lncRNA TDRG1通過調(diào)節(jié)miR-101-3p促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移*

王帥奇，孫 浩，張壽儒，陳利輝，陳秀峰，李 衛(wèi)

（重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胃腸腫瘤中心，重慶400030）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球發(fā)病率最高的腫瘤之一，每年有近160萬例新發(fā)CRC病例［1］。CRC的存活率約為58%，并且一旦CRC進(jìn)入晚期，手術(shù)切除是無用的，患者的預(yù)后極差［2］。盡管一些研究已經(jīng)確定了許多與腫瘤發(fā)生有關(guān)的基因，但這些過程的分子機(jī)制尚不清楚［3-4］。因此，迫切需要進(jìn)一步研究CRC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，尋找具有預(yù)后和治療價值的新的治療靶點。越來越多的研究表明，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在腫瘤的發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和轉(zhuǎn)移［5-6］。最近的報告發(fā)現(xiàn)一些lncRNA在CRC的發(fā)展中起作用［7］。睪丸發(fā)育相關(guān)基因1（testicular development-related gene 1，TDRG1）是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，在多種腫瘤包括肺腺癌、甲狀腺乳頭狀癌、宮頸癌和食管鱗狀細(xì)胞癌中起原癌基因的作用［8-9］。然而，TDRG1在CRC中的作用尚未闡明。在本研究中，我們檢測了CRC組織和正常組織中TDRG1的表達(dá)，并通過構(gòu)建敲減TDRG1表達(dá)的CRC細(xì)胞模型，揭示TDRG1調(diào)節(jié)CRC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的機(jī)制。

材料和方法

1 臨床組織標(biāo)本

于2016年5月～2018年8月，在重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院共收集40對CRC組織及相應(yīng)的癌旁組織。標(biāo)本冷凍保存在-80℃。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)人正常結(jié)腸上皮NCM460細(xì)胞及CRC細(xì)胞系HT-29、SW480和LoVo購自ATCC。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/鏈霉素的McCoy′s 5A和高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco）中。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成了抗TDRG1（sh-TDRG1）和非靶向?qū)φ眨╯h-NC）的慢病毒短發(fā)夾RNA（shRNA），miR-101-3p模擬物（pre-miR-101-3p）和miR-101-3p阻遏物（antimiR-101-3p）及其各自的非靶向序列（pre-NC或anti-NC）。使用Lipofectamine 3000試劑（Life Technologies）轉(zhuǎn)染細(xì)胞。通過qPCR檢測細(xì)胞過度表達(dá)和沉默的效率。

2.3 RT-qPCR實驗使用Trizol試劑（Invitrogen）從細(xì)胞或組織中分離總RNA，并使用PrimeScript RT試劑盒（TaKaRa）將RNA反向轉(zhuǎn)錄成cDNA。RT-qPCR分析采用SYBR Green PCR試劑盒（TaKaRa）進(jìn)行。U6用于標(biāo)準(zhǔn)化miR-101-3p的相對表達(dá)，和β-actin用于標(biāo)準(zhǔn)化TDRG1的相對表達(dá)。采用2-ΔΔCt法計算相對表達(dá)。TDRG1的正向引物序列為5′-CGGGAACAAGCCCTGTG-3′，反 向 引 物 序 列 為5′-CCGGCCCAAAGATGATG-3′；miR-101-3p的正向引物序列為5′-TGCACCTAAAAGGAG-3′，反向引物序列為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6的正向引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；β-actin的正向引物序列為5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，反向引物序列為5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。

2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞活力細(xì)胞以每孔2.5×103個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24、48、72和96 h后，在每個孔中加入10μL CCK-8分析劑（Dojindo）。繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，以0.1%的最終濃度加入DMSO，使用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測溶液的吸光度（A）值。

2.5 集落形成實驗將細(xì)胞以每孔1×103接種在6孔板中，并加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染2周后，用甲醇固定細(xì)胞，用0.1%結(jié)晶紫（Sigma）染色。在顯微鏡下計算可見集落數(shù)。

2.6 Transwell測定在遷移實驗中，將細(xì)胞以每孔1×105的密度接種到24孔Transwell小室中，在上腔室中加入無血清培養(yǎng)基，在下腔室中加入完全培養(yǎng)基。孵育24 h后，將細(xì)胞用含有0.1%結(jié)晶紫的染料溶液染色。之后，使用顯微鏡拍攝照片，并從6個視野中隨機(jī)計數(shù)細(xì)胞。對于侵襲實驗，使用預(yù)先涂有BD BioCoat Matrigel的Transwell室（BD Biosciences）檢測細(xì)胞侵襲能力，其余步驟與細(xì)胞遷移測試相同。

2.7 雙螢光素酶報告基因檢測通過雙重螢光素酶報告基因確認(rèn)TDRG1和miR-101-3p之間關(guān)系。用PCR擴(kuò)增含有預(yù)測miR-101-3p結(jié)合位點的TDRG1片段，克隆到含有螢光素酶的報告載體中來構(gòu)建TDRG1野生型（TDRG1-WT）。為了使預(yù)測的miR-101-3p結(jié)合位點在TDRG1內(nèi)發(fā)生突變，將假定的結(jié)合位點序列替換為TDRG1突變型（TDRG1-Mut）。用Lipofectamine 3000將載體和pre-miR-101-3p共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞。48 h后，通過細(xì)胞裂解提取樣品以檢測螢光素酶活性。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS17.0進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組之間的差異通過Student′st檢驗進(jìn)行了分析，多組間比較采用單因素方差分析以及Bonferroni事后檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TDRG1在人CRC組織中的表達(dá)情況

應(yīng)用RT-qPCR檢測CRC組織中TDRG1的表達(dá)水平。如圖1所示，與匹配的癌旁組織相比，在CRC組織中觀察到TDRG1的表達(dá)水平顯著增加（P＜0.01），見圖1A。此外，我們檢測了TDRG1在CRC細(xì)胞系中的表達(dá)，結(jié)果表明，與正常細(xì)胞NCM460相比，TDRG1在CRC細(xì)胞系HT-29、SW480和LoVo中明顯上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），見圖1B。TDRG1表達(dá)與腫瘤病理參數(shù)的關(guān)系分析顯示，TDRG1表達(dá)與CRC的腫瘤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小呈正相關(guān)（P＜0.05），見表1。

Figure 1.TDRG1 was highly expressed in CRCtissues and cells.A：the expression of TDRG1 was analyzed by RT-qPCR（n=40）；B：the relative expression of TDRG1 in 3 colorectal cancer cell lines and normal NCM460 cells was analyzed by RT-qPCR（n=3）.Mean±SD.**P＜0.01 vs normal tissues；#P＜0.05，##P＜0.01 vs NCM460 group.圖1 TDRG1在CRC組織和細(xì)胞中高表達(dá)

表1 TDRG1表達(dá)與腫瘤病理參數(shù)的關(guān)系Table 1.Relationship between TDRG1 expression and tumor pathological parameters

2 敲減TDRG1基因的表達(dá)對SW480細(xì)胞增殖及侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響

為了探討TDRG1在CRC進(jìn)展中的作用，用敲減SW480細(xì)胞株中TDRG1表達(dá)（圖2A）的方法檢測細(xì)胞增殖及侵襲能力。如圖2B、C所示，敲減TDRG1基因的表達(dá)抑制了SW480細(xì)胞的活力和集落形成能力（P＜0.01）。此外，sh-TDRG1轉(zhuǎn)染可觀察到遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.01），見圖2D。

3 miR-101-3p是TDRG1的直接靶點

越來越多的證據(jù)表明，lncRNA可作為相應(yīng)miRNA的ceRNA［10］。因此，利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫Starbase 2.0預(yù)測miR-101-3p作為TDRG1的靶點（圖3A），并通過雙螢光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C了二者關(guān)系（圖3B）。隨后，RT-qPCR分析顯示，敲減TDRG1的表達(dá)上調(diào)了SW480細(xì)胞中miR-101-3p的水平（圖3C）。此外，與正常組織相比，在CRC腫瘤組織中觀察到miR-101-3p低表達(dá)水平（P＜0.05），見圖3D。Pearson相關(guān)分析顯示TDRG1與miR-101-3p呈負(fù)相關(guān)（R2=0.389，P＜0.01），見圖3E。

4 TDRG1通過miR-101-3p調(diào)節(jié)CRC的進(jìn)展

為了進(jìn)一步探討miR-101-3p是否參與TDRG1相關(guān)的CRC進(jìn)展，使用miR-101-3p抑制劑轉(zhuǎn)染到SW480細(xì)胞。圖4A顯示miR-101-3p抑制劑的顯著抑制效率。CCK-8和集落形成實驗的結(jié)果表明，miR-101-3p抑制劑減輕了敲減TDRG1表達(dá)導(dǎo)致的細(xì)胞活力和集落形成能力的降低（圖4B、C）。此外，Transwell實驗表明miR-101-3p抑制劑也減輕了敲減TDRG1表達(dá)引起的細(xì)胞侵襲能力的降低（圖4D）。

討 論

Figure 2.Knock-down of TDRG1 expression inhibited the proliferation，migration and invasion abilities of SW480 cells.A：knockdown efficiency of sh-TDRG1 transfection in SW480 cells；B and C：the proliferation of SW480 cells was detected by CCK-8 assay and colony formation assay；D：Transwell assay was used to detect the migration and invasion abilities of the cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sh-NCgroup.圖2 敲減TDRG1基因的表達(dá)抑制SW480細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力

Figure 3.miR-101-3p was the direct target of TDRG1.A：the binding site between TDRG1 and miR-101-3p was predicted by Starbase 2.0；B：luciferase reporter assay confirmed the interaction between TDRG1 and miR-101-3p in HEK-293T cells；C：knock-down of TDRG1 expression promoted the expression of miR-101-3p in SW480 cells；D：the expression of miR-101-3p in tumor tissues was lower than that in normal tissues；E：there was a negative correlation between miR-101-3p and TDRG1 in CRCtissues.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs pre-NCcells；##P＜0.01 vs sh-NCgroup；△P＜0.01 vs normal tissues.圖3 miR-101-3p是TDRG1的直接靶點

Figure 4.miR-101-3p mediated TDRG1 to regulate the occurrence and development of CRC.A：the knock-down efficiency of miR-101-3p in SW480 cell line was detected by RT-qPCR；Band C：the proliferation of SW480 cells was detected by CCK-8 assay and colony formation assay after transfection；D：the migration and invasion abilities of the cells were detected by Transwell assay.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs sh-NC+anti-NCgroup；#P＜0.05 vs sh-TDRG1+anti-NCgroup.圖4 miR-101-3p介導(dǎo)TDRG1調(diào)控CRC的發(fā)生發(fā)展

CRC是第4大腫瘤相關(guān)死亡原因［10］。越來越多的證據(jù)表明，lncRNA在腫瘤進(jìn)展中起重要作用，并且在CRC中發(fā)現(xiàn)了lncRNA的異常表達(dá)［11-12］。因此，需要明確lncRNA在CRC發(fā)生發(fā)展中的確切作用，以期在CRC治療中尋找新的診斷生物標(biāo)志物。TDRG1是一種新的lncRNA，在多種人類腫瘤中起致癌作用。最近已證實TDRG1通過調(diào)節(jié)miR-326/絲裂原激活的蛋白激酶1或miR-214-5p/SOX4促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲［8-9］。在NSCLC中，TDRG1通過調(diào)節(jié)miR3/ZEB1軸促進(jìn)NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)移［13］。因此，在幾種惡性腫瘤中，TDRG1被認(rèn)為是有效的癌基因。然而，TDRG1在CRC中的作用尚未被探討。在本研究中，我們首先確定TDRG1在CRC中是起促進(jìn)癌癥的lncRNA，并證明TDRG1在人CRC組織中被過度調(diào)節(jié)，其與CRC的腫瘤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小相關(guān)；其次，我們進(jìn)行了功能喪失實驗，以探討TDRG1對CRC細(xì)胞惡性特征的影響。結(jié)果表明，敲減TDRG1的表達(dá)可抑制體外CRC細(xì)胞的增殖和侵襲，提示TDRG1可能作為CRC治療的生物標(biāo)志物。

先前的研究已經(jīng)證明，lncRNA通過與miRNA競爭性結(jié)合而充當(dāng)ceRNA來調(diào)節(jié)癌癥相關(guān)基因的表達(dá)［14］。我們使用了生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫（StarBase 2.0）分析確定了miR-101-3p可能與TDRG1相互作用，并通過隨后的螢光素酶實驗證實了這一點。miR-101-3p被報道為不同腫瘤中的腫瘤抑制miRNA，如乳腺癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌和肝細(xì)胞癌［15-16］。值得注意的是，Jin等［17］發(fā)現(xiàn)miR-101-3p在CRC組織中下調(diào)，miR-101-3p的表達(dá)增加抑制了CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。在這項研究中，我們在CRC腫瘤組織中觀察到miR-101-3p低表達(dá)水平，并且Pearson相關(guān)分析顯示TDRG1與miR-101-3p呈負(fù)相關(guān)。此外，轉(zhuǎn)染miR-101-3p抑制劑部分減輕了敲減TDRG1表達(dá)引起的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的降低?？偠灾?，本研究發(fā)現(xiàn)的miR-101-3p在CRC進(jìn)展中的表達(dá)模式和抑癌作用的研究結(jié)果與Jin等［17］的結(jié)果一致。因此，靶向TDRG1/miR-101-3p可能是治療CRC的一種新途徑。

綜上所述，本研究證明TDRG1是CRC中的一個癌基因，并且與CRC的進(jìn)展密切相關(guān)。敲減TDRG1的表達(dá)聯(lián)合miR-101-3p過表達(dá)在體外具有抑瘤作用，且兩者之間存在負(fù)相關(guān)。TDRG1/miR-101-3p可能在人CRC中發(fā)揮重要作用，為CRC的治療提供了一個有前途的靶點。