果蔬酶促褐變機(jī)理的研究進(jìn)展

李彩云，李 潔,2,3,*，嚴(yán)守雷,2,3，王清章,2,3

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070；3.湖北省水生蔬菜保鮮加工工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430070）

水果和蔬菜在貯運(yùn)、包裝或加工過(guò)程中受損后極易發(fā)生變色，這種現(xiàn)象被稱為酶促褐變[1]，一般發(fā)生在新鮮的活組織中，或者至少發(fā)生在含有活性酶的組織中。機(jī)械損傷后的褐變反應(yīng)通常發(fā)生迅速且劇烈。酶促褐變極大地影響了果蔬外觀和風(fēng)味，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)損失，降低了消費(fèi)者的接受度，對(duì)食品生產(chǎn)商和食品加工業(yè)都產(chǎn)生重大的經(jīng)濟(jì)影響。據(jù)估計(jì)，熱帶和亞熱帶水果和蔬菜的損失超過(guò)50%是由酶促褐變?cè)斐傻腫2]。酶促褐變反應(yīng)的 基本步驟是酚類化合物在酚酶催化下氧化成鄰醌類化合物，隨后醌類物質(zhì)經(jīng)過(guò)一系列氧化縮合聚合形成褐色產(chǎn)物，從而導(dǎo)致褐變發(fā)生。發(fā)生酶促褐變的3 個(gè)必要因素分別為酚類底物、氧氣、酶[3]。國(guó)內(nèi)外對(duì)食品褐變研究較多，但對(duì)于酶促褐變機(jī)理的研究比較零散，且不夠深入。本文整理歸納了國(guó)內(nèi)外圍繞褐變機(jī)理進(jìn)行的多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和酚類底物的相關(guān)研究和報(bào)道，為酶促褐變機(jī)理的系統(tǒng)深入研究提供借鑒與參考。

1 PPO相關(guān)研究進(jìn)展

1.1 PPO分類

PPO是酶促褐變反應(yīng)的重要影響因素和必備條件，PPO是含有Cu2+的酶。國(guó)際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合命名委員會(huì)提出，PPO包括3 種類型[4]：第一種是單酚單氧化酶，亦稱酪氨酸酶、單酚氧化酶、甲酚酶，這種酶能催化單羥基酚羥基化為鄰二羥基酚；第二種是雙酚氧化酶，亦稱兒茶酚氧化酶、o-雙酚酶，這種PPO能催化氧化鄰位酚，但不能氧化間位酚和對(duì)位酚；第三種是漆酶，該酶能氧化鄰位酚和對(duì)位酚，不能氧化一元酚和間位酚?，F(xiàn)在所說(shuō)的PPO一般是雙酚氧化酶和漆酶的統(tǒng)稱[5]。

1.2 PPO催化位點(diǎn)

研究PPO的活性中心發(fā)現(xiàn)，銅離子存在于酶的活性中心，大多數(shù)PPO活性中心具有兩個(gè)富含組氨酸（His）殘基的Cu結(jié)合區(qū)域[6]。通過(guò)核磁共振等方法得到的數(shù)據(jù)顯示PPO活性中心每個(gè)銅離子與3 個(gè)His殘基中的N原子形成配位鍵，形成了具有特定三維結(jié)構(gòu)的活性部位，配位鍵中兩個(gè)為赤道面配位鍵，一個(gè)為較弱的軸向配位鍵。這兩個(gè)銅離子以赤道面與不同數(shù)目的氧原子產(chǎn)生配位結(jié)合而形成電子通路[7]。PPO因兩個(gè)銅離子結(jié)合氧原子數(shù)的不同，產(chǎn)生以下3 種型態(tài)：1）含兩個(gè)與一對(duì)外來(lái)氧原子連接的二價(jià)銅離子的氧化態(tài)酶；2）含兩個(gè)與一個(gè)外來(lái)氧原子連接的銅離子的還原態(tài)酶；3）含兩個(gè)沒(méi)與任何氧連接的相互分離的一價(jià)銅離子的脫氧態(tài)酶[8-9]。氧化態(tài)酶去氧生成還原態(tài)酶，還原態(tài)酶脫氧生成脫氧態(tài)酶，而氧化態(tài)酶和脫氧態(tài)酶通過(guò)釋放和結(jié)合氧氣又可相互可逆轉(zhuǎn)化。這3 種型態(tài)的存在和相互轉(zhuǎn)化是其發(fā)揮其單酚酶和多酚酶催化能力的關(guān)鍵[10]。圖1是酪氨酸酶通過(guò)3 種型態(tài)變化發(fā)揮雙重催化的一種得到廣泛認(rèn)可的反應(yīng)模型[11]。

圖 1 PPO催化單酚和雙酚底物氧化的循環(huán)圖[11]Fig. 1 Catalytic cycle for the oxidation of monophenol and diphenol substrates by PPO[11]

1.3 PPO提取、分離、純化、純度鑒定、活性測(cè)定的方法

PPO提取方法很多，通常根據(jù)PPO存在的植物種類來(lái)選擇分離提取方法。從果蔬組織中提取分離PPO面臨的一個(gè)主要問(wèn)題是酚類底物和酶同時(shí)存在。在活組織中，這兩種成分在細(xì)胞內(nèi)單獨(dú)分開存在，但在浸漬、提取和其他加工處理中，它們一旦由于組織細(xì)胞破損而接觸就會(huì)產(chǎn)生醌和其他縮合產(chǎn)物，在提取時(shí)要注意去除酚類底物。傳統(tǒng)的提取方法主要分為緩沖液提取法[12-14]和丙酮提 取法[15-16]，緩沖液提取法應(yīng)用較多；新型PPO提取方法有超聲波輔助提取法。

PPO粗提物大都含有許多雜質(zhì)，還需要對(duì)其進(jìn)行分離純化。鹽析和色譜層析法等是早期純化PPO所常使用的 方法。使用硫酸銨進(jìn)行分級(jí)沉淀后，通過(guò)透析去除無(wú)機(jī)雜質(zhì)，然后通過(guò)色譜法進(jìn)一步分離。色譜方法有凝膠色譜、吸附色譜、親和色譜、離子交換色譜[17-18]。在各種色譜方法中選擇適當(dāng)?shù)姆椒ㄈQ于酶的類型、雜質(zhì)、電荷、分子大小和提取物的純度。最近幾年溫度誘導(dǎo)相分離、雙水相萃取、三相分離技術(shù)等液-液萃取的技術(shù)也開始用于酶的分離純化中。

分離純化出的PPO一般要進(jìn)行純度鑒定，為確保純化完全，一般鑒定方法有層析法、電泳法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、質(zhì)譜法等。在整個(gè)分離純化過(guò)程中要實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PPO活性，測(cè)定PPO活性的方法主要有分光光度法和氧電極法。最近Pan Tingtiao等[19]發(fā)展了一種新的測(cè)定PPO的 方法——表面增強(qiáng)拉曼散射法，將該方法用于蘋果和馬鈴薯樣品中PPO活性的測(cè)定，并與比色法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)該方法可成功地用于食品樣品中PPO活力的測(cè)定。表1總結(jié)了PPO提取、分離、純化、純度鑒定、活性測(cè)定的方法及特點(diǎn)。

表 1 PPO提取、分離、純化、純度鑒定、活性測(cè)定的方法及特點(diǎn)Table 1 Methods for PPO extraction, separation and purification and determination of its purity and activity and their characteristics

續(xù)表1

2 酚類底物相關(guān)研究進(jìn)展

2.1 多酚種類

酚類化合物屬于植物次生代謝產(chǎn)物，以苯環(huán)為基本骨架，以苯環(huán)的多羥基取代為特征，具有一系列的結(jié)構(gòu)和功能。酚類化合物根據(jù)結(jié)構(gòu)分為酚酸類、黃酮類、 1,2-二苯乙烯和木質(zhì)素類[36]。根據(jù)其碳骨架的不同可進(jìn)一步細(xì)分（表2）。

表 2 根據(jù)碳骨架對(duì)植物組織酚類化合物的分類[37]Table 2 Classification of phenols compounds in plant tissues based on carbon skeleton[37]

2.2 影響植物組織多酚種類和含量變化的因素

不同品種的植物組織酚類化合物種類與含量差異較大。Khettal等[38]從產(chǎn)于阿爾及利亞的7 個(gè)不同品種柑橘葉片中提取多酚化合物，得到各品種水提物中總酚和總黃酮含量分別為68.23～125.28 mg/g和11.99～46.25 mg/g （以干質(zhì)量計(jì)，下同）。Tanri?ven等[39]測(cè)定了7 個(gè)不同品種梨汁中酚類物質(zhì)的含量，得到綠原酸質(zhì)量濃度為73.1～249 mg/L，表兒茶素質(zhì)量濃度為11.9～81.3 mg/L，咖啡酸質(zhì)量濃度為2.4～11.4 mg/L，對(duì)香豆酸質(zhì)量濃度為0.0～3.0 mg/L。Yi Yang等[40]對(duì)13 個(gè)品種蓮藕的酚類化合物的 含量、分布、組成進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)藕肉、藕皮和藕節(jié)中總酚的平均含量分別為1.81、4.30 mg/g和7.35 mg/g （以鮮質(zhì)量計(jì)），總黃酮的平均含量分別為3.35、7.69 mg/g和15.58 mg/g（以鮮質(zhì)量計(jì)）。酚類化合物種類在不同部位上有顯著差異，藕肉中酚類物質(zhì)主要由沒(méi)食子兒茶素和兒茶素組成；藕皮和藕節(jié)中酚類物質(zhì)主要由沒(méi)食子兒茶素、沒(méi)食子酸、兒茶素和表兒茶素組成。

種植方式會(huì)影響酚類種類及含量。Veberic等[41]采用HPLC法測(cè)定了奧地利和斯洛文尼亞11 個(gè)有機(jī)栽培蘋果品種和11 個(gè)綜合生產(chǎn)蘋果品種果皮和果肉中酚類化合物的含量，發(fā)現(xiàn)有機(jī)栽培蘋果品種與綜合生產(chǎn)蘋果品種的 果皮酚類物質(zhì)含量無(wú)顯著差異；然而，有機(jī)種植的蘋果果肉中酚類物質(zhì)的含量高于綜合生產(chǎn)的蘋果品種。

提取方式也會(huì)影響測(cè)出的酚類種類和含量。Delgado-Torre等[42]對(duì)18 個(gè)不同葡萄品種的水醇提物進(jìn)行了比較研究，分別采用過(guò)熱液體提取法、微波輔助提取法和超聲波輔助提取法進(jìn)行提取，與其他兩種方法相比，過(guò)熱液體提取法具有更高的提取效率。Mai 等[43]采用多層逆流色譜法和制備型HPLC從卷心萵苣中分離出了10 種酚類化合物（咖啡酸、綠原酸、菜豆酸、菊苣酸、異綠原酸、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸、槲皮素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-葡糖苷和槲皮素-3-O-(6-丙二?；?-葡糖苷）。紫丁香苷首次在萵苣中被鑒定，這種多酚類物質(zhì)以前在菊科中沒(méi)有提到過(guò)。

不同成熟期也會(huì)影響酚類含量。Lachowicz等[44]在大蒜的葉、根、莖和蒜根提取物中鑒定出了32 種山柰酚衍生物和4 種咖啡酸衍生物。3月份大蒜總酚含量為10.9～1477 mg/100 g，6月份大蒜總酚含量為6.5～1195 mg/100 g。甜菜葉在不同的成熟期褐變程度也不相同，甜菜葉從成熟3 個(gè)月到成熟8 個(gè)月，總酚含量從4.6 mg/g（以鮮質(zhì)量計(jì)）增加到9.4 mg/g（以鮮質(zhì)量計(jì)）。成熟8 個(gè)月的甜菜葉提取物的PPO活力是成熟3 個(gè)月葉提取物的6.7 倍[45]。Mahayothee等[46]研究了泰國(guó)兩個(gè)種植區(qū)授粉后180、190 d和225 d椰子水和椰肉中的酚類物質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)總酚含量在授粉后180～190 d隨椰子成熟而增加，在授粉后225 d下降或保持不變。兒茶酚和水楊酸是椰子水中的主要酚類化合物，而沒(méi)食子酸、咖啡酸、水楊酸和對(duì)香豆酸則存在于椰肉類中。

果蔬的酚類化合物含量由眾多因素決定，如品種、成熟期和環(huán)境因素。而且酚類化合物在植物中的分布也有不同，這是由遺傳和外界因素引起的[41]。HPLC法以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用在果蔬中酚類物質(zhì)的分離、定量和鑒定方面取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展[47]。

3 酚類化合物的酶促氧化

酶促褐變發(fā)生的確切途徑一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為涉及兩個(gè)反應(yīng)步驟[48]。第一個(gè)反應(yīng)是單酚羥基化為二酚，鄰二酚羥基化為醌。酶促氧化的主要產(chǎn)物醌具有不同的光譜特性，其顏色取決于酚的來(lái)源和pH值。例如，酶促氧化后，綠原酸經(jīng)氧化后呈暗橙色，最大吸收波長(zhǎng)為420 nm；兒茶素經(jīng)氧化后呈亮黃色，最大吸收波長(zhǎng)為380 nm；L-多巴經(jīng)氧化后呈粉紅色，最大吸收波長(zhǎng)為480 nm[49]。Rouet-Mayer等[50]研究了蘋果破碎組織中的酶促褐變以及在(+)-兒茶素和綠原酸的純?nèi)芤褐忻复俸肿?，由二次反?yīng)形成的化合物可知，(+)-兒茶素形成的鄰醌顏色更深，在綠原酸溶液和破碎的蘋果中顏色則更淺。兒茶素的鄰醌和綠原酸的鄰醌都不穩(wěn)定，較高pH值時(shí)，不穩(wěn)定性增加。在pH值為4的條件下，綠原酸的鄰醌比兒茶素的鄰醌顯色更強(qiáng)烈。

酚類化合物在發(fā)生氧化的同時(shí)還會(huì)發(fā)生自身聚合。酚類物質(zhì)的氧化聚合對(duì)果酒（白葡萄酒、蘋果酒等）的口感和穩(wěn)定性均有影響。張影陸等[51]以黃酮類物質(zhì)的典型代表兒茶素和酚酸類物質(zhì)的典型代表綠原酸為研究對(duì)象，在模擬體系中通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜對(duì)其酶促氧化聚合進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)單酚在酶促反應(yīng)過(guò)程中確實(shí)會(huì)發(fā)生聚合，且不同的單酚表現(xiàn)出不同的聚合過(guò)程及不同的聚合速度。Bernillon等[52]研究了模型溶液的氧化產(chǎn)物與氧化蘋果汁的氧化產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)了咖啡酰奎寧酸（caffeoylquinic acid，CQA）二聚體、CQA和兒茶素的二聚體以及CQA和二聚黃烷-3-醇的二聚體，未檢測(cè)到CQA和二氫查耳酮的二聚體。

酚類化合物可以通過(guò)不同途徑氧化，氧化產(chǎn)物相似。Makris等[53]研究了蘑菇PPO、辣根過(guò)氧化物酶和鐵氰化鉀3 種處理對(duì)槲皮素的氧化作用，發(fā)現(xiàn)槲皮素溶液經(jīng)PPO、辣根過(guò)氧化物酶、鐵氰化鉀處理后得到的色譜圖非常相似，得到的產(chǎn)物相同。

3.1 醌的生成途徑及其次級(jí)代謝

3.1.1 醌的不同生成途徑

結(jié)合不同的分析方法對(duì)確定含有一種或兩種酚類的模型體系的氧化產(chǎn)物時(shí)特別有用。研究者將化學(xué)氧化和酶催化氧化均用于這些體系中試圖闡明氧化機(jī)理[54]。不管醌是通過(guò)酶促氧化還是非酶促氧化形成的，這些可能導(dǎo)致形成色素的反應(yīng)都是相似的[55]。這兩個(gè)反應(yīng)途徑中唯一區(qū)別是褐變的發(fā)生速率，酶促褐變通常更快。Munoz-Munoz等[56]通過(guò)動(dòng)態(tài)研究PPO、過(guò)氧化物酶以及化學(xué)氧化對(duì)綠茶兒茶素的作用，并且研究了這些化合物在自氧化過(guò)程中以及其鄰醌生成過(guò)程中過(guò)氧化氫的形成。PPO/O2和過(guò)氧化物酶/過(guò)氧化氫氧化綠茶兒茶素分別產(chǎn)生了鄰醌和半醌，(－)-表兒茶素和(+)-兒茶素在有O2參與的自氧化過(guò)程中過(guò)氧化氫生成量很低，而高碘酸鹽氧化產(chǎn)生的鄰醌的量很大，這突出了鄰醌在反應(yīng)過(guò)程中的重要性。

3.1.2 醌的耦合氧化反應(yīng)

酚類化合物氧化形成不穩(wěn)定的產(chǎn)物醌后，這些醌會(huì)與其他化合物反應(yīng)，導(dǎo)致醌的穩(wěn)定性以及由此產(chǎn)生的任何顏色的色調(diào)和強(qiáng)度都變化很大，這取決于酚類前體和化學(xué)環(huán)境。醌的反應(yīng)分為與酚類化合物反應(yīng)（圖2）和與非酚類化合物反應(yīng)（圖3）兩種。

圖 2 鄰醌與酚類化合物的反應(yīng)[37]Fig. 2 Reactions of o-quinones with phenolic species[37]

圖 3 鄰醌與非酚類化合物的反應(yīng)[37]Fig. 3 Reactions of o-quinones with nonphenolic species[37]

3.1.2.1 醌與酚類化合物的耦合氧化

醌與酚類化合物的耦合氧化可以非常迅速，并且取決于存在的不同醌/酚對(duì)應(yīng)的各自氧化還原電位[37]。這些反應(yīng)導(dǎo)致原始苯酚的二聚體形成或苯酚的再生（圖2）。產(chǎn)物本身經(jīng)受酶或其他酚類化合物的進(jìn)一步氧化，導(dǎo)致形成分子質(zhì)量較大的低聚物。Cheynier等[57]研究了葡萄汁中酚類氧化和褐變的機(jī)理，具體為：咖啡酰酒石酸酶促氧化為 相應(yīng)的咖啡酰酒石醌，然后用谷胱甘肽捕獲后者；過(guò)量的 咖啡酰酒石醌可能會(huì)與黃烷醇和花青素一起進(jìn)入氧化反應(yīng)。Poupard等[58]在蘋果汁模型溶液中研究了(-)-表兒茶素結(jié)構(gòu)對(duì)綠原酸鄰醌的反應(yīng)性（即鄰醌是否能夠與多酚反應(yīng)形成復(fù)合物）?？紤](-)-表兒茶素分子的兩個(gè)酚部分的反應(yīng)性，選擇間苯三酚和4-甲基鄰苯二酚分別代表A-環(huán)和B-環(huán)。從形成的氧化產(chǎn)物可以看出，A環(huán)和B環(huán)的反應(yīng)性明顯不同。A環(huán)和B環(huán)都可能參與共價(jià)鍵的形成，但是電子轉(zhuǎn)移只發(fā)生在B環(huán)上。大多數(shù)(-)-表兒茶素氧化產(chǎn)物通過(guò)A/B環(huán)鍵（“頭對(duì)尾”分子間偶聯(lián)）連接。

在PPO、酚類底物和花青素存在的情況下，酶和底物反應(yīng)產(chǎn)生的中間產(chǎn)物鄰醌能通過(guò)氧化還原作用將花色苷轉(zhuǎn)化為氧化的花色苷及降解產(chǎn)物。Ruenroengklin等[59]證明了荔枝PPO不能直接氧化荔枝花色苷，而是直接氧化(-)-表兒茶素（荔枝內(nèi)源性底物），(-)-表兒茶素的氧化產(chǎn)物再催化荔枝花色苷降解，最終導(dǎo)致褐變反應(yīng)，這可能是荔枝果實(shí)采后果皮褐變的原因。Sarni等[60]在模型溶液中研究了咖啡酰酒石酸和葡萄PPO對(duì)鄰二酚（如花青素-3-葡萄糖苷）和非鄰二酚（如錦葵花素-3-葡萄糖苷）花青素的氧化降解作用機(jī)理，具體為：咖啡酰酒石酸先經(jīng)過(guò)葡萄PPO酶促反應(yīng)形成咖啡酰酒石酸鄰醌，咖啡酰酒石酸鄰醌再與兩種花色苷進(jìn)行反應(yīng)，花青素-3-葡萄糖苷的降解主要是通過(guò)與咖啡酰酒石酸鄰醌耦合氧化，而錦葵花素-3-葡萄糖苷與咖啡酰酒石酸醌形成加合物。

3.1.2.2 醌與非酚類化合物的耦合氧化

第二種反應(yīng)（圖3）包括鄰醌與非酚類化合物反應(yīng)，即抗壞血酸、亞硫酸鹽、硫醇、伯胺、仲胺（游離或存在于蛋白質(zhì)中）和水[61]?？箟难崾浅Ｒ姷目购肿儎梢酝ㄟ^(guò)兩種不同的機(jī)制防止褐變[62]：在沒(méi)有PPO底物的情況下，它使PPO不可逆地失活，可能是通過(guò)與其活性位點(diǎn)的結(jié)合；在存在PPO底物的情況下，抗壞血酸會(huì)還原PPO氧化的反應(yīng)產(chǎn)物，即與氧化形成的醌發(fā)生耦合氧化，使醌被還原，從而導(dǎo)致苯酚的再生，從而抑制褐變[61]，直到抗壞血酸被耗盡為止，隨后會(huì)形成棕色。Narváez-Cuenca等[63]研究了亞硫酸氫鈉對(duì)馬鈴薯提取物酚類化合物的影響，發(fā)現(xiàn)用亞硫酸氫鈉處理馬鈴薯提取物后，酚類化合物與其反應(yīng)形成了20 種硫代加合物，其結(jié)構(gòu)已通過(guò)核磁共振波譜法和質(zhì)譜法證實(shí)。該研究認(rèn)為當(dāng)亞硫酸氫鈉用作抗褐變劑時(shí)，綠原酸被PPO氧化為o-鄰醌，然后o-鄰醌與亞硫酸氫鈉反應(yīng)生成磺基-o-二酚，而后者不參與褐變反應(yīng)。Kuijpers等[64]以蘑菇酪氨酸酶和綠原酸組成的褐變模型為基礎(chǔ)對(duì)NaHSO3和其他含硫化合物（半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫蘇糖醇）的抗褐變活性進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)半胱氨酸和谷胱甘肽通過(guò)與綠原酸的鄰醌形成無(wú)色加成產(chǎn)物來(lái)防止褐變，二硫蘇糖醇通過(guò)抑制酪氨酸酶活性抑制褐變，而NaHSO3兩種途徑都有參與，其對(duì)褐變具有雙重抑制作用。

3.1.2.3 醌與蛋白質(zhì)的相互作用

醌還可以與蛋白質(zhì)發(fā)生共價(jià)相互作用而改變蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和消化率。Prigent等[65]研究了綠原酸氧化產(chǎn)物與氨基酸側(cè)鏈之間的共價(jià)相互作用，發(fā)現(xiàn)CQA氧化后先形成二聚體形式，二聚體再和賴氨酸、酪氨酸、組氨酸和色氨酸發(fā)生相互作用。CQA單體似乎能夠與組氨酸和色氨酸反應(yīng)，而未觀察到賴氨酸、酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸與CQA單體的相互作用。Schilling等[66]研究了綠原酸醌與兩種氨基酸衍生物叔丁氧羰基-L-賴氨酸和N-乙酰-L-半胱氨酸之間的共價(jià)相互作用，在pH 7.0的模型系統(tǒng)中，證明了兩種衍生物的共價(jià)加成產(chǎn)物的形成。氨基側(cè)鏈與醌類物質(zhì)的共價(jià)相互作用可能有助于降低某些食品蛋白的致敏潛力。

3.2 氧化終產(chǎn)物特性

酶促褐變反應(yīng)產(chǎn)物具有抗氧化性。許多研究主要涉及天然酚類的抗氧化活性，酶促氧化產(chǎn)物也有抗氧化活性，因?yàn)樗鼈內(nèi)匀痪哂胁糠址宇惢瘜W(xué)結(jié)構(gòu)。Cheigh等[67]研究了兒茶素模型系統(tǒng)中PPO氧化得到的黑色素相關(guān)產(chǎn)物的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)兒茶素-酶反應(yīng)產(chǎn)物（catechinenzyme reaction products，CERP）呈不同強(qiáng)度的棕色，在反應(yīng)的早期獲得的CERP顯示出比在后期更高的抗氧化活性。CERP的抗氧化活性可以通過(guò)其給出氫原子、清除自由基和抑制脂氧合酶的能力來(lái)解釋。Wong-Paz等[68]用蘋果中的PPO提取物氧化蘋果中常見的綠原酸和(α)-表兒茶素，以產(chǎn)生蘋果汁加工過(guò)程中形成的氧化產(chǎn)物，比較其與天然(-)-表兒茶素、咖啡?？崴崮阁w分子、水溶性VE的體外1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除活性，發(fā)現(xiàn)氧化產(chǎn)物顯示出比母體分子等物質(zhì)的量混合物更低的抗氧化活性，但異二聚體顯示出比同二聚體更高的抗氧化潛能。

酶促褐變反應(yīng)產(chǎn)物具有抗誘變性。Seung-Shi等[69]研究了馬鈴薯多酚類化合物的酶促褐變反應(yīng)產(chǎn)物（enzymatic browning reaction products，PEBRPs）對(duì)抗誘變特性的影響，發(fā)現(xiàn)100 mg/kg的PEBRPs未引起小鼠骨髓微核嗜多染紅細(xì)胞（micronucleated polychromatic erythrocytes，MNPCEs）數(shù)量的增加，而苯并[a]芘（B[a]P）處理顯著增加了MNPCEs的生成率，在小鼠暴露于100 mg/kgmbB[a]P前12 h給予PEBRPs后，MNPCEs生成率顯著降低，說(shuō)明馬鈴薯酶促褐變反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)B[a]P誘導(dǎo)的MNPCEs的生成有較強(qiáng)的抑制作用。

氧化產(chǎn)物還能抑制PPO活性。le Bourvellec等[70]從各個(gè)品種的蘋果酒中純化出聚合度分別為80、10.5和4的蘋果原花青素組分，原花青素、綠原酸、(-)-表兒茶素3 種單體以及綠原酸和(-)-表兒茶素的混合物分別與綠原酸的鄰醌反應(yīng)被氧化形成氧化產(chǎn)物，評(píng)價(jià)了各組分及其氧化產(chǎn)物對(duì)PPO活性的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)天然原花青素 能夠抑制PPO活性，抑制強(qiáng)度隨聚合度增加而增加；氧化原花青素的抑制作用為天然原花青素的兩倍，綠原酸和(-)-表兒茶素混合物的氧化產(chǎn)物也抑制了PPO活性。

4 褐變抑制劑控制酶促褐變的機(jī)理研究

為了抑制果蔬褐變和保持果蔬品質(zhì)，國(guó)內(nèi)外科研工作者進(jìn)行了大量廣泛而深入的研究。在傳統(tǒng)褐變化學(xué) 抑制劑中，亞硫酸鹽被廣泛用作褐變的抑制劑，但它會(huì)影響人體健康。因此，亞硫酸鹽的替代物如有機(jī)酸、巰基氨基酸、酚類物質(zhì)、天然產(chǎn)物等正在被作為可能的替代物而被深入研究。

許多有機(jī)酸是天然的褐變抑制劑，如檸檬酸、水楊酸、蘋果酸、曲酸、草酸[71-74]等。其抑制機(jī)理為：降低體系的pH值、絡(luò)合金屬離子、鈍化PPO活性?？箟难峒仁怯袡C(jī)酸，又是還原劑，其抑制褐變機(jī)理是將氧化的醌還原為酚類物質(zhì)，阻止醌類物質(zhì)進(jìn)一步自發(fā)聚合形成色素物質(zhì)，抑制PPO活性，降低氧氣含量[75-79]。

半胱氨酸、乙酰基半胱氨酸和還原型谷胱甘肽等巰基氨基酸有很強(qiáng)的抗褐變能力[80-83]。其抑制褐變的機(jī)制歸納起來(lái)為：一是醌類物質(zhì)能與巰基化合物形成無(wú)色的復(fù)合物，中斷了醌類物質(zhì)聚合形成色素物質(zhì)；二是巰基化合物可通過(guò)與PPO活性位點(diǎn)的銅離子不可逆結(jié)合而抑制酶活性，或者替代PPO活性位點(diǎn)的組氨酸殘基；三是巰基化合物并非阻止PPO氧化酚類，而是阻止酚類的聚合[84]。

絕大多數(shù)多酚類物質(zhì)本身能通過(guò)疏水鍵和多位點(diǎn)氫鍵與蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合，其多個(gè)鄰位羥基可以和金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，且酚羥基中的鄰位酚羥基極易被氧化，因此可以作為良好的抗氧化劑。越來(lái)越多植物組織中的多酚類提取物被證實(shí)對(duì)PPO活性具有抑制作用[85]。槲皮素、橙皮素、芹菜素、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷都對(duì)PPO活性有較好的抑制作用[86-87]。Si Yuexiu等[88]報(bào)道橙皮素作為PPO的一種競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑，能夠與PPO活性位點(diǎn)周邊的His61、His85、His259氨基酸殘基發(fā)生相互作用。熊志強(qiáng)[87]研究發(fā)現(xiàn)龍膽酸、芹菜素、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷3 種多酚類物質(zhì)與PPO通過(guò)非共價(jià)鍵和共價(jià)鍵的結(jié)合方式，阻斷了底物鄰苯二酚的進(jìn)入，從而抑制PPO的催化活性。

豌豆發(fā)酵液、大豆發(fā)酵液、洋蔥、蘿卜、甘草的提取物等天然產(chǎn)物都對(duì)褐變有很好的抑制效果[89-91]。發(fā)揮其抗褐變作用的是提取物中的抗氧化物成分，比如有機(jī)酸、多酚類、黃酮類物質(zhì)，其作用是保護(hù)酚類不被氧化，抑制PPO活性。周麗等[90]研究發(fā)現(xiàn)豌豆發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯PPO活性具有良好的抑制效果，發(fā)酵液的主要成分為氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖、有機(jī)酸、多酚類、黃酮類、皂苷等物質(zhì)，其中的抗褐變成分具有良好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，分子質(zhì)量小于1000 u，為極性較大的物質(zhì)。

5 結(jié) 語(yǔ)

酶促褐變機(jī)理研究對(duì)于控制新鮮果蔬的保鮮和加工品質(zhì)具有重大意義。根據(jù)褐變機(jī)理，可以從抑制PPO活性、改變酶環(huán)境方面入手，或者從阻斷酚類底物的聚合、抑制醌氧化、調(diào)節(jié)醌還原角度出發(fā)，減緩和抑制 褐變的發(fā)生。但是目前酶促褐變機(jī)理研究還存在一些瓶頸，首先，盡管已有大量研究表明PPO參與酶促褐變，但酶晶體的獲得還是較為困難，目前對(duì)PPO高級(jí)結(jié)構(gòu)的研究是以核酸序列、蛋白質(zhì)序列為基礎(chǔ)，利用計(jì)算機(jī)軟件來(lái)模擬PPO空間結(jié)構(gòu)、活性位點(diǎn)、底物結(jié)合區(qū)，其真實(shí)的高級(jí)結(jié)構(gòu)至今仍未探明。其次，對(duì)酚類化合物復(fù)雜的代謝過(guò)程分析仍有難度，酚類化合物的種類越多，反應(yīng)產(chǎn)物就會(huì)越復(fù)雜。再者，大多數(shù)研究通過(guò)模型體系來(lái)探討酶促褐變機(jī)理，在真實(shí)的食品體系中研究較少，數(shù)據(jù)的獲得和研究方法的可行性尚需進(jìn)一步探討。

隨著基因組學(xué)技術(shù)越來(lái)越成熟，可以從基因水平研究PPO，并通過(guò)基因編輯、基因敲除、基因沉默等手段對(duì)PPO進(jìn)行調(diào)控。隨著代謝組學(xué)技術(shù)的更新，對(duì)果蔬中各種類型的酚類化合物在酶促反應(yīng)中的代謝途徑、初級(jí)產(chǎn)物、次級(jí)產(chǎn)物、反應(yīng)類型等研究應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)，借助現(xiàn)代先進(jìn)分析儀器，以真實(shí)的食品體系為基礎(chǔ)研究酶促褐變中目標(biāo)成分的含量變化及代謝過(guò)程。以基因組學(xué)和代謝組學(xué)為兩大抓手開展PPO和酚類化合物的深入研究將有助于進(jìn)一步明晰酶促褐變機(jī)理。