IKCa1在圍著床期子宮內(nèi)膜的表達及其作用

陳洪燕，孫星宇，李亞玲，何金三，劉玲△

胚胎的成功著床取決于胚胎的侵入能力和子宮內(nèi)膜的容受性。胚胎植入時需要迅速重塑子宮內(nèi)膜上皮屏障和恢復其免疫功能，而子宮內(nèi)膜上皮細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）對子宮內(nèi)膜上皮細胞的容受性起著重要作用［1］。血管生成和血管重塑也為內(nèi)膜容受性的建立提供物質(zhì)基礎(chǔ)［2］。胚胎著床是一個母胎相互識別、相互融合的復雜過程。圍著床期母胎免疫調(diào)節(jié)的任一環(huán)節(jié)失常都可能導致著床失敗。中電導鈣激活性鉀離子通道（IKCa1）屬鈣激活鉀通道（KCa）蛋白家族成員，由IKCa1基因編碼。研究證實IKCa1在子宮內(nèi)膜上皮及其癌細胞株中表達，可促進EMT［3］，并促進細胞增殖、遷移和侵襲［4-6］；亦可調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞功能，參與血管生成［7-9］。由此推測IKCa1可能通過促進胚胎侵入，誘導子宮內(nèi)膜EMT和血管生成，加速子宮內(nèi)膜重塑和建立容受性，調(diào)節(jié)母胎免疫耐受等參與調(diào)節(jié)胚胎植入。為探究IKCa1在胚胎著床過程中的作用，本研究采用免疫組化技術(shù)檢測IKCa1和EMT標記蛋白在圍著床期子宮內(nèi)膜的表達，并利用IKCa1通道阻滯劑TRAM-34降低子宮內(nèi)膜細胞IKCa1表達及活性，探討IKCa1與內(nèi)膜容受性和胚胎植入的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本 收集2018年1月—12月在西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院生殖中心接受體外受精-胚胎移植（IVF-ET）助孕前1周期行子宮內(nèi)膜活檢的患者，分別取分泌和增生早、中、晚期子宮內(nèi)膜組織各5例。納入標準：年齡＜38歲，月經(jīng)周期規(guī)律且有排卵，基礎(chǔ)性激素水平正常，周期25~35 d，近3個月無激素類藥物使用史及宮腔操作史，宮腔形態(tài)正常。排除標準：有子宮黏膜下肌瘤、子宮畸形、內(nèi)膜息肉、宮腔粘連者，宮腔形態(tài)異常、染色體異常者，性傳播疾病者。所有標本一部分經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋后用于免疫組化染色，一部分凍存于液氨內(nèi)用于后續(xù)研究。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會討論通過，所有患者均簽署知情同意書。

1.1.2 細胞系 人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞株和人絨毛膜癌JAR細胞購自西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院醫(yī)學實驗中心，復蘇后單層培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑 SP-9000免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，DAB染色試劑盒、4%多聚甲醛溶液、兔抗E-cadherin多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，TRAM-34、DMSO購自美國Sigma公司，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液、Transwell小室購自美國Corning公司，結(jié)晶紫、SDS-PAGE凝膠試劑盒、PVDF膜、ECL發(fā)光液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，兔抗GAPDH多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，兔抗IKCa1、E盒結(jié)合蛋白1（Zeb1）多克隆抗體購自美國SAB公司，SYBR Green熒光定量PCR（qPCR）檢測試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司，辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔IgG二抗購自安徽合肥蘭杰柯科技有限公司，引物委托上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 qPCR檢測子宮內(nèi)膜組織和Ishikawa細胞IKCa1 mRNA表達 增生期和分泌期子宮內(nèi)膜組織以及Ishikawa細胞，按照TRIzol一步法提取總RNA，用Oligo（dT）18進行逆轉(zhuǎn)錄。IKCa1引物序列：上游5'-GTGCGTGCAGGATTTAGGG-3'，下游5'-TGCTAAGCAGCTCAGTCAGGG-3'；內(nèi)參照GAPDH引物序列：上游5'-ATGCTGGCGCTGAGTACGTC-3'，下游5'-GGTCATGAGTCCTTCCACGATA-3'。PCR總反應體系：cDNA 1μL，上、下游引物各1μL，2×Ultra SYBR Mix 10μL，ddH2O補充至20μL。PCR擴增反應條件：95℃預變性10 min；94℃變性10 s，65℃退火20 s，72℃延伸15 s，循環(huán)40次；72℃終末延伸10 min。以2-ΔCt方法分析IKCa1 mRNA的相對表達量。

1.2.2 免疫組化檢測子宮內(nèi)膜組織IKCa1蛋白表達 石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化后，置于檸檬酸鹽緩沖液中加熱至95~100℃12 min進行抗原修復。經(jīng)PBS清洗3 min×3次，3%過氧化氫孵育10 min，清洗，5%山羊血清封閉20 min。加入IKCa1一抗（1∶100）4℃孵育過夜，清洗，生物素結(jié)合山羊抗兔IgG聚合物室溫30 min，HRP標記的鏈霉親和素溶液室溫30 min。DAB顯色劑顯色1~2 min，自來水沖洗，蘇木素復染2 min，鹽酸乙醇分化2 s。經(jīng)脫水、透明、封片后，于顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照。染色強度分級：0分（無染色），1分（弱染色），2分（中度染色），3分（強烈染色）。陽性細胞百分率：0分（0~5%）、1分（6%~25%）、2分（26%~50%）和3分（51%~100%）。免疫組化評分即兩者乘積，總分≥3分為陽性，＜3分為陰性［10］。

1.2.3 細胞培養(yǎng)與分組 對數(shù)生長期Ishikawa細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。采用DMSO配制10 mmol/L TRAM-34儲備液，待細胞貼壁后，實驗組加入不同濃度TRAM-34，使其終濃度分別為0（僅加入等量DMSO）、10、20、30μmol/L，各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后分別收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.4 CCK-8法檢測子宮內(nèi)膜細胞增殖 取對數(shù)生長期Ishikawa細胞制備成細胞懸液，接種到96孔板中，每孔添加200μL細胞懸液，各組設3個重復樣本。37℃，5%CO2培養(yǎng)48 h后每孔加入10μL CCK-8試劑，用酶標儀檢測其在450 nm處的光密度（OD）值。

1.2.5 體外模擬胚胎植入實驗（Transwell法） 取對數(shù)生長期Ishikawa細胞用含10%胎牛血清的DMEM制成細胞懸液，每孔1×105個接種培養(yǎng)于24孔板，待細胞貼壁后加入不同濃度的TRAM-34。放置Transwell小室，JAR細胞接種前予無血清DMEM處理細胞24 h，每孔1×104個JAR細胞接種培養(yǎng)于小室上室，置CO2培養(yǎng)箱（5%CO2、37℃）中培養(yǎng)48 h。取出小室，將小室內(nèi)側(cè)面的細胞清除，保留外側(cè)面的細胞。4%多聚甲醛固定細胞30 min。甩干，結(jié)晶紫孵育30 min，自來水沖洗5 min，室溫下自然干燥。在倒置相差顯微鏡（OLYMPUS，日本）下觀察并拍照。隨機讀取5個視野并計數(shù)穿膜細胞數(shù)。

1.2.6 Western blot檢測子宮內(nèi)膜細胞EMT標記蛋白表達變化 Ishikawa細胞裂解后12 000×g離心15 min，收集上清，以BCA法測蛋白濃度。配制10%分離膠和5%濃縮膠，蛋白樣品煮沸10 min預變性，上樣，以濃縮膠80 V 40 min，分離膠120 V 70 min進行恒壓電泳，250 mA恒流轉(zhuǎn)膜，PVDF膜置于5%脫脂牛奶室溫2 h；TBST洗膜，一抗E-cadherin（1∶500）、Zeb1（1∶500）和GAPDH（1∶8 000）4℃過夜，二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h。洗膜后添加ECL發(fā)光液，置于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)顯影后分析目的蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0和Graphpad 6.0進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，2組均數(shù)間比較采用獨立樣本t檢驗，多組均數(shù)間比較用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 IKCa1在正常月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜的表達情況 qPCR結(jié)果顯示，IKCa1 mRNA在人子宮內(nèi)膜月經(jīng)周期各期均有表達，增生各期表達處于低水平，差異無統(tǒng)計學意義（F=0.563，P＞0.05）。IKCa1 mRNA在分泌期子宮內(nèi)膜的表達，以分泌中期（即圍著床期）最為顯著（F=27.750，P＜0.01），見圖1。免疫組化染色結(jié)果顯示，IKCa1在子宮內(nèi)膜增生各期呈低表達或不表達，在分泌期呈高表達，分泌中期表達最強，主要表達于腺上皮和腔上皮細胞胞漿，見圖2。

Fig.1 The expressions of IKCa1 mRNA in endometrium of normal menstrual cycle圖1 正常月經(jīng)各周期子宮內(nèi)膜IKCa1 mRNA表達水平

2.2 不同濃度TRAM-34對Ishikawa細胞增殖的影響 qPCR結(jié)果顯示，與0μmol/L組相比，10、20、30μmol/L TRAM-34處理組IKCa1 mRNA表達水平隨藥物濃度增加明顯下降（F=26.230，P＜0.01），見圖3。CCK-8結(jié)果顯示，隨TRAM-34濃度的增加，Ishikawa細胞增殖能力明顯下降（F=275.100，P＜0.01）；其中以30μmol/L組下降最為顯著，見圖4。

2.3 不同濃度TRAM-34對Ishikawa細胞體外胚胎植入能力的影響 Transwell結(jié)果顯示TRAM-34干預子宮內(nèi)膜Ishikawa細胞48 h，其對體外胚胎的黏附能力顯著下降，穿過小室基底膜的JAR細胞數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（F=40.520，P＜0.01），見圖5、6。

Fig.2 The IKCa1 expressions in endometrium of normal menstrual cycle（Immunohistochemical staining,×200）圖2 正常月經(jīng)各周期子宮內(nèi)膜IKCa1蛋白表達（免疫組化染色，×200）

Fig.3 Expressions of IKCa1 mRNA in endometrial carcinomaIshikawa cells treatment with TRAM-34圖3 不同濃度TRAM-34處理后IKCa1 mRNA在子宮內(nèi)膜細胞的表達

Fig.4 Changes of Ishikawa cell proliferation ability after treatment with different concentrations of TRAM-34圖4 不同濃度TRAM-34處理后Ishikawa細胞增殖能力變化

Fig.5 Changes of Ishikawa cell adhersion ability to embryos in vitro after treatment with different concentrations of TRAM-34(Transwell assay，×200)圖5 不同濃度TRAM-34處理后Ishikawa細胞對體外胚胎的黏附能力變化（Transwell實驗,×200）

Fig.6 Comparison of the number of Ishikawa cells invaded by differentconcentrations of TRAM-34圖6 不同濃度TRAM-34處理后Ishikawa細胞侵襲數(shù)量比較

2.4 不同濃度TRAM-34對子宮內(nèi)膜細胞EMT相關(guān)蛋白表達的影響 與0μmol/L組相比，30μmol/L組細胞E-cadherin蛋白表達明顯上調(diào)（t=29.275，P＜0.01），Zeb1蛋白表達明顯下調(diào)（t=15.487，P＜0.01），見圖7。

3 討論

胚胎著床是妊娠的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是具備著床能力的胚胎與子宮建立緊密聯(lián)系的過程［11］。圍著床期子宮內(nèi)膜處于容受狀態(tài)，允許胚胎黏附并侵入子宮內(nèi)膜，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞廣泛增殖和分化，發(fā)生蛻膜化形成初級蛻膜區(qū)，從而完成胚胎著床［12］。胚胎著床不僅需要發(fā)育成熟的囊胚，容受態(tài)的子宮內(nèi)膜也是必不可少的，只有子宮內(nèi)膜處于容受態(tài)時才會發(fā)生囊胚黏附［13］。在輔助生殖過程中胚胎移植成功率低的主要原因之一是胚胎移植時子宮內(nèi)膜處于非容受態(tài)［14］。胚胎的正常著床對于后續(xù)妊娠維持和分娩均起重要作用，異常的胚胎著床可致流產(chǎn)、早產(chǎn)等［15］。

Fig.7 Expression of EMT-related proteins in Ishikawa cells after treatment with TRAM-34圖7 TRAM-34處理后Ishikawa細胞EMT相關(guān)蛋白表達變化

KCa包括大電導KCa通道［BK（Ca）］、IKCa1和小電導KCa通道（SK3），均在子宮內(nèi)膜細胞中表達，BK（Ca）通過介導子宮內(nèi)膜感受性因子的表達來影響胚胎著床，SK3表達減少與妊娠失敗相關(guān)，IKCa1則參與細胞增殖的調(diào)控［16-17］。IKCa1可促進血管內(nèi)皮細胞增殖和血管生成［18］，血管生成即建立血竇與血管網(wǎng)絡系統(tǒng)，在胎盤形成之前，其為胚泡提供營養(yǎng)和輸送氧，以保證胚胎生存和成功妊娠［19-21］。因此筆者推測，IKCa1通道可能也與胚胎著床有一定關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜分泌中期IKCa1表達明顯升高，此期正處于圍著床期，提示IKCa1可能參與子宮內(nèi)膜著床窗的開放，有可能作為子宮內(nèi)膜容受性的潛在分子標志物，促使子宮內(nèi)膜達到容受態(tài)從而有利于胚胎黏附和植入。

胚胎著床時，胚胎外滋養(yǎng)層的細胞穿透子宮內(nèi)膜上皮細胞并侵襲入子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞，此時子宮內(nèi)膜上皮細胞遷移和轉(zhuǎn)化的生物學行為和腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移具有極大的相似性［22］。目前常利用人子宮內(nèi)膜癌細胞與人絨毛膜癌細胞模擬體外胚胎著床過程［23］。有研究發(fā)現(xiàn)EMT也參與了胚胎植入的調(diào)節(jié)，其誘發(fā)植入部位的子宮內(nèi)膜上皮細胞的運動和遷移，從而在胚胎到達之前使子宮內(nèi)膜獲得容受態(tài)［8］。本研究借鑒其實驗方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TRAM-34降低子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞IKCa1表達后，細胞的增殖能力降低，EMT過程受到抑制，對體外胚胎黏附能力降低，提示IKCa1通道可能通過EMT參與了胚胎植入的調(diào)節(jié)，發(fā)揮促進胚胎著床的作用。

綜上所述，IKCa1在子宮內(nèi)膜的表達呈周期性，在圍著床期高表達，有可能作為子宮內(nèi)膜容受性的潛在標志物。因此，體外受精-胚胎移植前檢測子宮內(nèi)膜IKCa1的表達量，以評估子宮內(nèi)膜的容受性，有助于提高胚胎移植成功率。