干擾素調節(jié)因子1通過調控細胞焦亡參與小鼠肝臟缺血再灌注損傷

劉鈺，王朝陽，李世朋，胡莎莎，楊爽，蔡金貞，張國梁△

肝缺血再灌注損傷（liver ischemia-reperfusion injury，LIRI）是肝臟切除、移植等手術過程中出現肝損傷和肝移植術后移植物功能障礙的主要原因［1］。了解LIRI的具體機制將有助于減少肝移植術后各種并發(fā)癥的發(fā)生，進一步改善患者的預后［2］。干擾素調節(jié)因子-1（interferon regulatory factor-1，IRF-1）參與調節(jié)對病原體和同種抗原的炎癥反應，已被證實參與了缺血再灌注（IR）損傷的發(fā)生［3］。腎小管急性IR損傷時IRF-1表達上調，進而激活促炎細胞因子和趨化因子的表達，引發(fā)一系列炎癥反應［3］。細胞焦亡作為一種程序性死亡形式越來越受到人們重視，其機制、形態(tài)學變化及生化特征均有別于其他死亡形式，主要表現為病原體刺激下激活半胱天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-1和Caspase-4/5/11，以及裂解gasdermin D（GSDMD）和促炎細胞因子的釋放［4］，同時伴有細胞腫脹，細胞膜孔形成［5］。目前IRF-1在LIRI中的研究尚少見報道。本文主要探討LIRI中IRF-1及細胞焦亡指標的變化，同時觀察敲低或過表達IRF-1對細胞焦亡的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 無特定病原體（SPF）級健康雄性C57BL/6小鼠24只，體質量（24±3）g，8~10周齡，購于北京華阜康生物科技股份有限公司。小鼠正常肝AML12細胞系購于中科院上海細胞庫。IRF-1小干擾RNA（siRNA）及陰性對照siRNA購于廣州銳博公司，IRF-1 siRNA靶序列：5'-CCAAGACATG?GAAGGCAAA-3'。過表達IRF-1腺病毒（IRF-1引物上游5'-ATGCCAATCACTCGAATGCG-3'，下 游5'-CTATGGTG?CACAAGGAATGGC-3'）及空載腺病毒購于漢恒生物。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購于美國Gibco公司。Caspase-1和Cleaved-Caspase-1抗體購于英國Abcam公司。兔抗鼠IRF-1、GSDMD一抗購于武漢ABclonal公司，GAPDH抗體購于武漢Elabscience公司，辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗購于美國CST公司。原位缺口末端標記（TUNEL）檢測試劑盒購自德國Roche公司。白細胞介素（IL）-1β酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購于聯科生物公司。乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性檢測試劑盒購于上海碧云天公司。細胞缺氧模型培養(yǎng)箱購于美國billups-rothenber公司，FACSCalibur流式細胞儀購于美國BD Biosciences公司。透射電子顯微鏡購于上海日立高新技術公司。

1.2 動物實驗

1.2.1 小鼠肝缺血再灌注模型建立及分組 依照參考文獻［6］建模。采用隨機數字表法將24只C57BL/6小鼠分為4組，分別為假手術（Sham）組，IR 2、6、12 h組，每組6只。術前8 h禁食，自由飲水。腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg），麻醉后經腹部正中切開約3 cm，暴露腹腔肝臟，IR 2、6、12 h組血管夾夾閉肝中葉、左葉脈管（門靜脈、動脈與膽道），實現70%肝臟缺血。缺血時觀察肝缺血葉（左、中葉）顏色是否變白，與肝右葉紅潤是否形成鮮明的對比。夾閉60 min后恢復血供，觀察肝缺血葉顏色是否恢復，再灌注時間依次為2、6、12 h。Sham組僅做開腹、游離第一肝門后關腹處理。

1.2.2 小鼠血清轉氨酶及IL-1β水平檢測 再灌注結束后經下腔靜脈取血1 mL，靜置1 h，4 000 r/min離心15 min，留取血清。采用動物專用全自動生化儀mindray BS-240VET（南京貝登醫(yī)療有限公司）檢測丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）水平，ELISA法檢測血清IL-1β水平。

1.2.3 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察肝組織病理變化 采血結束后處死小鼠，分離缺血側肝組織后放入4%多聚甲醛固定24 h，再經梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后以4μm厚度制成石蠟切片。常規(guī)HE染色后觀察肝臟病理學變化，并根據Suzuki’s評分［2］對結果進行評估。肝缺血再灌注損傷包括竇狀充血、肝細胞質空泡化、實質壞死。其中，充血或空泡化：無（0分）、輕微（1分）、輕度（2分）、中度（3分）、重度（4分）；壞死分級：無細胞壞死（0分）、單細胞壞死（1分）、＜30%壞死（2分）、30%~60%壞死（3分）、＞60%壞死（4分）。

1.2.4 免疫組織化學染色觀察肝臟IRF-1表達 肝組織石蠟切片脫蠟、水化，檸檬酸鈉進行抗原修復后在3%H2O2中孵育以封閉過氧化物酶。用IRF-1一抗（1∶200）于4℃孵育過夜，次日與HRP結合的二抗孵育后二氨基聯苯胺（DAB）顯色，鏡下觀察。

1.2.5 TUNEL染色檢測小鼠肝臟凋亡和焦亡變化 石蠟切片進行常規(guī)脫蠟、水化，蛋白酶K消化處理，滴加TUNEL反應混合液，置于濕盒內，37℃避光孵育60 min。滴加DAPI溶液染核2 min。在熒光顯微鏡下觀察并記錄組織切片肝細胞總數和TUNEL陽性細胞數。

1.2.6 透射電鏡察細胞形態(tài)變化 肝組織切片經2.5%戊二醛中固定后再經2%四氧化鋨二次固定，制成超薄切片并染色后用透射電鏡觀察細胞膜、核膜成孔和線粒體腫大現象。

1.2.7 Western blot檢測IRF-1、Caspase-1、Cleaved-Caspase-1及GSDMD蛋白表達 取20 mg肝組織置于200μL RIPA裂解液中勻漿處理，待充分其裂解后于4℃、4 000 r/min離心15 min，留取上清，BCA法測蛋白濃度。20μg/孔上樣行SDSPAGE，轉至PVDF膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加一抗（IRF-1、Caspase-1、Cleaved-Caspase-1、GSDMD、GAPDH，均為1∶1 000稀釋）于4℃孵育過夜，TBST洗膜后用HRP標記的羊抗兔二抗（1∶2 500稀釋）室溫孵育90 min，混合等體積化學發(fā)光液與PVDF膜反應，曝光顯影后記錄目的蛋白和內參蛋白的光密度（OD）值并計算相對表達量。

1.3 細胞實驗

1.3.1 AML12細胞缺氧復氧（模擬IR）模型的建立 將AML12細胞接種于6孔板，每孔細胞接種數量約為3×105個，待細胞密度達到50%時分為4組，分別為空載體+IR組（轉染空載腺病毒）、過表達IRF-1+IR組（轉染過表達IRF-1的腺病毒）、NC+IR組（轉染陰性對照siRNA）和IRF-1 siRNA+IR組（轉染沉默IRF-1表達的siRNA）。之后將細胞放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，移去培養(yǎng)基，換Hank’s液后放入缺氧箱模擬缺血缺氧處理，缺氧箱內O2體積分數＜1%。1 h后各孔換DMEM/F12培養(yǎng)基后繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h以模擬再灌注處理。

1.3.2 透射電鏡觀察AML12細胞形態(tài)學變化及Western blot檢測IRF-1、Caspase-1、Cleaved-Caspase-1及GSDMD蛋白的表達 4組細胞分組處理結束后分別按照1.2.6和1.2.7的方法觀察細胞形態(tài)變化和檢測相關蛋白表達。

1.3.3 流式細胞術檢測細胞焦亡 取NC+IR組與IRF-1 siRNA+IR組細胞（每組約1×106個細胞），預冷PBS洗滌后懸浮于1 mL結合緩沖液中。每組取100μL細胞，再分別加入5μL膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和碘化丙啶（PI）。室溫下避光孵育10 min后采用FACSCalibur流式細胞儀分析細胞焦亡變化。因細胞焦亡時，細胞膜上的氣孔打開，Annexin V-FITC進入細胞，與膜內磷脂酰絲氨酸結合染色，而PI也可通過氣孔進入焦亡細胞與DNA結合使其染色，故Annexin V-FITC/PI雙陽的晚期凋亡細胞也可認為是焦亡細胞。

1.3.4 酶標法檢測相對LDH釋放 在96孔板上設置NC+IR孔、IRF-1 siRNA+IR孔、樣品對照孔、背景空白對照孔及樣品最大酶活性對照孔。檢測前1 h，在樣品最大酶活性對照孔中加入LDH釋放試劑，反復吹打混勻并繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育。1 h后將96孔板以1 000 r/min離心2 min。各孔分別取等量上清液加入至新96孔板中，酶標儀檢測各組490 nm處的OD值，計算LDH相對釋放量，相對釋放量=（OD實驗組-對照組）/（OD最大酶活性組-對照組）。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 8.0.2進行統(tǒng)計學分析，Shapiro-Wilk test對數據進行正態(tài)性檢驗。符合正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 4組小鼠血清ALT、AST及IL-1β變化 與Sham組相比，IR各組血清ALT、AST水平均有明顯升高，IR2~12 h內隨時間延長升高，在12 h達到峰值（P＜0.05）。與Sham組相比，IR2 h組血清IL-1β水平差異無統(tǒng)計學意義，IR6 h和IR12 h組血清IL-1β水平高于Sham組，見表1。

Tab.1 Comparison of serum levels of ALT,AST and IL-1βbetween four groups of mice表1 各組小鼠血清ALT、AST和IL-1β水平比較（n=6，±s）

Tab.1 Comparison of serum levels of ALT,AST and IL-1βbetween four groups of mice表1 各組小鼠血清ALT、AST和IL-1β水平比較（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與IR2 h組比較，c與IR6 h組比較，P＜0.05

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2.2 4組小鼠肝臟病理改變 小鼠肝臟經IR處理后肝組織損傷明顯加重，與Sham組相比，IR各組肝板排列紊亂，肝細胞腫脹、片狀壞死，肝竇變窄，紅細胞淤積增多，隨再灌注時間延長（2~12 h）而損傷加重，見圖1。IR各組Suzuki’s評分均較Sham組升高，IR6 h、12 h組較2 h組也有明顯升高（P＜0.05），見圖2。

2.3 4組小鼠肝細胞IRF-1表達情況 免疫組化染色示IRF-1主要定位于細胞質，陽性細胞呈深棕色。Sham組未見IRF-1陽性細胞，IR2 h后可見少量陽性細胞，6 h后IRF-1陽性細胞數增多，呈現片狀深棕色染色，IR12 h后IRF-1陽性細胞有所減少，見圖3。

Fig.1 Changes of liver pathology in each group(HE staining,×200)圖1 各組小鼠肝臟病理學改變（HE染色，×200）

Fig.2 Comparison of liver Suzuki’s scores between the four groups圖2 4組小鼠肝臟Suzuki’s評分比較

Fig.3 Changes of IRF-1 expression in liver of mice in each group(immumohistochemical staining,×200)圖3 各組小鼠肝臟IRF-1表達變化（免疫組化染色，×200）

2.4 4組肝臟TUNEL陽性細胞數比較 與Sham組相比，小鼠肝臟細胞在IR過程中TUNEL陽性細胞數增加，在6 h內達到峰值（P＜0.05），見圖4、5。

2.5 肝組織和AML12細胞形態(tài)學變化 透射電鏡下可見，Sham組肝臟細胞形態(tài)大體正常，IR2~12 h后肝細胞均出現不同程度的核膜損傷和線粒體腫脹，見圖6。在AML12細胞中，與NC+IR組比較，IRF-1 siRNA+IR組細胞膜和核膜成孔或破裂減少，線粒體腫脹數量下降，細胞損傷減輕，見圖7。

Fig.4 Results of TUNEL staining of liver cells in each group(×200)圖4 各組小鼠肝臟細胞TUNEL染色結果（×200）

Fig.5 Comparison of liver apoptosis and pyroptosis cells of mice in each group（×200）圖5 各組小鼠肝臟細胞凋亡和焦亡率比較（×200）

2.6 小鼠肝組織與AML12細胞中IRF-1、Caspase-1和GSDMD蛋白表達情況 肝組織：與Sham組相比，IR6 h和12 h組IRF-1、Caspase-1和GSDMD表達均明顯升高（P＜0.05），見圖8、9。AML12細胞：過表達IRF-1+IR組與空載體+IR組相比，伴隨IRF-1的表達增高，GSDMD和Cleaved-Caspase-1也隨之明顯增高（均P＜0.05），見圖10、11。而敲低IRF-1表達后與對照組相比，Caspase-1和GSDMD蛋白表達均減少（均P＜0.05），見圖12、13。IRF-1可通過影響Caspase-1與GSDMD的表達和Cleaved-Caspase-1片段的生成調控焦亡。

2.7 沉默IRF-1表達后AML12細胞焦亡率和LDH釋放量變化 與NC+IR組相比，IRF-1 siRNA+IR組細胞焦亡率下降，LDH釋放量減少約20%，見圖14、表2。

Fig.6 Morphological changes of liver tissue in four groups under transmission electron microscope圖6 透射電鏡下4組小鼠肝組織形態(tài)變化

Fig.7 Morphological changes of AML12 cells in four groups observed under transmission electron microscopy圖7 透射電鏡下2組AML12細胞形態(tài)變化

Fig.8 The expressions of IRF-1,Caspase-1 and GSDMD in liver of mice detected by Western blot assay圖8 Western blot檢測各組小鼠肝臟IRF-1，Caspase-1和GSDMD表達

Fig.9 Comparison of IRF-1,Caspase-1 and GSDMD in liver of mice between the four groups圖9 各組小鼠肝臟IRF-1，Caspase-1和GSDMD表達比較

Fig.10 The expressions of IRF-1,Cleaved-Caspase-1 and GSDMD proteins in the overexpressed IRF-1+IR group and the vector+IR group圖10 Western blot檢測過表達IRF-1+IR組與空載體+IR組細胞IRF-1、Cleaved-Caspase-1和GSDMD表達

Fig.11 Comparison of IRF-1,Cleaved-Caspase-1 and GSDMD expression levels between the overexpressed IRF-1+IR group and vector+IR group圖11 過表達IRF-1+IR組與空載體+IR組細胞IRF-1、Cleaved-Caspase-1和GSDMD蛋白表達水平比較

Fig.12 The expressions of IRF-1,Caspase-1 and GSDMD proteins in the IRF-1 siRNA+IR group and NC+IR group圖12 Western blot檢測過表達IRF-1 siRNA+IR組與NC+IR組細胞IRF-1、Caspase-1和GSDMD表達

Fig.13 Comparison of IRF-1,Caspase-1 and GSDMD expressionlevels between the IRF-1 siRNA+IR group and NC+IR group圖13 IRF-1 siRNA+IR組與NC+IR組細胞IRF-1、Caspase-1和GSDMD蛋白表達水平比較

Fig.14 Flow cytometry of AML12 cells in IRF-1 siRNA+IR group and NC+IR group圖14 IRF-1 siRNA+IR組與NC+IR組的AML12細胞流式圖

Tab.2 Comparison of cell apoptosis rate and LDH relative release level between IRF-1 siRNA+IR group and NC+IR group表2 IRF-1 siRNA+IR組與NC+IR組細胞焦亡率和LDH相對釋放水平比較 （n=6，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

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3 討論

LIRI是肝切除、移植后供體肝功能障礙的主要原因［1］。LIRI過程中涉及的因素及機制包括細胞內鈣超載、氧化應激、線粒體、中性粒細胞和肝枯否細胞（KCs）、細胞因子和趨化因子等［7］。IRF-1作為一種轉錄調節(jié)因子在IR損傷過程中起到重要作用［7］。正常細胞中IRF-1處于低表達或無活性狀態(tài)，受到干擾素（IFN）刺激后表達增加，調控下游炎性細胞因子表達，還可抑制腫瘤形成和細胞生長［8-9］。本實驗證實小鼠肝臟IR模型中IRF-1表達增高，參與了下游炎性因子的產生。

焦亡是一種Caspase-1依賴性的細胞程序性死亡形式，其主要特點是快速的DNA片段化、細胞膜破裂和促炎因子的產生。經典通路中炎性小體的激活是重要的一步，其可激活Caspase-1，活化的Caspase-1可對GSDMD進行切割，形成的GSDMD-N端與細胞膜磷脂蛋白結合形成孔洞，還可將IL-1β和IL-18前體切割成有活性的IL-1β和IL-18，與其他促炎因子一起經孔洞釋放到胞外，造成炎癥反應［10-14］。本實驗結果顯示，與Sham組相比，小鼠IR6 h和12 h后肝臟IRF-1、Caspase-1和GSDMD蛋白表達明顯增高，血清ALT、AST和IL-1β水平也有顯著升高，同時TUNEL染色發(fā)現小鼠肝臟IR后損傷加重，細胞凋亡增多，同時伴有核膜成孔和線粒體腫脹，說明焦亡參與小鼠LIRI，促進炎癥反應，加重了肝臟損傷。

本研究發(fā)現小鼠肝臟IR 2~12 h后IRF-1、Caspase-1、GSDMD均有不同程度升高，表明這幾個指標可能存在關聯。有文獻報道IRF-1可通過激活Caspase-1促進腦脊髓炎（EAE）和多發(fā)性硬化癥（MS）中少突膠質細胞的焦亡［15］。另有研究證實Caspase-1基因含有IRF-1結合元件（IRE），IFN刺激少突膠質祖細胞后，如果缺少IRF-1的存在，無法激活Caspase-1［16］。而小鼠IRF-1基因敲除后能減弱Caspase-1激活和凋亡相關微粒蛋白（ASC）在內的焦亡小體的形成并減少下游高遷移率族蛋白1（HMGB1）、IL-1β釋放［17-19］。結合本研究結果，筆者推測肝組織缺血再灌注過程中IRF-1可能通過激活Caspase-1調控焦亡加重肝細胞損傷。

為驗證IRF-1是否對焦亡產生影響，在體外實驗中對AML12細胞感染空載腺病毒和過表達IRF-1的腺病毒后進行模擬小鼠肝臟缺血再灌注（缺氧復氧）處理，結果顯示過表達IRF-1后伴隨IRF-1的表達升高，GSDMD和Cleaved-Caspase-1也隨之增高，說明IRF-1表達增多后促使Caspase-1被切割，形成大量的Cleaved-Caspase-1片段，即IRF-1通過調控AML12細胞缺氧復氧過程中Caspase-1的激活影響細胞焦亡。

與此同時，本研究通過siRNA實驗發(fā)現，與NC+IR組相比，IRF-1 siRNA+IR組AML12細胞Caspase-1和GSDMD隨IRF-1表達下調也相應減少，細胞上清LDH的釋放量下降；同時流式結果顯示，伴隨IRF-1的下調，細胞焦亡率下降，形態(tài)學顯示細胞膜和核膜成孔減少，核膜完整性損傷減輕，線粒體腫脹數量減少，上述結果提示下調IRF-1表達能影響Caspase-1和GSDMD的表達，從而減少細胞膜的破裂或膜上氣孔的形成，減少細胞焦亡。

綜上所述，IRF-1可通過調節(jié)Caspase-1的轉錄或激活和GSDMD的表達以及IL-1β的釋放調控焦亡，進而參與小鼠LIRI，可能為減輕肝切除和移植過程中的損傷提供新的見解。