丙烯醛-丙氨酸加合物制備與細(xì)胞毒性

鄒照佳，鄭 潔，黃才歡，劉 付，歐仕益*

（暨南大學(xué)理工學(xué)院，廣東 廣州 510632)

丙烯醛是α、β-不飽和醛中最簡單且活性最高的小分子醛，廣泛存在于熱加工食品（如咖啡、酒、油炸土豆等）和環(huán)境（因工業(yè)排放、有機物不完全燃燒等原因產(chǎn)生）中[1-4]。同時，丙烯醛也是一種內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，髓過氧化物酶介導(dǎo)的蘇氨酸降解、胺氧化酶介導(dǎo)的精胺和亞精胺降解均會生成丙烯醛[5]；抗癌藥物環(huán)磷酰胺在體內(nèi)通過細(xì)胞色素P450酶將其轉(zhuǎn)化生成丙烯醛[6]；細(xì)胞膜內(nèi)自由基引發(fā)的多不飽和脂肪酸過氧化中也會生成丙烯醛[7-10]。

丙烯醛屬于高毒性物質(zhì)，對小鼠和大鼠的半數(shù)致死量分別為30、50 mg/kg[11]，且人經(jīng)口攝入的最小致死量為5 mg/kg[12]。通常情況下，丙烯醛的毒性表現(xiàn)為通過親核反應(yīng)修飾DNA和蛋白質(zhì)，降低分子內(nèi)的谷胱甘肽（glutataione，GSH）水平[13-16]。丙烯醛的高親電性致使其極易與生物體內(nèi)的親核大分子發(fā)生反應(yīng)，進而引發(fā)各種疾病，如阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）[17]、 糖尿病[18]、帕金森癥[19]和動脈粥樣硬化[20-25]。陳佳紅等[26]證明丙烯醛可通過消耗細(xì)胞內(nèi)GSH含量以及氧化應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡和壞死，對PC12細(xì)胞表現(xiàn)出急性毒性，為丙烯醛對AD的發(fā)病機制研究提供了依據(jù)。Lovell等[27]報道，在AD患者的大腦中檢測到的丙烯醛濃度與正常大腦表現(xiàn)出顯著差異，并且AD患者大腦杏仁核和海馬體中丙烯醛濃度約為正常人的8 倍。Liu Jinhui等[28]認(rèn)為，丙烯醛誘發(fā)神經(jīng)元受損的缺血性中風(fēng)的機理是它消耗中風(fēng)患者體內(nèi)GSH，以及通過激活亞精胺/亞精胺-N1-乙?；D(zhuǎn)移酶參與了中風(fēng)誘發(fā)的神經(jīng)毒性。Rom等[21]發(fā)現(xiàn)，丙烯醛處理后，小鼠主動脈粥樣硬化的幾種標(biāo)志物含量顯著增加，確認(rèn)了丙烯醛與心血管疾病的關(guān)系。

為了減輕熱加工食品中產(chǎn)生的有毒化合物對生物體造成的危害，人們一直致力于研究能夠降低這些有毒化合物毒性的物質(zhì)。Tao Zhihao等[29]發(fā)現(xiàn)并闡明了阿魏酸消除丙烯醛毒性的機理：在天然酚酸中，阿魏酸具有優(yōu)異且獨特的清除丙烯醛作用，它通過脫羧后與丙烯醛發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，有效抑制丙烯醛對細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的破壞。本課題組前期研究表明，蛋白質(zhì)和氨基酸在丙烯醛清除過程中發(fā)揮著十分重要的作用：Jiang Kaiyu等[30]模擬幾種蛋白在胃腸腸道中消化過程對丙烯醛的清除作用，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的攝入可以明顯降低幾種羰基化合物（如丙烯醛等）對結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞的毒性，其降毒作用歸因于消化過程中釋放的氨基酸，其中半胱氨酸呈現(xiàn)最大的解毒作用； Yin Zhao等[31]在研究中合成分離出了丙烯醛-半胱氨酸加合物，并就其對人支氣管上皮細(xì)胞HBE和Caco-2細(xì)胞毒性進行了檢測，丙烯醛與雙半胱氨酸加合物可通過減輕活性氧和細(xì)胞凋亡干預(yù)，大大降低了丙烯醛誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，而單半胱氨酸-丙烯醛加合物仍具有較高毒性。

半胱氨酸屬于含硫氨基酸，其巰基極易與丙烯醛發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)[30,32]，但氨基酸中氨基的反應(yīng)活性及其與丙氨酸形成的加合物鮮見研究。丙氨酸是僅次于甘氨酸的最簡單氨基酸，在馬鈴薯和面粉中的含量顯著高于甘氨酸[33]。本研究選擇丙氨酸作為丙烯醛的清除劑，通過闡釋其加合物的結(jié)構(gòu)及其反應(yīng)機理，以期為控制食品中的丙烯醛毒性提供一種新策略。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人正常胃上皮黏膜細(xì)胞株（GES-1）由上海酶研生物有限公司提供。

丙烯醛（分析純） 成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司；L-丙氨酸（L-Ala）（純度99%） 北京百靈威科技有限公司；甲醇（色譜純） 美國Mallinckrodt Baker公司； 氘代水 美國Cambridge Isotope Laboratories公司；A-HG型十八烷基鍵合硅膠 日本東京YMC有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHA-BA恒溫振蕩器 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠； 精密電子天平 廣州市艾安得儀器有限公司；LC-20AT型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析系統(tǒng)（配有SPD-M20A光電二極管陣列檢測器）、LC-MS8045三重四極桿液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源） 日本島津儀器公司； ZORBAX SB-Aq色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 美國Agilent公司；N-1300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本東京理化器械株式會社；Scientz-10N型真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技有限公司；X500R QTOF型高分辨質(zhì)譜儀 美國SCIEX公司；600 MHz Avance III型核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）儀 瑞士布魯克公司；MB-580型酶標(biāo)儀 深圳匯松科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 丙氨酸對丙烯醛清除率檢測

對照組：于100 mL具塞錐形瓶中加入20 mL去離子水，再加入1 mmol丙烯醛后封口膜封緊瓶口；實驗組：100 mL具塞錐形瓶中加入20 mL去離子水，依次加入1 mmol丙氨酸和丙烯醛后封口膜封緊瓶口。在50 ℃水浴溫度下分別反應(yīng)90、120 min后，參照文獻[34]檢測反應(yīng)體系中剩余丙烯醛質(zhì)量濃度。

1.3.2 加合物的制備及條件優(yōu)化

反應(yīng)在100 mL的具塞錐形瓶中進行，溶液體積20 mL。設(shè)置不同反應(yīng)物濃度比（c（丙烯醛）∶c（丙氨酸））為2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4，加蓋并用封口膜封口后，于恒水浴振蕩器中反應(yīng)0.5、3、5、6 h，溫度分別為 37、50 ℃。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，用0.45 μm微孔濾膜過濾，用HPLC測定生成加合物含量，選擇出目標(biāo)加合物含量高且易分離的反應(yīng)條件。

1.3.3 HPLC法檢測加合物含量的分析條件

流動相為體積分?jǐn)?shù)5%甲醇-水溶液；流速0.6 mL/min； ZORBAX SB-Aq色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；進樣量為10 μL；加合物的檢測波長220 nm。在此條件下進行檢測，根據(jù)目標(biāo)加合物峰面積確定加合物含量。

1.3.4 目標(biāo)加合物的分離純化

在優(yōu)化后的反應(yīng)條件下合成樣品：丙烯醛與丙氨酸濃度比為1∶2，50 ℃水浴中反應(yīng)5 h。反應(yīng)后，收集反應(yīng)液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓旋蒸除去大部分溶劑水，濃縮得到待分離的反應(yīng)液1～2 mL。

將濃縮后的反應(yīng)液經(jīng)過0.22 μm微孔濾膜過濾后，加到平衡好的反相硅膠層析柱（30 mm×500 mm）上端，進行柱層析分離。反相硅膠填料體積為250 mL，平衡條件：依次用70%、50%、30%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇溶液沖洗1 倍柱體積，再用洗脫劑25%甲醇溶液平衡3 倍柱體積。分離純化條件：流速1 mL/min；洗脫劑為5%甲醇溶液，用量為0.3 L，等度洗脫150 mL后開始收集樣品，餾分體積為5 mL。各餾分液用0.45 μm微孔濾膜過濾后，HPLC法測定目標(biāo)加合物的純度。合并高純度餾分并冷凍干燥48 h，獲得目標(biāo)加合物固體。

1.3.5 目標(biāo)加合物的結(jié)構(gòu)鑒定

將10 mg 1.3.4節(jié)所得目標(biāo)加合物固體溶于純水中，用紫外全波長掃描、高分辨質(zhì)譜（離子源為電噴霧離子源，掃描范圍為m/z50～1500）分析獲得目標(biāo)加合物相對分子質(zhì)量，LC-MS聯(lián)用獲得一級、二級質(zhì)譜圖；取35 mg目標(biāo)產(chǎn)物純物質(zhì)溶于550 μL氘代水中，經(jīng)核磁氫譜（1H NMR）、核磁碳譜（13C NMR）、核磁Dept-135譜（Dept-135 NMR）分析，鑒定其結(jié)構(gòu)。

LC-MS條件：ZORBAX SB-Aq色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為5%甲醇-水溶液，流速：0.3 mL/min，進樣量為1 μL；柱溫40 ℃，檢測波長220 nm；以正離子模式運行，離子源為電噴霧離子源，掃描范圍為m/z50～800；離子源溫度為300 ℃，去溶劑化溫度為250 ℃；毛細(xì)管電壓為4000 V，掃描速率為1000 Da/s，電離能15 eV。

NMR條件：用550 μL D2O溶液溶解35 mg目標(biāo)加合物純品，并用Avance III光譜儀（600 MHz）分析，獲得1H NMR、13C NMR。

1.3.6 細(xì)胞毒性實驗

采用噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）[35]法分別檢測丙烯醛及加合物對人正常胃細(xì)胞（GES-1）毒性。GES-1細(xì)胞采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至匯合率為70%～80%時，采用0.25%的胰酶消化成單細(xì)胞懸液，顯微鏡下觀察計數(shù)后，向96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（除外周36 孔）中加入100 μL 1×105個/mL的單細(xì)胞懸液。采用不同濃度的加合物和丙烯醛（0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、1、2 mmol/L）孵育細(xì)胞，在37 ℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h和48 h后，用0.0067 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗掉藥物，再用200 μL含有質(zhì)量濃度5 mg/mL MTT溶液的培養(yǎng)基替代藥物，37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，移除培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜溶液，置搖床上低速振蕩10 min，使用酶標(biāo)儀于570 nm波長處檢測吸光度，按下式計算細(xì)胞存活率。每個濃度處理重復(fù)3 次，細(xì)胞存活率均以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

式中：A1為藥物組的吸光度；A2為對照組的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel軟件處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用SPSS 22.0軟件進行方差分析和半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）計算，并在P＜0.05水平下進行Duncan顯著性差異分析。NMR圖譜經(jīng)Mestrenova軟件進行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 丙烯醛清除率

實驗中丙烯醛標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝0.0258x-0.0855，R2＝0.9887（其中x代表丙烯醛質(zhì)量濃度，y代表吸光度）。根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得對照組和實驗組的丙烯醛清除率如表1所示，相比于對照組，實驗組在90 min后的丙烯醛消除率即接近80%，說明丙氨酸對丙烯醛有較高的清除能力。

表 1 丙氨酸對丙烯醛清除率Table 1 Elimination of acrolein by alanine

2.2 加合物的分離純化

采用不同濃度比的丙烯醛與丙氨酸反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物中除丙氨酸外，還出現(xiàn)一個峰面積較大的新產(chǎn)物 （圖1A）。其中，丙烯醛與丙氨酸濃度比為1∶2，在50 ℃反應(yīng)5 h后，新產(chǎn)物的峰面積最大，因此以此為最佳反應(yīng)條件制備加合物。

經(jīng)反相硅膠層析柱細(xì)分離后的目標(biāo)加合物用HPLC法檢測，色譜結(jié)果如圖1B所示。純化后目標(biāo)加合物的保留時間為5.926 min（圖1B），經(jīng)紫外全波長掃描，目標(biāo)產(chǎn)物的最大吸收波長是220 nm（圖1C）。根據(jù) 圖1B峰面積積分計算得出純化后獲得的目標(biāo)加合物純度可達(dá)95%以上。

圖 1 丙烯醛與丙氨酸反應(yīng)產(chǎn)物（A）、純化后目標(biāo)產(chǎn)物（B）的HPLC圖及純化后目標(biāo)產(chǎn)物的全波長掃描圖（C）Fig. 1 HPLC chromatogram of the products of reaction between acrolein and alanine (A), and HPLC chromatogram (B) and fullwavelength spectrum (C) of the purified product

2.3 目標(biāo)加合物的結(jié)構(gòu)鑒定

純化后的目標(biāo)產(chǎn)物經(jīng)高分辨質(zhì)譜法檢測結(jié)果如 圖2所示。該物質(zhì)相對分子質(zhì)量為183.0823，分子式為C9H13NO3。

圖 2 目標(biāo)加合物的高分辨質(zhì)譜圖Fig. 2 High resolution mass spectrum of the purified adduct

純化后的目標(biāo)加合物經(jīng)LC-MS分析所得的一級、二級質(zhì)譜如圖3所示，從一級質(zhì)譜圖可以看到明顯的 [M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+峰（圖3A），再次確定了加合物相對分子質(zhì)量為183，且二級質(zhì)譜圖中脫羧峰 [M-45]+（圖3B）的存在以及較少的碎片離子峰表明目標(biāo)加合物中仍存在一個完整的羧基，化合物結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定。

圖 3 正離子模式下純化產(chǎn)物的一級質(zhì)譜（A）和目標(biāo)產(chǎn)物 （MW＝ 183）的二級質(zhì)譜（B）Fig. 3 Primary (A) and secondary (B) mass spectra of the purified product (with molecular mass of 183) in positive ion mode

圖 4 目標(biāo)加合物的1H NMR（A）、13C NMR（B）、 Dept-135 NMR（C）圖譜Fig. 4 1H-NMR spectrum (A), 13C NMR spectrum (B), and Dept-135 spectrum (C) of the adduct

目標(biāo)加合物的13C NMR、1H NMR圖譜如圖4所示，根據(jù)13C NMR和Dept-135 NMR分析可得：δ193.69（—CHO），δ149.11、δ133.54（環(huán)內(nèi)—CH＝C—），δ45.46 （環(huán)內(nèi)—N—CH2—C—），δ48.87（環(huán)內(nèi)—N—CH2—CH2—），δ23.8（環(huán)內(nèi)—CH2—C—），δ173.64（-COOH）。 根據(jù)1H NMR分析可得：δ9.45s（-CHO）、δ7.32m（環(huán)內(nèi) —CH＝C—）、δ4.79（D2O）、δ1.57d（—CH3）。Zhu Qin等[13]探討了含有不同親核基團的丙烯醛清除劑對丙烯醛的清除作用以及其可能的反應(yīng)機理，結(jié)合本研究結(jié)果推測該加合物的結(jié)構(gòu)應(yīng)為如圖5所示，并推測出其反應(yīng)機理：丙氨酸的氨基端是良好的親核位點，在常溫或者加熱條件下極易與丙烯醛發(fā)生加成反應(yīng)（先邁克爾加成再羥醛縮合）生成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的環(huán)狀化合物。

圖 5 目標(biāo)加合物的形成機理Fig. 5 Formation mechanism of the adduct

2.4 加合物的細(xì)胞毒性

鑒于丙烯醛廣泛存在于各種熱加工食物中，而丙氨酸也是食品中含量較高的游離氨基酸。上述研究表明，丙氨酸可通過與丙烯醛形成加合物而清除丙烯醛，但加合物的毒性未知。

本課題組前期研究表明，蛋白質(zhì)在消化過程中會降低一些羰基化合物對于Caco-2細(xì)胞的毒性，其中的原因可能與消化過程中釋放的氨基酸有關(guān)[20]。胃是人消化系統(tǒng)的主要器官，也是營養(yǎng)物質(zhì)吸收的核心器官。本研究選取人正常胃上皮細(xì)胞對丙烯醛和加合物的毒性進行探索。結(jié)果表明，丙烯醛和加合物的細(xì)胞毒性存在顯著差異（圖6）。GES-1細(xì)胞活力隨著丙烯醛濃度的增加急劇降低，在丙烯醛濃度達(dá)到0.06 mmol/L時細(xì)胞的存活率僅為38.9%（24 h）、32.2%（48 h），且隨著濃度的增加細(xì)胞的存活率基本上沒有發(fā)生改變，說明在濃度達(dá)到0.06 mmol/L甚至更高時，細(xì)胞已經(jīng)基本死亡，丙烯醛的毒性具有很強的劑量依賴性。由圖6可知，加合物濃度高達(dá)2 mmol/L時，24 h后GES-1細(xì)胞的存活率依然保持在60%以上，毒性明顯低于丙烯醛的毒性。但延長培養(yǎng)時間至48 h后，增加加合物濃度開始顯現(xiàn)出細(xì)胞毒性，1 mmol/L時細(xì)胞存活率出現(xiàn)明顯降低，但細(xì)胞存活率依然保持40%以上。綜上所述，在實驗設(shè)置的濃度范圍內(nèi)，丙烯醛對GES-1細(xì)胞生長有較大的抑制作用，較低濃度的丙烯醛就可導(dǎo)致細(xì)胞存活率快速下降，而加合物在低濃度時對GES-1細(xì)胞生長沒有抑制作用，但高濃度、較長時間（48 h）處理會抑制GES-1細(xì)胞生長。

IC50也說明了兩者的細(xì)胞毒性差異。培養(yǎng)24 h和48 h后，丙烯醛的IC50分別是0.058、0.067 mmol/L，而加合物的IC50分別為3.286、0.869 mmol/L。培養(yǎng)24 h和48 h后加合物的IC50分別為丙烯醛的56.7、12.9 倍，說明加合物的形成大大降低了丙烯醛的細(xì)胞毒性。孵育時間對丙烯醛的毒性影響不大，但延長孵育時間顯著增加了加合物的細(xì)胞毒性（IC50下降了74%），推測可能是加合物被吸收后結(jié)構(gòu)發(fā)生了轉(zhuǎn)化，形成了毒性高于加合物的物質(zhì)。 Yin Zhao等[31]分離純化得到雙半胱氨酸-丙烯醛加合物，在沒有半胱氨酸共同孵育的情況下，該加合物轉(zhuǎn)變成為單半胱氨酸，后者表現(xiàn)出更強的毒性作用。丙烯醛-丙氨酸加合物是否也發(fā)生類似轉(zhuǎn)化需進一步研究。

圖 6 丙烯醛（A）、加合物（B）孵育GES-1細(xì)胞24、48 h后細(xì)胞存活率Fig. 6 Viability of GES-1 cells after incubation with acrolein (A) and the adduct (B) for 24 and 48 hours

3 結(jié) 論

本研究制備并分離純化出了一種丙氨酸-丙烯醛加合物。經(jīng)HPLC檢測該加合物最大吸收波長為220 nm，經(jīng)分離 純化后，確定該加合物的相對分子質(zhì)量為183.0823，結(jié)構(gòu)為一分子丙氨酸與兩分子丙烯醛先經(jīng)過邁克爾加成反應(yīng)再通過羥醛縮合生成一個含氮六元環(huán)的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。加合物的形成大大降低了丙烯醛的細(xì)胞毒性，以加合物和丙烯醛孵育GES-1細(xì)胞24 h和48 h后，加合物的IC50分別是丙烯醛的56.7、12.9 倍，說明丙氨酸可作為丙烯醛的清除劑。但是，隨著加合物孵育時間的延長，高劑量加合物的細(xì)胞毒性增加，其機理有待進一步研究。