牛磺酸-水解大豆蛋白復(fù)合體系對運動性 疲勞大鼠的影響

白海軍，李志江*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)體育教研部，黑龍江 大慶 163000；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163000）

現(xiàn)今社會節(jié)奏的不斷加快，高負(fù)荷的腦力與體力勞動者易出現(xiàn)疲勞癥狀，致使工作效率降低乃至威脅身心健康，研究表明通過適當(dāng)補充抗疲勞外源活性物質(zhì)，是一種方便、靈活的延緩疲勞手段[1-2]。目前已發(fā)現(xiàn)大量具有抗疲勞活性的物質(zhì)，諸如多糖、多肽、植物多酚等，它們在具備抗氧化活性的同時還兼具抗疲勞作用，因而不斷有學(xué)者根據(jù)疲勞產(chǎn)生的“自由基理論”嘗試建立抗氧化能力與抗疲勞作用之間的聯(lián)系[3]，為抗疲勞功能產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù)。牛磺酸作為功能性飲品的常見配料，已被大量研究證實能通過提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力、降低肝組織丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，減輕活性氧自由基對機體產(chǎn)生的氧化損傷，從而達(dá)到緩解疲勞的功效[4]。隨著蛋白質(zhì)工業(yè)技術(shù)的不斷發(fā)展，水解蛋白日益成為國內(nèi)外功能性食品的重要配料，其生物利用率高并含有大量可調(diào)節(jié)機體生理功能的抗氧化活性肽[5-6]，能夠有效抑制生物大分子過氧化反應(yīng)并清除體內(nèi)自由基[7]，且能提高抗氧化酶活性、緩解疲勞[8]。張玉萍等[9]研究發(fā)現(xiàn)水解大豆蛋白在增強大鼠耐力的同時，還能夠降低疲勞小鼠的血乳酸含量，驗證了其具有抗疲勞活性。此外，劉晶等[10]認(rèn)為具有抗疲勞作用的抗氧化物質(zhì)之間存在協(xié)同作用，這種協(xié)同作用有利于增強抗疲勞功效。楊曉等[11]也發(fā)現(xiàn)大豆肽和?；撬峄旌现髮π∈蟮目蛊谛Ч麅?yōu)于大豆肽單體。

活性物質(zhì)功效的評判通常需要建立動物學(xué)模型，目前水解大豆蛋白單體與牛磺酸單體的抗氧化活性與抗疲勞活性已被大量研究證實[12-13]，由于建立動物學(xué)模型實驗周期長、操作繁瑣、成本較高，所以該方法不適用于兩種或多種活性物質(zhì)協(xié)同作用的功能性評價的初篩。因此，本實驗擬選取商業(yè)水解蛋白以及?；撬釂误w復(fù)配?；撬?水解大豆蛋白（taurine-hydrolyzed soybean protein composite，TSPC），通過體外抗氧化實驗對配方進(jìn)行初期篩分，并通過大鼠運動性疲勞模型以及相關(guān)血液生化指標(biāo)進(jìn)行驗證，從而更好地為抗疲勞補充劑協(xié)同作用的后續(xù)實驗研究提供理論依據(jù)，以期為抗疲勞類產(chǎn)品的制備及活性評價提供思路。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級SD種8 周齡雄性健康大鼠50 只（使用許可證號： SYXK（黑）2016-004），個體質(zhì)量約（220±20）g， 購自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，飼養(yǎng)期間給予嚙齒類動物標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及自由飲水，飼養(yǎng)環(huán)境條件：恒定相對濕度55%、室溫（25±1）℃。

水解大豆蛋白（hydrolyzed soybean protein，HSP）、大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI） 山東禹王集團(tuán)有限公司；?；撬帷⑧彵饺?北京百靈 威科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國Sigma 公司；生化指標(biāo)檢測試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600紫外-可見分光光度計 日本島津公司；FC酶標(biāo)儀 美國賽默飛世爾科技公司；磁力攪拌器 德國IKA公司；大鼠跑臺 北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 HSP的水解度測定

HSP的水解度采用三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）沉淀法進(jìn)行分析[14]，根據(jù)TCA沉淀蛋白的特性，以可溶性氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)表征水解度，將1 mg/mL HSP或SPI溶液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% TCA等體積充分混合后，在6000×g條件下離心15 min，并用凱氏定氮法測定沉淀中的氮質(zhì)量。可溶性氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)按公式（1）計算。

式中：m0表示SPI中TCA-沉淀氮質(zhì)量/mg；m1表示HSP中TCA-沉淀氮質(zhì)量/mg；mT為SPI中的總氮質(zhì)量/mg。

1.3.2 TSPC的制備

在室溫下準(zhǔn)確稱取牛磺酸和HS P并用去離子水稀釋，控制HSP的質(zhì)量濃度為0.5 g/L，并使牛磺酸與HSP的質(zhì)量濃度比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，以0.5 g/L HSP和0.5 g/L SPI溶液為對照組，在200 r/min下磁力攪拌20 min使樣品充分混合，最后在3000 r/min條件下均質(zhì)2 min。

1.3.3 TSPC、SPI體外抗氧化性的測定

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力的測定

參考蔡俊等[15]的方法并稍加修改，用無水乙醇配制質(zhì)量濃度為50 μg/mL的DPPH溶液，用移液槍吸取DPPH溶液1.5 mL、TSPC或SPI 25 μL置于96 孔平板，充分 振蕩混勻后于25 ℃恒溫暗箱中孵育30 min，以無水乙醇代替DPPH溶液作為對照，測定517 nm波長處的吸光度， 按公式（2）計算DPPH自由基清除率。

1.3.3.2 超氧陰離子自由基清除能力的測定

參考馬詩文等[16]的方法，取TSPC或SPI 200 μL與5.76 mL的Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L、pH 8.2）充分振蕩混勻，于25 ℃孵育10 min后加入40 μL鄰苯三酚（25 mmol/L），隨后每隔1 min測定320 nm波長處的吸光度，作吸光度隨時間變化的回歸方程，方程斜率即為自氧化速率（ΔA1），以蒸餾水為對空白對照（回歸方程斜率ΔA0），超氧陰離子自由基清除率按公式（3）計算。

1.3.3.3 抗脂質(zhì)過氧化能力的測定

參照吳瑕等[17]的方法并稍作修改。將1 mL TSPC或SPI、3 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液和17 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.5%三氯乙酸-鹽酸溶液充分混合并沸水浴30 min，冷卻至室溫后取樣并與20 mL氯仿混合，3000 r/min離心15 min后取上清液，測定其在532 nm波長處的吸光度（A532nm），以每升脂質(zhì)氧化樣品溶液中丙二醛的質(zhì)量表示硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive species，TBARS）值，具體按式（4）計算。

式中：V為樣品溶液的體積（1 mL）。

1.3.4 TSPC抗疲勞實驗

1.3.4.1 運動性疲勞大鼠模型的建立

參考陳艷華等[18]的方法，選取健康雄性SD種大鼠50 只并隨機分為5 組，設(shè)立對照組以及疲勞模型組，再根據(jù)TSPC體外抗氧化活性的差異設(shè)立牛磺酸高（A組，1∶10）、中（B組，1∶20）、低（C組，1∶30）劑量組。除正常對照組外，其余大鼠進(jìn)行持續(xù)20 min的跑臺適應(yīng)性訓(xùn)練5 d，跑臺速率由12 m/min逐漸提升至24 m/min。從第6天起，跑臺速率控制在24 m/min持續(xù)40 min，運動負(fù)荷強度相當(dāng)于60%～70%的最大攝氧量，每6 d休息1 d，7 d為一個周期，約21 d后大鼠出現(xiàn)行典型運動性疲勞行為學(xué)異常狀況，如動作遲緩、鼠毛稀疏、食欲減退等，視為造模成功，采取灌胃法給予大鼠TSPC溶液，正常組及模型組給予生理鹽水，每次灌胃3 mL/只，持續(xù)訓(xùn)練15 d直至實驗結(jié)束。

1.3.4.2 跑臺耐力實驗

跑臺耐力實驗實施胃飼的最后一天，跑臺速率控制在32 m/min，使其運動負(fù)荷強度高于90%的最大攝氧量。在大鼠跑步過程中采用電刺激以保持其持續(xù)的運動強度，當(dāng)大鼠不能維持跑步狀態(tài)時，允許其休息2 min，控制累計 休息時間10 min，在累計休息時間超過10 min后，連續(xù)刺激仍無法保持強度的狀態(tài)記為力竭，并記錄總運動時間。

1.3.4.3 生化指標(biāo)檢測方法

最后一組跑臺耐力實驗結(jié)束后立即處死大鼠，眼球取血并將采集到的新鮮血液于4 ℃靜置1 h后，在3000 r/min 條件下分離15 min取上層血清，乳酸（lactic acid，LA）濃度、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）濃度、SOD活力、GSH-Px活力、過氧化氫酶（catalase，CAT）活力和丙二醛（malondialdehyde，MDA）濃度嚴(yán)格按照試劑盒操作說明測定，剩余血清保存于-70 ℃超低溫冰箱中備用。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，多樣本平均值間比較采用單因素方差分析檢驗，各組間多重比較采用最小顯著性差異（least significant difference，LSD）法，水迷宮數(shù)據(jù)采用重復(fù)設(shè)計性方差分析，P＜0.05為差異有顯著性。采用Origin 2017軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同配比對TSPC體外抗氧化活性的影響

本實驗通過DPPH自由基清除能力、超氧自由基清除能力以及抗脂質(zhì)過氧化能力對TSPC進(jìn)行綜合評判。根據(jù)TCA法測定HSP水解度為（35.32±1.23）%，并可以發(fā)現(xiàn)HSP的體外抗氧化指標(biāo)均高于未處理的SPI。

圖 1 TSPC對DPPH自由基清除作用Fig. 1 Scavenging effect of TSPC on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical

DPPH自由基清除能力是一種被用于評判物質(zhì)是抗氧化活性的指標(biāo)，DPPH的乙醇溶液呈藍(lán)紫色，在517 nm波長處具有最大吸收峰，具有自由基清除能力的物質(zhì)所提供的電子會與DPPH結(jié)合從而使其褪色。如圖1所示，5 種配比的TSPC均具有DPPH自由基清除能力，并與?；撬嵩谌芤褐兴嫉谋壤收嚓P(guān)，SPI的DPPH自由基清除能力相對較低。當(dāng)?；撬崤cHSP質(zhì)量濃度比為1∶10時，復(fù)合體系對DPPH自由基的清除能力最大（75.8%）。

超氧陰離子自由基具有極強的生物毒性，清除超氧陰離子自由基的能力可用來判斷被測物的抗氧化能力，在本實驗中鄰苯三酚自氧化形成的超氧陰離子自由基 有色產(chǎn)物的濃度與320 nm波長處的吸光度呈線性關(guān)系。如圖2所示，當(dāng)?；撬崤cHSP質(zhì)量濃度比低于1∶20時，超氧陰離子自由基清除率隨HSP比例增加呈上升趨勢；當(dāng)質(zhì)量濃度比超過1∶20后呈平穩(wěn)趨勢，質(zhì)量濃度比達(dá)到1∶20時超氧陰離子自由基清除率最大，達(dá)到71.4%。

圖 2 TSPC對超氧陰離子自由基清除作用Fig. 2 Scavenging effect of TSPC on superoxide anion radical

圖 3 TSPC抗脂質(zhì)過氧化能力Fig. 3 Anti-lipid peroxidation capacity of TSPC

抗脂質(zhì)過氧化能力可以通過TBARS法測定，其原理是脂質(zhì)氧化的重要終產(chǎn)物MDA可與硫代巴比妥酸發(fā)生顏色反應(yīng)，并在532 nm波長處具有最大吸收，吸光度越低說明抗脂質(zhì)過氧化能力越強。如圖3所示，SPI與水解SPI的抗脂質(zhì)過氧化能力相對較弱，隨著?；撬崤cHSP質(zhì)量濃度比增加，TBARS值逐漸降低，質(zhì)量濃度比低于1∶30時TBARS值與對照HSP組無顯著差異（P＞0.05），當(dāng)質(zhì)量濃度比超過1∶30后TBARS值顯著降低（P＜0.05），質(zhì)量濃度比達(dá)到1∶10時抗脂質(zhì)過氧化能力最強。

根據(jù)上述體外抗氧化指標(biāo)的綜合分析，最終選取1∶10（A組）、1∶20（B組）、1∶30（C組）3 種質(zhì)量濃度比對TSPC進(jìn)行動物實驗，從耐力跑臺以及體內(nèi)生化指標(biāo)共同探究TSPC抗氧化活性與抗疲勞功能的關(guān)系。

2.2 TSPC抗疲勞實驗結(jié)果

2.2.1 大鼠力竭跑臺運動時間

運動耐力的時間能客觀機體的疲勞程度，是評判實驗樣本抗疲勞功效最直觀的指標(biāo)。實驗結(jié)果見表1，與對照組相比，模型組的運動時間顯著縮短（P＜0.05），說明模型組出現(xiàn)了疲勞癥狀，經(jīng)過15 d胃飼后，A、B、C組的運動時間與模型組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異 （P＜0.05），分別提升了61.2%、55.8%、37.4%，A組運動時間最長，C組運動時間最短，但A、B兩組間無顯著性差異（P＞0.05）。

表 1 TSPC對大鼠運動時間及血清LA、BUN濃度的影響Table 1 Effect of TSPC on exercise endurance time and serum LA and BUN concentrations in rats

2.2.2 大鼠血清LA、BUN濃度

通過對血清中LA和BUN濃度可判斷大鼠在運動后的疲勞程度及恢復(fù)狀況，實驗結(jié)果見表1。經(jīng)各劑量組飼喂后，與模型組相比，C、B、A組使大鼠體內(nèi)LA濃度分別降低了4.07%、7.94%、15.39%，C組與模型組相比不能使LA濃度顯著降低，A、B組能夠顯著降低LA濃度 （P＜0.05），且A組降低LA濃度的能力最佳，但仍與對照組具有差異。模型組的BUN濃度與對照組相比具有顯著差異（P＜0.05），與模型組相比劑量組均能顯著降低BUN濃度（P＜0.05），A組效果最佳，降低了20.79%，

綜上，表明TSPC能夠一定程度上通過減少LA積累、降低BUN濃度，達(dá)到相應(yīng)的緩解疲勞作用。

2.2.3 大鼠體內(nèi)抗氧化活性

?；撬岷虷SP都能參與機體的抗氧化生物進(jìn)程，一般可通過增強SOD、GSH-Px和CAT活性，減少因機體由自由基的過量堆積和清除過緩而誘發(fā)的加速衰老、癌癥等一系列疾病的可能，由于測定血液和組織中自由基水平比較困難，而檢測血液和組織中抗氧化酶則比較容易，可由此來間接反映機體內(nèi)自由基累積水平[19-23]。

表 2 TSPC對大鼠血清SOD、GSH-Px、CAT活力和MDA濃度的影響Table 2 Effect of TSPC on serum SOD, GSH-Px and CAT activity and MDA concentration in rats

SOD廣泛存在于機體細(xì)胞中，是超氧陰離子自由基的唯一底酶，主要通過催化超氧陰離子自由基產(chǎn)生歧化反應(yīng)，從而清除體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基并保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能的完整性[24]。由表2可知，模型組中SOD的活力顯著低于對照組（P＜0.05），C組未能對SOD的活力產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05），A、B組的SOD活力與模型組相比差異顯著（P＜0.05），分別提高了30.23%、22.76%。

由表2可知，模型組中GSH-Px的活力顯著低于對照組（P＜0.05），與模型組相比，3 組TSPC均能夠顯著提高GSH-Px活力（P＜0.05），B、C兩組間GSH-Px活力無顯著性差異（P＞0.05），A、B兩組與對照組相比GSH-Px活力無顯著差異（P＞0.05），說明A、B兩組均能使大鼠機體內(nèi)GSH-Px活力達(dá)到正常水平，與模型組相比，A組的提高效果最為明顯，約提高了17.97%。由表2可知，CAT活力在運動性疲勞造模后顯著降低（P＜0.05）， C組的TSPC可使CAT活力恢復(fù)至對照組水平，且A、B組能將CAT活力顯著高于對照組（P＜0.05）。

當(dāng)體內(nèi)MDA濃度超過機體代謝能力時，自由基便會誘導(dǎo)不飽和脂肪酸形成脂質(zhì)過氧化物，并導(dǎo)致細(xì)胞與組織的氧化損傷，因此MDA濃度也是一種用以評估由自由基導(dǎo)致體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度的有效指標(biāo)[25]。由表2可知，模型組大鼠血清中MDA濃度顯著高于對照組 （P＜0.05），在飼喂TSPC后，A、B、C組均能夠使大鼠血清中MDA的濃度顯著低于模型組（P＜0.05）。

2.3 TSPC抗氧化活性與抗疲勞能力的相關(guān)性

圖 4 大鼠TSPC抗氧化活性與抗疲勞能力的相關(guān)性Fig. 4 Correlation between antioxidant activity and anti-fatigue capacity of TSPC in rats

為確立TSPC抗氧化活性與抗疲勞能力間的聯(lián)系，分別以對照組、模型組、A組、B組、C組的SOD活力為縱坐標(biāo)，耐力運動時間為橫坐標(biāo)繪制散點圖。如圖4所示，通過線性回歸方程擬合計算，體內(nèi)抗氧化活性與抗疲勞能力決定系數(shù)R2為0.8205，顯著水平經(jīng)F檢驗為0.01，證明在該運動模型下大鼠的抗氧化活性與抗疲勞能力呈正相關(guān)。

3 討 論

疲勞是機體的一種自我保護(hù)反應(yīng)，它被描述為“機體在生理過程中不能持續(xù)維持其在特定水平上運動強度的生理現(xiàn)象”[26]，“自由基理論”是對其產(chǎn)生的較為統(tǒng)一學(xué)說，其原理是機體高強度運動會導(dǎo)致體內(nèi)活性氧自由基的生成和清除速率失衡，致使活性氧積累機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，當(dāng)體內(nèi)自由基濃度升高，體內(nèi)消除自由基抗氧化酶活性提高，但所積累的自由基一旦超出酶的清除能力范圍，就會對生物膜系統(tǒng)造成氧化損傷，引發(fā)副反應(yīng)并最終導(dǎo)致運動性疲勞的產(chǎn)生、機體工作能力下降[27]。

在體外抗氧化活性研究中所篩選3 個TSPC劑量組，其體內(nèi)抗氧化活性與體外抗氧化活性強弱的趨勢基本保持一致，抗氧化物酶的活性增加以及MDA含量降低直接證明了TSPC能夠通過清除自由基緩解運動性疲勞所導(dǎo)致的氧化損傷。

在本實驗的力竭跑臺實驗中，大鼠在劇烈的運動過程中，為了滿足機體能量代謝的需求，體內(nèi)無氧環(huán)境下通過糖酵解途徑供給能量并產(chǎn)生代謝產(chǎn)物L(fēng)A[28]，與此同時肝臟也會消耗部分氨基酸與蛋白質(zhì)參與能量的供給并產(chǎn)生代謝產(chǎn)物BUN[29]，它們二者均會通過血液進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)中，因而通過對二者濃度進(jìn)行分析以及力竭運動時長的比對，能有效評判大鼠的疲勞程度以及TSPC的抗疲勞效果。結(jié)果顯示在運動性疲勞模型下，TSPC中?；撬嵴急仍礁?，LA、BUN濃度越低、耐力運動時長越長，表明TSPC具有良好的抗疲勞效果，且與?；撬岢蕜┝?效應(yīng)關(guān)系。

最后本實驗根據(jù)SOD活力與運動時長的相關(guān)系數(shù)證實，TSPC的抗氧化活性與抗疲勞能力呈正相關(guān)，陳園園等[30]在對大豆低聚肽的研究中與得到本實驗一致的結(jié)論。因此，可以根據(jù)體外抗氧化實驗對多種原料復(fù)配的抗疲勞效果進(jìn)行初篩。

4 結(jié) 論

本實驗采用了體外抗氧化實驗對?；撬崤cHSP的質(zhì)量濃度比進(jìn)行了篩選，根據(jù)實驗結(jié)果最終選取了1∶10、1∶20、1∶303 種比例進(jìn)行動物實驗，通過運動性疲勞大鼠實驗?zāi)Ｐ桶l(fā)現(xiàn)各組均表現(xiàn)出一定的體內(nèi)抗氧化活性，可提高SOD、GSH-Px、CAT活力，降低MDA濃度，從而減輕過氧化損傷程度，并通過LA、BUN濃度降低以及運動時間延長的結(jié)果驗證了TSPC具有一定的抗疲勞能力，其中質(zhì)量濃度比為1∶10時效果最佳。最后通過計算體內(nèi)抗氧化活性與抗疲勞能力相關(guān)性，確立了TSPC體內(nèi)抗氧化活性在本實驗中運動性疲勞模型下與抗疲勞能力正相關(guān)，表明可以根據(jù)體外抗氧化實驗對抗疲勞產(chǎn)品的配比進(jìn)行初篩，從而為進(jìn)一步開發(fā)以水解蛋白和?；撬釣榛A(chǔ)原料的復(fù)合功能抗疲勞產(chǎn)品提供了理論依據(jù)。