Rnd3表達改變對糖尿病大鼠內皮祖細胞生物學特性的影響*

張書婭，邵鐘銘，伍彩霞，劉曉曉，鄒 園，揭 偉，△，郭峻莉△

（1海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院海南省熱帶心血管病研究重點實驗室，海南醫(yī)學院急救與創(chuàng)傷研究教育部重點實驗室，海南?？?71199；2廣東醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理學系，廣東湛江524023）

當前全球糖尿病患病率增長迅速且居高不下。據(jù)統(tǒng)計，2019年糖尿病患病數(shù)僅在20～79歲年齡段全世界就有4.63億；預計到2045年，這個數(shù)字將會增加超過7億［1］。血糖持續(xù)控制不良的情況下，糖尿病血管并發(fā)癥的患病率、致殘率和致死率也相應增加。血管功能障礙在糖尿病血管并發(fā)癥易感性方面起著重要作用，也是獨立預測因子［2］。內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是內皮細胞的前體細胞，并且是多能干細胞，在再生醫(yī)學研究中具有重要的地位［3］。糖尿病狀態(tài)下EPCs數(shù)量和功能受損是糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生的重要機制。在血管受到缺血或缺氧刺激時，骨髓來源的EPCs可從骨髓動員到外周血并趨化遷移至缺血損傷部位分化為成熟的血管內皮細胞，形成新生血管，直接發(fā)揮其血管新生作用，也可通過分泌促血管新生的細胞因子以“旁分泌”的形式間接發(fā)揮其促血管新生的作用［4-5］。因而，EPCs的數(shù)量及增殖、遷移和分化等功能與血管疾病進程和死亡率呈負相關［6-7］。

Rho家族GTP酶3（Rho family GTPase 3，Rnd3）是小GTP酶Rho家族的Rnd亞家族成員［8-9］，可以競爭性結合RhoA的靶分子ROCK1而拮抗RhoA的生物學功能，在細胞的骨架和極性維持、周期、凋亡、遷移及黏附過程中起到了關鍵作用［10-13］。早期有研究顯示［14］，與消瘦的非糖尿病人群相比，伴有肥胖的Ⅱ型糖尿病患者的骨骼肌組織中Rnd3表達增加，ROCK1活性減少，初步提出了糖尿病狀態(tài)與Rnd3表達之間的關系。本課題組前期結果顯示，Rnd3表達不足抑制了心肌梗死后血管新生，因而是體內調控血管新生的重要因子［15］。關于Rnd3與EPCs功能的關系，特別是在糖尿病狀態(tài)下的影響，目前尚未見報道。本研究旨在應用Rnd3基因敲除的大鼠，首次探討糖尿病狀態(tài)下Rnd3改變對骨髓源性EPCs一般生物學特性的影響，為后續(xù)相關機制和在體研究提供實驗依據(jù)和理論基礎。

材料和方法

1 實驗動物

6周齡雌性和雄性Rnd3基因敲除的雜合子（Rnd3+/-）Sprague-Dawley（SD）大鼠均由江蘇賽業(yè)生物科技有限公司提供，許可證號為SYXK（粵）2015-0147。Rnd3+/-大鼠飼養(yǎng)并繁殖于廣東醫(yī)科大學醫(yī)學實驗動物中心，子代鼠經(jīng)基因型分析，分別得到Rnd3+/-和野生型（wild-type，WT）大鼠。

2 材料和主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基和鏈脲佐菌素（Sigma）；EGM-2專用培養(yǎng)基（LONZA）；FITC-UEA-1和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自Gibco；大鼠淋巴細胞分離液（天津灝洋生物公司）；DiI標記的乙?；兔芏戎鞍祝―iI-acLDL）購自廣州奕源生物科技有限公司；抗β-actin抗體（Santa Cruz）；抗caspase-3抗體（CST）；抗Bcl-2抗體（Proteintech）；增強型CCK-8試劑盒（碧云天）；Matrigel和Transwell小室（Corning）；血管內皮生長因子（vascular endothlial growth factor，VEGF）ELISA試劑盒（R&D）。

3 實驗方法

3.1 糖尿病SD大鼠模型建立與分組委托江蘇賽業(yè)生物公司基于CRISPR/Cas9技術構建Rnd3基因敲除SD大鼠，經(jīng)PCR和測序鑒定合格的Rnd3+/-大鼠用于后代繁育，得到Rnd3+/-和WT大鼠。分別使用成年Rnd3+/-和WT大鼠來構建糖尿病動物模型，參考既往報道進行［16］。簡言之，使用高脂飼料適應性喂養(yǎng)大鼠1周。將STZ與檸檬酸鈉緩沖液混勻，配制終濃度為10 g/L。實驗組予STZ溶液以60 mg/kg一次性腹腔注射，對照組注射等比例檸檬酸鈉緩沖液。期間飼以高脂飼料。STZ注射3周后，以連續(xù)2次空腹血糖值≥16.7 mmol/L為建模成功。實驗分為4組：WT對照（WT-Ctrl）組、WT糖尿?。╓T-DM）組、Rnd3基因敲除雜合子對照（Rnd3+/--Ctrl）組和Rnd3基因敲除雜合子糖尿病（Rnd3+/--DM）。每組20只大鼠。

3.2 大鼠骨髓源性EPCs的分離、培養(yǎng)及鑒定采用既往報道方法進行［17］。簡言之，大鼠經(jīng)阿佛汀完全麻醉后，將雙下肢迅速剝離，注意保持完整性。使用RPMI-1640培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔，經(jīng)70μm濾網(wǎng)過濾。采用大鼠淋巴細胞分離液分離出骨髓單個核細胞，RPMI-1640培養(yǎng)基清洗1次。將得到的細胞加入EGM-2內皮細胞專用完全培養(yǎng)基，輕輕重懸底層細胞。培養(yǎng)皿放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。48 h后吸取上清，二次接種于新的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。以后每48～72 h用EGM-2完全培養(yǎng)基換液。收集第3代貼壁細胞，加入10 mg/L的DiI-acLDL，避光于37℃孵育4 h；PBS漂洗2次，4%多聚甲醛固定20 min；加入10 mg/L的FITC-UEA-1，避光孵育1 h，PBS漂洗3次，加入抗熒光淬滅封片液封片。使用激光掃描共聚焦顯微鏡鑒定。DiI-acLDL和FITC-UEA-1表達雙陽性可以鑒定為EPCs［18］。本實驗所用的EPCs未做純度檢測。

3.3 CCK-8法檢測細胞活力取WT-Ctrl、WT-DM、Rnd3+/--Ctrl和Rnd3+/--DM組生長狀態(tài)良好的第2代EPCs以每孔3×103接種于96孔板，每組6個復孔。每孔加入10μL CCK-8試劑，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，酶標儀上讀取450 nm的吸光度（A）值。共設置0 d、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d共6個時點。

3.4 Western blot檢測各組EPCs的細胞凋亡相關分子的表達分別提取各組第2代EPCs總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，每孔按35μg蛋白上樣，經(jīng)12%的SDS-PAGE分離。蛋白轉移至NC膜，各膜經(jīng)含5%BSA的TBST室溫搖床上封閉2 h，TBST洗滌2次后與相應Ⅰ抗過夜4℃孵育?？贵w使用情況如下：Bcl-2，1∶500；caspase-3，1∶1 000；β-actin，1∶2 000。TBST洗滌15 min×3遍，各膜再與HRP-標記IgG室溫下結合1 h，洗滌后經(jīng)ECL發(fā)光液顯影，天能凝膠成像分析系統(tǒng)掃描和分析條帶。

3.5 Transwell小室細胞遷移實驗第2代細胞以無血清同步化2 h，各組細胞以每孔2×104的數(shù)量（總體積200μL，含0.5%FBS）接種于Transwell小室的上室，下室每孔加入500μL含10%FBS的EGM-2完全培養(yǎng)液，細胞常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出小室，PBS清洗小室2遍，用棉簽輕輕擦去微孔膜上層的細胞。4%多聚甲醛固定20 min后，結晶紫染色30 min，三蒸水漂洗3次，晾干，倒置顯微鏡觀察，拍照計數(shù)。每組設置3個復孔。

3.6 ELISA檢測EPCs上清液中VEGF含量分別將同樣數(shù)量的對數(shù)生長期的第2代EPCs接種于6孔板，收集24 h貼壁后各孔內細胞上清標記為0 d組，細胞繼續(xù)培養(yǎng)3 d后再次收集未換液的細胞上清，標記為3 d組。根據(jù)ELISA試劑盒配制所有試劑與樣品進行VEGF濃度檢測。每組3個復孔。

3.7 EPCs成管實驗48孔板每孔加入100μL稀釋后的Matrigel，放入37℃培養(yǎng)箱孵育30 min。第2代EPCs用無血清EBM-2培養(yǎng)基饑餓處理2 h，以每孔2×104的密度接種于Matrigel上，37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h后，置于光鏡下觀察，拍照，使用ImageJ軟件處理圖片。

4 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。采用單因素方差分析進行Tukey兩兩對比分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 成功分離大鼠骨髓源性EPCs

分離的骨髓單個核細胞經(jīng)EGM-2培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)7 d后，可觀察到細胞呈簇狀，周圍呈梭形為主并放射狀生長，集落中央的細胞呈圓形，細胞較小。繼續(xù)培養(yǎng)至21 d左右，細胞形態(tài)相互融合呈典型的“鋪路石”狀（圖1A）。在熒光顯微鏡下觀察，吞噬DiI-acLDL的細胞呈現(xiàn)紅色熒光標記，特異結合FITC-UEA-1的細胞呈綠色熒光，同時攝取DiI-acLDL又結合FITC-UEA-1呈橘黃色熒光標記的雙陽性即為EPCs（圖1B）。

Figure 1.The morphological and functional identification of EPCs.A：morphological change of EPCs at 21 d；B：functional identification of EPCs under fluorescence microscope.The scale bar=150μm.圖1 EPCs的形態(tài)與功能鑒定

2 糖尿病狀態(tài)增強了Rnd3基因敲除對EPCs的活力的抑制效應

CCK-8實驗結果顯示，相對于WT-Ctrl組，WTDM組在3 d時細胞活力顯著下降（P＜0.05），Rnd3+/--Ctrl組在5 d時顯示出顯著下調趨勢（P＜0.05）。與WT-Ctrl和Rnd3+/--Ctrl組對比，Rnd3+/--DM在各時點均顯示了顯著的下降趨勢（P＜0.05），見圖2。

Figure 2.Insufficient expression of Rnd3 promoted the inhibitory effect of diabetes on the viability of EPCs.Mean±SD.n=3-6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs WT-DMgroup；#P＜0.05，##P＜0.01 vs WT-Ctrl group.圖2 Rnd3表達不足促進了糖尿病對EPCs活性的抑制效應

3 糖尿病狀態(tài)下Rnd3基因敲除改變EPCs中細胞凋亡相關蛋白的表達

使用Western blot檢測各組EPCs中凋亡相關蛋白Bcl-2和caspase-3的表達，結果如圖3所示。凋亡抑制蛋白Bcl-2在Rnd3+/--Ctrl組與Rnd3+/--DM組相較于WT-Ctrl組EPCs中的表達都表現(xiàn)為下降，而促進凋亡蛋白總caspase-3則表達上調（P＜0.05，P＜0.01）。本研究中未檢測活化的caspase-3蛋白。

Figure 3.Insufficient expression of Rnd3 changed the expression of apoptosis-related proteins in EPCs from diabetic rats.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs WT-Ctrl group；#P＜0.05 vs WT-DM group.圖3 Rnd3表達不足改變了糖尿病對EPCs凋亡相關蛋白的表達

4 糖尿病狀態(tài)下Rnd3敲除抑制EPCs的細胞遷移能力

Transwell小室遷移實驗結果顯示（圖4），相對于WT-Ctrl組，WT-DM和Rnd3+/--Ctrl組穿過PVDF膜的細胞數(shù)明顯下降（P＜0.05）；與Rnd3+/--Ctrl組對比，Rnd3+/--DM組遷移能力進一步下降（P＜0.05）。

5 糖尿病狀態(tài)下Rnd3敲除抑制EPCs分泌VEGF

應用ELISA檢測各組EPC釋放至培養(yǎng)液上清中VEGF濃度的結果顯示，與WT-Ctrl組相比較，WTDM組和Rnd3+/--Ctrl組EPCs釋放VEGF水平均明顯減弱，提示糖尿病和Rnd3表達減弱均顯著抑制了EPCs釋放VEGF；與Rnd3+/--Ctrl組相比，Rnd3+/--DM組3 d時VEGF濃度與Rnd3+/--Ctrl組相似，均處于與0 d時相似的基線水平，已無進一步下調的空間（圖5）。

6 糖尿病狀態(tài)下Rnd3敲除減弱了EPCs的血管樣結構形成能力

成管實驗結果顯示，糖尿病顯著抑制了EPCs的血管樣結構形成能力，而Rnd3敲除則進一步加劇了糖尿病對EPCs血管樣結構形成能力的抑制效應（圖6）。

討 論

Figure 4.Defects in Rnd3 expression amplified the inhibitory effect of diabetes on the migration of EPCs.The scale bar=200μm.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs WT-Ctrl group；#P＜0.05 vs Rnd3+/--Ctrl group.圖4 Rnd3敲除放大了糖尿病對EPCs遷移的抑制效應

Figure 5.Insufficient expression of Rnd3 deteriorated the inhibitory effect of diabetes on the secretion of VEGF in EPCs（2×105 cells）.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs WT-Ctrl group；##P＜0.01 vs WT-DMgroup；△△P＜0.01 vs day 0.圖5 Rnd3敲除惡化了糖尿病對EPCs中VEGF分泌的抑制作用

Figure 6.Insufficient expression of Rnd3 deteriorated the inhibitory effect of diabetes on the ability of EPCs to form tube-like structures.The scale bar=200μm.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs WT-Ctrl group；#P＜0.05 vs Rnd3+/--Ctrl group；△P＜0.05 vs WT-DMgroup.圖6 Rnd3敲除惡化了糖尿病對EPCs血管樣結構形成能力

血管內皮細胞功能紊亂是糖尿病血管并發(fā)癥的根本原因。糖尿病傷口局部血管新生及傷口愈合與EPCs的數(shù)量及功能密切相關［19-20］。已經(jīng)證實，無論是I型糖尿病還是II型糖尿病患者，其外周血EPCs的數(shù)量和血管生成功能均顯著下降［21-22］，但相關的機制仍不明確。因而，明確糖尿病患者EPCs數(shù)量減少及功能受損的機制，從而尋找合適靶點來改善患者自體EPCs增殖和遷移等功能，并提高其分泌促血管新生因子的能力，可能為將來EPCs移植治療糖尿病缺血性心血管病提供重要的理論基礎。

預實驗發(fā)現(xiàn)，糖尿病狀態(tài)下野生型EPCs要比正常狀態(tài)下EPCs中Rnd3蛋白的表達減少（未發(fā)表資料），同時鑒于前期觀察到Rnd3表達不足后顯著抑制了心肌梗死后的血管生成能力［15］，我們設想Rnd3不足也可能影響了EPCs的功能。為此，本研究基于CRISPR/Cas9技術編輯了大鼠Rnd3基因，獲得Rnd3基因敲除后的雜合子和WT鼠，復制了糖尿病模型，分離了骨髓源性EPCs，首次探索Rnd3不足對EPCs一般生物學特性的影響。實驗結果顯示，糖尿病狀態(tài)明顯減弱了野生型SD大鼠骨髓源性EPCs的活力、遷移和旁分泌VEGF能力，促進細胞凋亡的蛋白表達增加，功能上表現(xiàn)為成血管能力的削弱。這些結果與既往的他人報道的有關糖尿病損傷EPCs的基本生物學功能的結果高度一致［23-25］。本實驗發(fā)現(xiàn)Rnd3表達與既往Chun等［14］的報道的在糖尿病患者骨骼肌中Rnd3表達上調的結果相反，其原因可能為Chun等［14］的報道納入對象為消瘦非糖尿病、肥胖非糖尿病和肥胖伴糖尿病三類人群，肥胖伴糖尿病者與消瘦非糖尿病人群對比，組織中Rnd3表達是升高的；而本研究構建的糖尿病大鼠是消瘦狀態(tài)。兩者實驗對象的差異可能是Rnd3表達趨勢相反的根本原因。本研究中我們首次發(fā)現(xiàn)，Rnd3表達不足明顯的增加了糖尿病對EPCs上述活力、遷移、旁分泌和血管生成等一般生物學特性的負性影響作用，但相關機制尚不明確。

Rnd3是缺乏GTP水解活性的非典型Rho GTP酶，該分子具有多種細胞生物學功能，在細胞增殖、周期、凋亡、遷移、極性化及分化中發(fā)揮重要作用［26-28］。Rnd3不足可影響HIF-1α的穩(wěn)定性而直接抑制HIF-1α下游靶基因VEGF的表達［15］。Rnd3缺陷也可通過影響p65和p50的穩(wěn)定性而促進NF-κB信號的活化［29］。早期的報道顯示糖尿病心肌組織中HIF-1α表達下調而NF-κB信號是活化的［30-31］，由此，我們猜測本研究發(fā)現(xiàn)的Rnd3不足導致EPCs相應生物學功能的缺陷很可能也與HIF-1α和NF-κB信號的異常活化有關。生物信息學分析表明，大鼠Rnd3基因啟動子-2010～120 bp上具有3個低氧反應元件，我們猜測Rnd3與HIF-1α之間極有可能形成信號調控反饋環(huán)路。因此很可能糖尿病時此調控反饋環(huán)路異常調節(jié)是Rnd3參與調控EPCs生物學特性的重要機制之一，但這一猜測還需進一步研究來證實。

總之，本研究基于Rnd3基因編輯大鼠成功復制了II型糖尿病模型，首次發(fā)現(xiàn)Rnd3表達不足促進了糖尿病對骨髓源性EPCs的活力、遷移、血管生成能力的負性影響，因而維持Rnd3表達在防止糖尿病血管并發(fā)癥上具有潛在的靶向干預價值。本研究未做EPCs純度分析，不能排除其中含有其他細胞的可能和由此對結果可靠性和結論可信度的影響。盡管為了保證EPC的質量，我們在實際操作中是盡量用前2代細胞，以上結論仍需更多實驗加以驗證。