǎn)油酵母可利用的碳源，與糖類碳源相比，其還原度更高、發(fā)酵過程中的CO2排放更少并且作為工業(yè)廢物，不會(huì)與食品或飼料生產(chǎn)發(fā)生直接競爭。精制甘油在化妝品和藥品等不同領(lǐng)域有更廣泛的用途，因此將純甘油用于酵母的大規(guī)模培養(yǎng)是昂貴且不切實(shí)際的；粗甘油相較于純甘油成本更低，且其中的一些雜質(zhì)元素（如鉀、鈣、硫和鎂）對(duì)微生物生長有促進(jìn)作用。因此，使用粗甘油生產(chǎn)微生物油脂不僅可以降低生產(chǎn)成本，還可以作為一種粗甘油回收利用的方法。

表4 產(chǎn)油酵母菌利用不同木質(zhì)纖維素合成油脂

多種產(chǎn)油酵母已被證實(shí)可利用粗甘油合成油脂（表5），并且產(chǎn)油酵母利用粗甘油能獲得與葡萄糖和純甘油作為碳源時(shí)相當(dāng)?shù)纳踔粮叩挠椭a(chǎn)量。有研究表明，粗甘油中存在的一些雜質(zhì)（油酸甲酯、油酸鈉和NaCl等）能一定程度地提高脂質(zhì)產(chǎn)量，甲醇則會(huì)有抑制作用，但可被其他雜質(zhì)的促進(jìn)作用削弱[38-39]。即使是雜質(zhì)（如肥皂和游離脂肪酸）含量較高而甘油含量較低的粗甘油（13.24%），也可通過優(yōu)化C/N比和發(fā)酵模式的方法來代替葡萄糖，成為可被T.oleaginosus高效利用的碳源[40]。Y.lipolytica可直接利用各種工業(yè)過程產(chǎn)生的粗甘油并合成油脂[41]，相比于葡萄糖，一些菌株甚至對(duì)甘油的利用速率更快[42]。已有綜述詳細(xì)總結(jié)了甘油應(yīng)用于Y.lipolytica生產(chǎn)各種生物產(chǎn)品的進(jìn)展[43]。

表5 產(chǎn)油酵母菌利用粗甘油合成油脂

在其他條件均相同的前提下，Y.lipolyticaACA-YC 5030幾乎無法利用30g/L的粗甘油合成油脂[13]。因此為提高產(chǎn)油酵母對(duì)高濃度甘油的利用率和油脂產(chǎn)量，很多研究通過優(yōu)化培養(yǎng)模式來實(shí)現(xiàn)此目標(biāo)。Polburee等[44]采用溫度調(diào)節(jié)兩階段培養(yǎng)模式，使得產(chǎn)油酵母R.fluvialeDMKU-RK253能夠有效利用濃度高達(dá)60g/L的粗甘油，并獲得了高密度的生物量和高產(chǎn)量的油脂，油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)70%。在脂合成階段，連續(xù)補(bǔ)料800g/L的甘油不僅不會(huì)給R.glutinis造成濃度抑制，多余碳源反而被引導(dǎo)至油脂合成過程[15]。Magdouli等[45]通過添加表面活性劑和油類物質(zhì)作為誘導(dǎo)劑，能夠提高Y.lipolytica對(duì)粗甘油的利用率和油脂產(chǎn)量，這是因?yàn)楸砻婊钚詣┠軌蛉榛指视椭械碾s質(zhì)烴基化合物，將烴基化合物分解為更易于微生物利用的形態(tài)，此外，表面活性劑還有效充當(dāng)了Y.lipolytica中TAG積累的活化劑。

通過增加粗甘油濃度到合適范圍或優(yōu)化培養(yǎng)模式、預(yù)處理去除對(duì)微生物生長和油脂合成產(chǎn)生抑制的雜質(zhì)、保留粗甘油中有益雜質(zhì)以及添加表面活性劑等方式，能夠使得產(chǎn)油酵母有效利用各工業(yè)過程中產(chǎn)生的廉價(jià)副產(chǎn)物甘油，并合成增值產(chǎn)品微生物油脂。

2.3 有機(jī)廢水

據(jù)國家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)顯示，我國廢水排放量巨大，2019年排放總量達(dá)700億噸。廢水處理工藝復(fù)雜且處理成本較高，但考慮到廢水中含有豐富有機(jī)物和有益的微量元素，一些研究利用工農(nóng)業(yè)廢水作為產(chǎn)油酵母的廉價(jià)原料。這既可以解決廢水處理過程中帶來的高能耗、二次污染物排放、高處理成本以及大量的剩余污泥等問題，同時(shí)合成能源物質(zhì)微生物油脂，實(shí)現(xiàn)了廢物再利用。

現(xiàn)階段用來作為原料的有機(jī)廢水主要是工業(yè)廢水（如釀酒廠、味精制造廠和制氫工藝等）和農(nóng)業(yè)廢水（如畜禽廢水）（表6）。Chi等[46]將制氫廢水作為C.curvatus發(fā)酵產(chǎn)油脂的原料，相較于餐廚廢水，這種含氮量較少的廢水能夠得到更為高效的利用，獲得了126g/L的油脂產(chǎn)量和75%的油脂含量，為有機(jī)廢物用于產(chǎn)氫和產(chǎn)油脂的耦合生產(chǎn)提供了思路。Ling等[47]研究了釀酒廢水原水作為碳源用于微生物產(chǎn)油脂，無需滅菌處理，也不額外添加營養(yǎng)元素，僅通過提高R.toruloidesAS2.1389的接種量即可實(shí)現(xiàn)油脂生產(chǎn)和化學(xué)需氧量（COD）的高效去除。經(jīng)流體動(dòng)力空化處理后的畜禽廢水能被C.pseudolambica高效利用并合成產(chǎn)量可觀的油脂，同時(shí)還能有效回收磷和鎂等元素[48]。纖維素廢水的處理還處于研究階段，其成分復(fù)雜且處理難度大，而對(duì)有機(jī)廢水耐受性較高的黏紅酵母，不僅能有效去除纖維素廢水中的COD，還能合成微生物油脂[49]。一些研究通過酵母-微藻、酵母-霉菌等共培養(yǎng)的模式，可提高油脂產(chǎn)量和污水處理效果。Magdouli等[50]對(duì)共培養(yǎng)體系用于生產(chǎn)微生物油脂的優(yōu)勢與缺點(diǎn)進(jìn)行了詳細(xì)的綜述；Ling等[51]將產(chǎn)油酵母R.toruloides和產(chǎn)油微藻C.pyrenoidosa共培養(yǎng)處理釀酒廢水，相較于單獨(dú)培養(yǎng)，不僅減少了調(diào)節(jié)pH所需的試劑用量，還大大提高了油脂產(chǎn)量和溶解性化學(xué)需氧量（SCOD）去除率；產(chǎn)油酵母Y.lipolytica和產(chǎn)油微藻C.vulgaris在乳制品廢水基質(zhì)下共培養(yǎng)，所得油脂產(chǎn)量和含量分別是Y.lipolytica單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的8倍和3倍[52]。

表6 產(chǎn)油酵母菌利用不同有機(jī)廢水合成油脂

廢水中豐富的有機(jī)物以碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)、氨基酸和VFAs等形式存在，可以被產(chǎn)油酵母用作營養(yǎng)物質(zhì)。但是不可忽視的是，有些廢水中還含有高濃度的有機(jī)酸以及復(fù)雜的鹽成分，如高濃度的鈉、鈣、鉀、鎂、氯、硫、磷酸鹽、碳酸氫鹽、銨鹽和重金屬等，有些廢水甚至還含有一些不可生物降解的抗生素和難降解的化學(xué)物質(zhì)，這些物質(zhì)都會(huì)影響到產(chǎn)油酵母的生長以及各種代謝活動(dòng)。因此，未來產(chǎn)油酵母利用廢水作為廉價(jià)原料時(shí)，應(yīng)考慮以下方法以加強(qiáng)對(duì)有機(jī)廢水的利用：①對(duì)廢水進(jìn)行預(yù)處理。通過低價(jià)、高效的預(yù)處理，減少菌體抑制物質(zhì)并盡量多地釋放可利用物質(zhì)；②篩選或者馴化可在含有高濃度有機(jī)物廢水里生長的菌株，提高菌株本身對(duì)環(huán)境的耐受性；③大規(guī)模推廣時(shí)，可能不便對(duì)廢水進(jìn)行消毒以維持產(chǎn)油酵母的優(yōu)勢菌種地位，可通過提高產(chǎn)油酵母初始細(xì)胞密度、調(diào)節(jié)pH為產(chǎn)油酵母最適范圍以及與微藻共培養(yǎng)等方式來解決該問題。

2.4 VFAs

揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）通常是指短鏈脂肪酸（C1～C6），如乙酸、異丁酸、丙酸、異戊酸、正丁酸和正戊酸，是有機(jī)廢物厭氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生的廉價(jià)原料，其產(chǎn)量和組成與厭氧發(fā)酵底物和發(fā)酵過程密切相關(guān)。由食物殘?jiān)╢ood waste,FW）產(chǎn)生的VFAs的成本為30美元/噸，不到葡萄糖成本的10%[27]。與其他糖基碳源相比，VFAs具有明顯的成本優(yōu)勢。此外，其脂質(zhì)轉(zhuǎn)化路徑更短且理論轉(zhuǎn)化率更高[55]。因此，VFAs被認(rèn)為是生產(chǎn)微生物油脂極具前景的廉價(jià)碳源。

一些研究已證實(shí)了產(chǎn)油酵母如Y.lipolytica、R.toruloides和C.curvatus等可將VFAs轉(zhuǎn)化為微生物油脂（表7）。VFAs可作為唯一碳源用于合成微生物油脂，但通常油脂產(chǎn)量較低，油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅在20%左右[5]，所以為提高其轉(zhuǎn)化率，可與葡萄糖或者甘油等共同作為碳源，通過兩階段的培養(yǎng)模式獲得較高的油脂產(chǎn)量。在Fei等[27]的研究中，VFAs作為單一碳源時(shí)，油脂產(chǎn)量和質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.65g/L和25.1%，通過培養(yǎng)模式的優(yōu)化，其油脂產(chǎn)量和含量可分別提高20倍和2倍。

VFAs中不同有機(jī)酸的組成對(duì)油脂產(chǎn)量影響顯著，F(xiàn)ei等[5]研究了乙酸、丙酸、丁酸以不同比例混合的VFAs作為碳源時(shí)對(duì)C.albidus生長和油脂合成的影響。結(jié)果表明，乙酸比例較高的組別相對(duì)于比例均衡的組別，所獲生物量、油脂產(chǎn)量和含量均較高。類似的結(jié)果也在其他學(xué)者的研究中得到印證[56]，且發(fā)現(xiàn)無論VFAs濃度高低與否，產(chǎn)油酵母均表現(xiàn)出對(duì)乙酸的偏愛，利用率更高，而丙酸和丁酸的利用率較低。在Liu等[56]的研究中發(fā)現(xiàn)乙酸的利用率達(dá)99%以上，而丙酸的利用率僅為35%。Gao等[57]還發(fā)現(xiàn)，無論是單酸體系還是混合酸體系，乙酸的消耗速率均更快，且Y.lipolytica對(duì)不同類型VFAs的利用不是同步進(jìn)行的，而是逐步進(jìn)行的，即優(yōu)先使用乙酸合成脂質(zhì)，然后再使用丙酸和丁酸，且當(dāng)有足夠的乙酸作為碳源時(shí)，丙酸和丁酸的代謝甚至可能會(huì)受到抑制或停止。因此，增加VFAs中乙酸的比例可能是促進(jìn)油脂生產(chǎn)的有效方法。

表7 產(chǎn)油酵母菌利用VFAs合成油脂

實(shí)際發(fā)酵過程中，污泥產(chǎn)生的VFAs濃度為2～8g/L，而食品殘?jiān)?、?dòng)物或人類糞便以及高含量有機(jī)廢水的VFAs的濃度相對(duì)較高，為10～40g/L。因此為推動(dòng)實(shí)際高濃度VFAs應(yīng)用于微生物產(chǎn)油脂并減少稀釋成本和反應(yīng)器容積，一些學(xué)者研究了如何高效利用高濃度VFAs。對(duì)于大多數(shù)產(chǎn)油微生物利用葡萄糖作為碳源時(shí)，弱酸環(huán)境（pH=5～6）是較適宜的發(fā)酵環(huán)境，但是Gao等[60]研究表明，弱堿性環(huán)境更適宜Y.lipolytica利用高濃度乙酸（30～110g/L）。弱堿性環(huán)境可緩解高濃度乙酸的抑制作用，且在各乙酸濃度下，pH=8皆為最適pH，最高油脂產(chǎn)量和含量均在乙酸濃度為70g/L時(shí)獲得，分別為10.11g/L和28%。Liu等[58]也驗(yàn)證了堿性環(huán)境對(duì)高濃度VFAs的利用有促進(jìn)作用，40g/L乙酸作為碳源時(shí)，C.curvatusATCC 20509在pH=8時(shí)可獲得6.32g/L的油脂產(chǎn)量和65.3%的油脂含量，乙酸利用率高達(dá)95.1%，分別為中性環(huán)境下所得結(jié)果的3.49倍、1.26倍和1.26倍。此外Liu也表明增加初始菌種接種比或降低C/N比也有利于高濃度VFAs的利用。

利用VFAs這一廉價(jià)發(fā)酵產(chǎn)物作為產(chǎn)油酵母的原料是可行的，實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)注意其抑制作用，并可通過調(diào)節(jié)pH、優(yōu)化接種比、C/N比和培養(yǎng)模式等方法，提高產(chǎn)油酵母對(duì)VFAs的轉(zhuǎn)化率和油脂產(chǎn)量。

3 結(jié)語與展望

無論是基于國際能源發(fā)展趨勢還是我國的能源發(fā)展規(guī)劃，可再生能源和清潔能源都是現(xiàn)階段以及未來的研究熱點(diǎn)和研究重點(diǎn)。產(chǎn)油酵母合成的微生物油脂來源廣泛、生產(chǎn)速率快且?guī)缀醪皇芟抻跉夂蚝图竟?jié)等因素，是生物柴油生產(chǎn)的理想原料。如果能攻克高昂的原料成本問題，微生物油脂在實(shí)際應(yīng)用中的競爭優(yōu)勢將大幅提高。本文綜述的來自工農(nóng)業(yè)和生活中的廢棄物質(zhì)（廢水）木質(zhì)纖維素、粗甘油、有機(jī)廢水和VFAs，都具有原料充足、廉價(jià)易得、有機(jī)物含量高以及成分復(fù)雜的特點(diǎn)，在經(jīng)過有效預(yù)處理后均可被產(chǎn)油酵母高效利用。這不僅可以解決廢棄物的處理問題，還能變廢為寶，生產(chǎn)增值物質(zhì)生物柴油，具有極高的環(huán)境效益和經(jīng)濟(jì)效益。總結(jié)現(xiàn)有的研究成果，未來利用這些廉價(jià)原料作為產(chǎn)油酵母的原料時(shí)，還需要進(jìn)一步的技術(shù)研發(fā)和構(gòu)建生物柴油生產(chǎn)系統(tǒng)，主要有以下幾點(diǎn)建議。

（1）采取高效預(yù)處理技術(shù)提高廉價(jià)原料的可利用性。這些來自工農(nóng)業(yè)和生活中的廢棄物，除了含量較高的有機(jī)物，還含有許多不利于酵母生長和代謝的雜質(zhì)。進(jìn)行有效的預(yù)處理可以提高產(chǎn)油酵母對(duì)這些原料的利用率和油脂產(chǎn)量。同時(shí)應(yīng)注意，這些處理技術(shù)應(yīng)盡量低成本，并且盡量避免造成二次抑制。

（2）利用基因工程或共培養(yǎng)技術(shù)，強(qiáng)化產(chǎn)油酵母對(duì)這些原料的適應(yīng)和利用。這些成分復(fù)雜的原料可能不利于一些微生物的適應(yīng)和生存，因此可利用基因工程構(gòu)建、篩選、馴化高效適應(yīng)的菌種，簡化原料預(yù)處理步驟，減少預(yù)處理成本?，F(xiàn)階段利用基因工程提高油脂產(chǎn)量的方法主要有：脂肪酸（FAs）合成途徑中關(guān)鍵酶的過表達(dá)、TAG合成途徑中關(guān)鍵酶的過表達(dá)、TAG合成旁路的調(diào)控、阻礙競爭途徑[4,65-66]。如Y.lipolytica通過過表達(dá)一些天然異源基因，就能夠有效地利用木糖作為碳源來生產(chǎn)脂質(zhì)，脂質(zhì)產(chǎn)量高達(dá)16.5g/L，脂質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)67%[67]。此外，在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模一般通過滅菌來保持產(chǎn)油酵母優(yōu)勢菌種的狀態(tài)，實(shí)際規(guī)?；瘧?yīng)用過程中，滅菌操作難以完成，因此可考慮通過共培養(yǎng)技術(shù)或加大接種量等途徑促進(jìn)菌種適應(yīng)和油脂合成。

（3）構(gòu)建廢棄物收集→微生物油脂合成→生物柴油生產(chǎn)→廢棄物收集的綠色閉合循環(huán)系統(tǒng)。未來實(shí)現(xiàn)生物柴油穩(wěn)定、低價(jià)的生產(chǎn)應(yīng)構(gòu)建一套閉環(huán)的綠色循環(huán)系統(tǒng)：首先保證廉價(jià)原料的持續(xù)穩(wěn)定供應(yīng)，其后產(chǎn)油酵母高效合成微生物油脂，微生物油脂再有序轉(zhuǎn)化為生物柴油。此過程產(chǎn)生的廢棄物可循環(huán)再次作為原料，形成一套零排放的循環(huán)系統(tǒng)，符合清潔生產(chǎn)理念。